Содержание к диссертации
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава I. СТРУКТУРА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗ II
Четвертичная структура глутаминсинтетаз II
Аминокислотный состав глутаминсинтетаз 23
Вторичная структура глутаминсинтетаз 24
Глава 2. СТРУКТУРА АКТИВНОГО ЦЕНТРА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗ ... 26
Функциональные группы активного центра глутаминсинтетаз 28
Пространственная организация, локализация и число активных центров глутаминсинтетаз 40
Глава 3. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗ 47
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ 65
Объект исследования и условия выращивания опытного материала 65
Методы определения активности 65
а) гидроксаматный метод 65
б) фосфатный метод 66
Определение белка 66
Аналитический электрофорез в полиакриламидном геле 67
Метод скорости седиментации 67
Определение аминокислотного состава фермента ... 68
а) Гидролиз белка 68
б) Определение цистеина 68
Метод кругового дихроизма 69
Определение содержания двухвалентных металлов .... 72
Химическая модификация s Н-групп цистеина 72
Определение констант ионизации субстратсвязывающих групп на основе изучения влияния рН на К^ 75
Фотоокисление фермента в присутствии метиленового синего 78
Метод субстратной защиты фермента от ингибирования сульфгидрильными реагентами 78
Ингибирование глутаминсинтетазы метионинсульфокси-мином 79
Метод субстратной защиты глутаминсинтетазы от ингибирования метионинсульфоксимином 80
Метод субстратной защиты фермента от тепловой инактивации 80
Глава 5. ЕВДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ ЦИТОЗОЛЯ
И ХЛОРОІШАСТ0В ГОРОХА 81
Глава 6. (ЛРУКЇУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ
ЦИТОЗОЛЯ И ХЯ0Р0ПЛАСТ0В ГОРОХА 87
6.1. Определение аминокислотного состава глутаминсинтетазы
из цитозоля 87
Вторичная структура глутаминсинтетазы из хлоро-пластов гороха 88
Содержание металлов в молекуле глутаминсинтетазы
из хлоропластов гороха 88
Глава 7. КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ
ЦИТОЗОЛЯ И ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА 91
Глава 8. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУШИ АКТИВНОГО ЦЕНТРА ГЛУТАМИН
СИНТЕТАЗЫ ЦИТОЗОЛЯ И ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА 99
_ 4 -
Химическая модификация SH-групп цистеина сульфгид-рильными реагентами 99
Определение констант ионизации субстратсвязывающих групп на основе изучения влияния рН на К^ 105
Защитное действие субстратов и кофакторов от инги-бирования глутаминсинтетазы из цитозоля и хлоро-пластов гороха сульфгидрильными реагентами 117
Глава 9. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ ИЗ ЦИТОЗОМ
И ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА 126
Изучение механизма действия глутаминсинтетазы из цитозоля и хлоропластов гороха с использованием специфического ингибитора - метионинсульфоксимина 126
Изучение механизма действия глутаминсинтетазы из цитозоля и хлоропластов гороха методом стационарной кинетики 136
Защитное действие субстратов и кофактора от тепловой инактивации глутаминсинтетазы из
цитозоля и хлоропластов гороха 138
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 145
ВЫВОДЫ 152
ШИООК ЛИТЕРА№Ы 154
- 5 -ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ГСдд - глутаминсинтетаза цитозоля
TGXJl - глутаминсинтетаза хлоропластов
ГСТ - глутаматсинтаза
НДЦ - никотинамидадениндинуклеотид
АМФ - аденозинмонофосфат
АДФ - аденозиндифосфат
АЇФ - аденозинтрифосфат
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
Фн - неорганический фосфат
J-ІГК - ї-глутамилгидроксамовая кислота К^ - константа Михаэлиса Глу - глутаминовая кислота Глн - глутамин п-ЖБ - п-хлормеркурибензоат п-ОМБ - п-гидроксимеркурибензоат
рКе- константа ионизапии группы, связывающей субстрат рК - константа ионизапии субстрата
рК - константа ионизации фермент-субстратного комплекса реагент Эллмана - 5,5 -дитиобис-(2-нитробензойная) кислота К. - константа ингибирования
Введение к работе
Растительные организмы обладают уникальной способностью усваивать неорганические формы азота и использовать их для синтеза аминокислот и белка, В настоящее время проблема растительного белка и исследование процессов, лежащих в основе его синтеза приобретает особую актуальность в связи с задачами, поставленными партией перед народом по выполнению Продовольственной программы.
Растительный мир является основным источником кормового и пищевого белка на нашей планете. Главным условием, необходимым для синтеза белка, является обеспечение растений азотом. Именно этим определяется вся теоретическая и практическая важность исследования ферментативных процессов, лежащих в основе усвоения неорганических форм азота растениями Дретович, 1971,1972/.
В своих классических исследованиях Прянишников /Прянишников, 1945/ подчеркивал, что процессы образования азотсодержащих органических соединений в растениях при питании любыми формами азота сводятся, в конечном счете, к ассимиляции аммиака. Так, нитраты и нитриты, составляющие большую часть потребляемого растениями неорганического азота, восстанавливаются до аммиака под действием ферментов нитратредуктазы и нитритредуктазы. Атмосферный азот, фиксированный клубеньками симбиотрофных растений, также восстанавливается нитрогеназой до аммиака, который поступает в ткани растения-хозяина, где и происходит его ассимиляция.
Работами ряда исследователей Дретович и соавт.,1964; Евстигнеева и соавт.,1970/ установлено, что одним из первых продуктов усвоения аммиака в растительной клетке является глутамин, реакцию образования которого катализирует фермент глутаминсинтетаза /ГС; К.Ф.6.3.1.2/.
Известно, что глутамин является центральным метаболитом и ис-
- 7 -точником азота для биосинтеза многих аминокислот, нуклеотидов, глюкозамина, карбамоилфосфата, НАД и других соединений.
Глутамин, образующийся под действием ГС, служит субстратом для образования глутаминовой кислоты в реакции, катализируемой глутаматсинтазой / Miflin, Lea ,1976,1977; ГСТ, К.Ф. 1*4.1.13; 1.4.7.1/. По современным представлениям реакции усвоения аммиака, последовательно катализируемые ГС и ГСТ, являются главным путем ассимиляции неорганического азота в растениях.
Б связи с этим закономерно, что ГС различных организмов является аллостерическим ферментом и подвергается строгому и многообразному контролю метаболитами клетки / Holzer et al ,1967; Кретович и соавт.,1976; Евстигнеева и соавт.,1974/.
В настоящее время установлено, что ГС сама выступает у ряда организмов в качестве индуктора и репрессора синтеза некоторых ферментов, в частности, нитрогеназы /streicher et al ,1974/ и глутаматдегидрогеназы / Magasanik ,1977/.
В связи с этим изучение различных уровней структурной организации ГС, ее активного центра и механизма действия имеет значение не только для понимания процесса синтеза глутамина, но и дает возможность разобраться в ряде сложнейших реакций азотного метаболизма, протекающих в клетке.
Имееется ряд исследований, касающихся четвертичной структуры /Tsuprmi et al ,1980; Кретович и соавт.,1983/, а также регуля-торных СВОЙСТВ ГС ВЫСШИХ растений / Marai et al ,1979; Hirel, Gadal ,1980; Кретович ,1983/, В то же время данных о структуре активного центра и механизме действия ГС растительных организмов, роль которых в усвоении неорганического азота отмечалась выше, в настоящее время совершенно недостаточно.
Прямые данные о функциональных группах активного центра ГС
- 8 -имеются только для ГС мозга свиньи / Schnackerz, Jaenlcke, 1966/ и хлореллы /асулов и соавт.,1978/.
Данные о функциональных группах активного центра ГС высших растений в литературе практически отсутствуют.
В противоположность необычайной скудности данных по изучению функциональных группировок в активном центре ГС, в настоящее время имеется значительное количество работ по механизму действия данного фермента, правда, главным образом, у бактерий. Следует подчеркнуть, что механизм действия ГС пока еще не может считаться окончательно выясненным. Ранние исследования механизма действия ГС с применением различных аналогов глутамата показали, что реакция синтеза глутамина протекает с образованием промежуточного соединения ( Х-глутамилфосфата) по так называемому "ступенчатому" механизму/ Meister et al ,1962; Ronzio, Rowe ,1969 а,б,в; Weisbrod, Meister ,1978/. Применение методов изотопного обмена и стационарной кинетики для изучения механизма действия ГС позволило выдвинуть предположение о согласованном механизме реакции, без образования jj-глутамилфосфата/ Wedler et al ,I972;I974a/.
Б настоящее время существует мнение, что в процессе реакции синтеза глутамина образуется fl-глутамилфосфат, однако, все субстраты должны присоединиться к ферменту, прежде чем активный центр станет способным к функционированию/ Midelfort, Rose » 1976; Jaenicke, Jesior ,1978; Meek, Villifranca ,1980; Wedler et al ,1980/. Порядок связывания субстратов на активном центре фермента, выделенного из различных источников различен /Wedler et al ,1974; Wedler, Horn ,1976,1980/.
Б литературе имеется довольно большое количество работ, в которых приведены кинетические характеристики ГС бактериального и животного происхождения.
_ 9 -
Что касается ГС высших растений, то их кинетические свойства изучены в значительно меньшей степени. Необходимо отметить, что одним из возможных подходов при выяснении механизма ферментативного процесса, наряду с изучением функциональных групп активного центра является сравнение данных кинетических исследований с результатами, полученными при изучении структуры фермента.
В настоящее время в литературе имеется большое количество работ, касающихся двух форм ГС в листьях высших растений, одна из которых локализована в цитоплазме, а другая в хлоропластах клеток листа /Евстигнеева и соавт.,1977; Джохаридзе и соавт.,1979; Maim et al ,1979; Hirel, Gadal ,1980; Winter et al ,1982; Ahmad et al ,1982/. Исследование четвертичной структуры этих форм показало, что они имеют одинаковый тип структуры / Tsuprun et al, 1980; Евстигнеева и соавт.,1979; Кретович, 1983/. Вместе с тем, применение специфических ингибиторов синтеза белка /Евстигнеева и соавт.,1977/ и исследование иммунохимического поведения ГС цито-золя и ГС хлоропластов / Мс Ually ,1983; Антонюк и соавт.,1984/ показало, что данные ферменты являются изоферментами и кодируются разными генами. Цитозольная ГС кодируется ядерной ДНК, а синтез хлоропластной ГС происходит на ДНК хлоропластов.
Необходимо отметить, что наряду с большим числом работ о множественных формах ГС в листьях высших растений, в настоящее время в литературе совершенно отсутствуют данные о структуре активного центра ГС цитозоля и хлоропластов, особенностях их механизма действия.
Основываясь на этом, мы выбрали в качестве объекта исследования изоферменты ГС листьев гороха: ГС цитозоля (цл) и ГС хлоропластов (хл).
В связи с вышесказанным в задачи данного исследования входит:
Получение в гомогенном состоянии TCLjj и ГС^д листьев гороха.
Исследование аминокислотного состава ГСцд и вторичной структуры ГС^ для сравнения структурной организации ГСцд и ГСХЛ гороха.
Изучение кинетических характеристик ГСцд и ГС^ гороха.
Изучение структуры активного центра ГС^ и ТСХЛ гороха с помощью следующих методов: химической модификации s Н-групп цистеина, определения рКе субстратсвязывающих групп, субстратной защиты фермента от ингибирования сульфгидрильными реагентами.
Изучение механизма действия Т0т и ГС^ гороха с помощью следующих методов: метода стационарной кинетики, использования специфического ингибитора ГС - метионинсульфоксимина, субстратной защиты фермента от ингибирования данным реагентом, а также защитного действия субстратов от тепловой инактивации.
- II -
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава I. СТРУКТУРА И КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГЛУТІШІИНСИНТЕТАЗ.
В настоящее время установлено, что структура играет фундаментальную роль в каталитической активности фермента. Она не только определяет форму молекул фермента в целом, но и формирует активный центр из химических групп и обеспечивает правильную его ориентацию в пространстве, определяя тем самым специфичность фермента. Одним из подходов при выяснении механизма действия фермента является сопоставление структуры фермента с его кинетическими характеристиками.
Информация, имеющаяся в настоящее время, свидетельствует о том, что глутаминсинтетазы, выделенные из разных организмов, различаются по своей структуре и кинетическим характеристикам. I.I. Четвертичная структура глутаминсинтетаз
По особенностям четвертичной структуры все глутаминсинтетазы можно разделить на три основных типа: I) "бактериальный", 2) "животный" и 3) "хлорелльный" Дретович, 1983/.
К первому типу относятся бактериальные глутаминсинтетазы (из E.coli, B.subtilis, Azotobacter vineiandii и др.). "Бактериальный" фермент имеет молекулярную массу 600 000-700 000 и состоит из 12 идентичных мономеров с молекулярной массой 50 000-60 000, расположенных с точечной группой симметрии 62 в виде двух, лежащих точно одно под другим, гексагональных колец.
Среди ГС "бактериального" типа наиболее изученной является ГС Е. coli . Фермент очищен до гомогенного состояния и получен в кристаллическом виде /Woolfoik ,1966/. ГСЕ. coli имеет молекулярную массу 592 000 и состоит из 12-ти идентичных мономеров с молекулярной массой 50 000 /Shapiro, Stadtman ,1967; Valentine et al ,1968; Eisenberg et al ,19^/. Методом оптической диф-
- 12 -фракции установлена пространственная структура этого фермента. ГСЕ.соїі способна полимеризоваться в присутствии Со с образованием трубок, которые объединяются в пучки / Prey et al ,1975/.
Кинетические исследования ГС Е. coli показывают, что комплексы Mg2+ -А1Ф и Mn + -АЇФ являются каталитически активными субстратами для данного фермента. К^ для этих комплексов одинакова и равна 0,16 Ш / Woolfolk ,1966; Denton, Ginsburg ,1970/.
Величины 1^ для L-глутамата, АТФ и аммония в присутствии Mg2+ составляют 2,4; 0,68 и 1,8 мМ, а в присутствии Мп2+ 3,4; 0,36 и 2,7 мМ, соответственно / Woolfolk ,1966/. Для ГС Е. coli наблюдается отрицательная кооперативность при связывании аммония на ферменте / Meek, Viliifranca ,1980/. Это свидетельствует о взаимодействиях между каталитическими центрами субъединиц.
"Бактериальный" тип структуры характерен также для ГС Б. sub-
tilis / Deuel, Stadtman ,1970; Deuel ,1971/, В. stearother-
mophilus / Wedler, Hoffman ,1974; Hachimori et al ,1974,
1975/, B. licheniformis /Hubbard, Stadtman ,1967/.
Молекулярная масса нативной ГС В. subtilis равна 600 000, молекулярная масса мономеров - 50 000. Детальные электронно-микроскопические исследования показали, что ГС В. subtilis , подобно ГС Е. coli , состоит из 12-ти идентичных субъединиц, расположенных в виде параллельных гексагональных колец одно над другим. Это соответствует структуре с точечной группой симметрии 62 / Deuel , 1971/. Однако, в отличие от ГС E.coli ГС В. subtilis характеризуется более плотной упаковкой субъединиц в олигомере.
При исследовании кинетических характеристик ГС В.subtilis установлено, что АТФ связывается на ферменте в виде комплекса Mn2+ -АТ. Kj^ для Мп2+ -А1Ф составляет 0,2 мМ / Deuel,Stadtman, 1970/. Авторы показали, что связывание Мп2+-АТФ на ГС В.sub-
- ІЗ -
tilis является кооперативным процессом. Предполагается, что связывание комплекса Мп2+-АТФ на ферменте может раскрывать или разрыхлять структуру белка, облегчая связывание других субстратов на каталитических центрах. Наблюдаемая различная степень коопера-тивности при различной температуре (37 и 25) указывает на то, что температура может контролировать конформационную гибкость этого фермента.
Подробно изучены структура и кинетические характеристики ГС ИЗ В. stearothermophilus / Wedler, Hoffman ,1974; Hachimori
et al ,1974,1975; Matsunaga, Nosoh ,1974; Hachimori et al,
1975; Wedler et al , 1976a/.
Из клеток В. stearothermophilus получен гомогенный препарат ГС с молекулярной массой 630 000. Молекулярная масса мономеров равна 51 000. Электронно-микроскопические исследования показали, что аналогично ферментам из E.coli и B.subtilis , молекула ГС В.stearothermophilus состоит из 12-ти субъединиц, расположенных в виде двух гексагональных колец с точечной группой симметрии 62.
Кинетические константы ГС В. stearothermophilus (К^ для суб
стратов) зависят от используемого катиона, что также характерно
для ГС E.coli . Величины К^ для Ь-глутамата, аммония и АТФ в
присутствии Mg2+ равны 8,3; 0,67 и 3,3 мМ, а в присутствии Мп2+
2,0; 0,15 и 3,5 мМ, соответственно. В отличие от ГС E.coli ГС
В. stearothermophilus обладает знанительно большим сродством
к аммонию, чем к АТФ.
Установлено, что АТФ связывается на ферменте в виде комплекса
2+
Ме^т -АТФ, что также характерно для других бактериальных ГС. Изучение зависимости степени насыщения фермента от концентрации субстрата показало, что аммоний и глутамат имеют гиперболические кри-
- 14 -вые насыщения, тогда как для АТФ наблюдается отклонение от равнобочной гиперболы, что свидетельствует о кооперативности связывания. Исследование зависимости активности ГС В.stearothermophilus от концентрации Мп2+ -АТФ также показало, что связывание Мп +-АТФ с ферментом является кооперативным процессом. Это предполагает существование кооперативных субъединичных взаимодействий и указывает на многообразие конформационных состояний фермента.
Хьюбард и Стэдман / Hubbard, Stadtman ,1967/ выделили из клеток B.licheniformis ГС с молекулярной массой 612 000. К^. для L-глутамата, аммония и Мп2+-АТФ составляет 3,6; 0,4 и 0,9 мМ, соответственно. Данные по структуре ГС В. licheniformie в литературе отсутствуют. Однако, можно предположить, что данный фермент также как и другие бактериальные ГС состоит из 12-ти субъединиц.
Такой же тип четвертичной структуры имеет ГС Azotobacter
vinelandii / Kleinschmidt, Kleiner ,1978/ и азотфиксирующих
щанобактерий Anabaena cylindrica и Nostoc sp. / Sampaio,
Rowell, Stewart ,1979; Sawhney, Mcholds ,1978/. ГС Azoto-
bacter vinelandii очищена до гомогенного состояния. Молеку
лярная масса нативного фермента равна 640 000, а молекулярная мас
са мономеров 53 000. Анализ четвертичной структуры показал, что
большийство молекул фермента состоит из 12-ти идентичных субъеди
ниц. Однако, были найдены активные олигомеры, состоявшие из 8, 10
и 24 субъединиц. Интересно отметить, что ГС A. vinelandii /Klein-
schmidt, Kleiner ,1978/ находится в связанном с плазматиче-
ской мембраной состоянии.
Величины K^ для L -глутамата, аммония и АФБ в присутствии Mg2+ равны 1,1; 0,45 и 2,2 мМ, а в присутствии Со2+ - 2,7; 1,6 и 1,3 мМ, соответственно / Lepo et al ,1982/. Следует подчеркнуть, что ГС A. vinelandii обладает значительным сродством к
аммонию, что также характерно для ГС В. stearothermophilus и В. licheniformis.
ГС, выделенные из азотфиксирующих цианобактерий A. cylindrica и Host ос sp. , имеют молекулярную массу олигомера 660 000 и 630 000, и молекулярную массу мономеров - 49 000 и 50 000, соответственно / Sampaio et al ,1979/.
Электронно-микроскопические исследования показали, что ГС цианобактерий состоят из 12-ти субъединиц, подобно ГС E.eoli , В. subtilis , В. stearothermophilus.
ГС цианобактерий A. cylindrica имеет К^ для L-глутамата, АІФ и аммония равные 2,1; 0,32 и 0,02 мМ, соответственно /Огг, Haselkorn ,1981/. Следует отметить, что среди всех бактериальных ГС данный фермент обладает самым высоким сродством к аммонию.
Таким образом, все рассмотренные выше ферменты имеют близкую молекулярную массу и единый тип структурной организации белковой молекулы. Однако, ГС "бактериального" типа отличаются между собой различной формой, размерами и упаковкой субъединиц. Вероятно,этим объясняются и различия в кинетических свойствах ГС бактерий.
Таким же типом четвертичной структуры, т.е. так называемым бактериальным, характеризуется ГС, выделенная из пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Mitchell, Magasanik ,1983/,
являющихся микроорганизмом эукариотического типа. Установлено, что ГС Sacch.cerevisiae состоит из 10-12 идентичных субъединиц. Молекулярные массы олигомера и мономера равны 470 000 и 43 000, соответственно. Код для L -глутамата и АТФ составляет 6,5 и 1,ЗмМ, соответственно.
Большая серия работ выполнена по изучению структуры ГС кормовых дрожжей Candida ufilis / Ferguson, Sims ,1971,1974; Sims, Toone, Box ,1974/.
Симсом и соавт. показано / Sims, Toone, Box ,1974/, что фермент кормовых дрожжей является октамерным белком, состоящим из двух слабо связанных половин молекулы. Для ГС Candida utilis молекулярные массы олигомера и мономера равны соответственно 390 000 и 45 000.
Таким образом, ГС кормовых дрожжей по сравнению с ГС пекарских дрожжей имеет другой тип структурной организации и относится к так называемому "животному" типу структуры, к рассмотрению которого мы переходим ниже.
В литературе имеется довольно обширный материал по структуре и кинетическим характеристикам ГС, выделенных из животных организмов .
ГС "животного"типа имеет молекулярную массу 340 000-400 000 и состоит из 8 идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 42 по вершинам куба.
Из мозга свиньи выделена и получена в гомогенном состоянии ГС, молекулярная масса которой равна 370 000 /Stahl, Jaenicke, 1972/. Эта ГС состоит из 8 идентичных мономеров с молекулярной массой 46 000.
При низкой ионной силе в присутствии 2 М мочевины ГС диссоциирует на тетрамеры с молекулярной массой 185 000, не обладающие активностью.
Кинетические исследования показали, что АІФ связывается на ферменте в виде комплекса Mg + -А1Ф /Jaenieke, Jesior ,1978/.
К "животному" типу структуры относится структура ГС, выделенной из мозга овцы /Wilk et al ,1969/. Однако, данный фермент характеризуется более высокой молекулярной массой олигомера и мономеров, равной 525 000 и 65 000, соответственно. Авторы полагают, что остатки тирозина играют существенную роль в поддержании струк-
о.
турной целостности фермента. Интересно отметить, что Mg и АТФ в эквивалентных количествах сообщают дополнительную устойчивость структуре ГС и защищают фермент от диссоциации / Wilk et al , 1969,1970/. Величины К^ для этой ГС по отношению к L -глутамату, аммонию и АТФ в присутствии 1%2+ равны 2,5; 0,18 и 2,3 мМ, соответственно / Wedler et al ,1982 а,б/. Максимальная активность ГС наблюдается при соотношении [iag2+J : [ш] = 2 : I и |ма2+]: 1№J = 1:1. Эти данные авторы объясняют образованием субъединичного комплекса щ2+ -ГО- Mg2+-AT$, который обладает оптимальной актив-ностыо ГС в присутствии %2+ . С ионами ш2+ оптимальная активность ГС выявляется в комплексе ГС- Мп2+-АТФ или в комплексе ш2+ -ГО ш2+-А1Ф. Методом ЭПР установлено, что на каждый моль октамера ГС при связывании приходится 4 моля Мп +.
Тейт и Майстер / Tate, Meister ,1971,1972/ выделили и очистили до гомогенного состояния ГС печени крысы. Молекулярная масса данного фермента идентична молекулярной массе ГС мозга свиньи и равна 352 000, молекулярная масса мономеров составляет 44 000. ГС печени крысы состоит из 8 субъединиц. Авторы высказывают предположение, что ГС печени крысы состоит из неидентичных субъединиц. Это предположение экспериментально не доказано, но оно представляет интерес, поскольку высказано впервые.
ГС печени крысы похожа на ГС мозга овцы по субстратной специфичности и кинетическим характеристикам. Величины И^ для ь-глу-тамата, аммония и АТФ равны 2,5; 3,0 и 2,0 мМ, соответственно /cimino et al ,1983/. Однако, ГС печени крысы обладает более низким сродством к аммонию в отличие от ГС мозга овпы.
Очень подробно изучены структура и свойства ГС, выделенной из гомогенатов культуры ткани китайского хомячка /Tiemeier, Milman ,1972/. Молекулярная масса ГС равна 335 000, молекуляр-
ная масса мономеров - 42 000. Электронно-микроскопические исследования показали, что фермент состоит из 8 идентичных субъединиц, расположенных с точечной группой симметрии 42. ГС из культуры ткани китайского хомячка отличается от других животных ГС более низкой молекулярной массой. Величины "К^ для L -глутамата, аммония и АТФ равны 3,1; 0,16 и 1,2 мМ, соответственно. Показано, что АЗФ связывается на ферменте в виде комплекса Mg2+ -А!Ш.
Таким образом, ГС животных, несмотря на единый тип структурной организации, "животный" тип, имеют различные кинетические характеристики в зависимости от вида животной ткани.
Вероятно, различия в сродстве по отношению к субстратам отражают вариации в первичной структуре ферментов, выделенных из различных тканей, поскольку показано различие в их аминокислотном составе (см.разд. 1.2).
ГС высших растений изучена в меньшей степени по сравнению с ГС из микроорганизмов и животных. ГС растительного происхождения, также как ГС животных и дрожжей С. utilis по особенностям четвертичной структуры относится ко второму типу.
Впервые среди растительных ГС наиболее полно изучены структура и свойства ГС из листьев и корней тыквы /Цжохаридзе и соавт., 1979; Евстигнеева и соавт.,1979/, семян и листьев гороха /Elliott ,1953; Пушкин и соавт.,1975; Евстигнеева и соавт., 1977; O'Neal, Joy ,1975/.
На основании данных о наличии многочисленных молекулярных форм ГС в листьях высших растений /Цжохаридзе и соавт.,1979; Евстигнеева и соавт.,1977/ получены гомогенные препараты ГС цитозо-ля и хлоропластов листьев гороха и тыквы /Евстигнеева и соавт., 1979; Кретович и соавт.,1983/.
Молекулярная масса этих ферментов находится в пределах
- 19 -370 000 - 520 000, а молекулярная масса мономеров 50 000 - 64 000.
Кинетические характеристики исследованы для ГС семян гороха и ГС листьев и корней тыквы. Величины Kj^ для ГС семян гороха в отношении l -глутамата, аммония и АЇФ равны 14; 0,04 и 1,1 мМ, соответственно. Максимальная активность фермента наблюдается при соотношении [ig2+]: [атф1= 5:1. Кривые зависимости активности ГС
2 +
от концентрации Mg имеют сигмоидный вид, что свидетельствует о наличии положительной кооперативности при взаимодействии Mg + с исследуемой ГС.
При насыщении ГС семян гороха аммонием в смеси с Ш2+ наблю-дается отрицательная кооперативность.
Для ГС корней тыквы 1^ в отношении L -глутамата, аммония и АТФ равны 6,2; 0,36 и 0,4 мМ. Максимальная активность фермента проявляется при соотношении \м +] : [АТФ] =3:1.
ГС хлоропластов листьев тыквы, подобно ГС семян гороха, характеризуется низким сродством к ь-глутамату, К^ равна 46 мМ. Другие кинетические характеристики не изучены.
Электронно-микроскопическими исследованиями установлено, что изоферменты ГС листьев и корней тыквы, листьев и семян гороха состоят из 8 идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 42 по вершинам двух квадратов, повернутых вокруг общей оси четвертого порядка. ГС семян гороха отличается от других растительных ГС наличием значительной внутренней полости и иной формой мономеров. ГС хлоропластов гороха имеет несколько удлиненную форму мономеров по сравнению с другими ГС. Кроме того, мономеры этих ферментов расположены не строго один над другим, что характерно для ГС "животного" типа, а повернуты вокруг общей оси четвертого порядка в различной степени. Показано, что эти изоферменты имеют определенные различия в аминокислотном составе и вто-
- 20 -ричной структуре /Евстигнеева и соавт.,1977; Антонюк и соавт., 1983, 1984/.
Интересен вопрос о структуре ГС плесневого гриба Neurospora crassa . Первые исследования по четвертичной структуре ГС u.cras-sa обнаружили, что под влиянием возрастающих концентраций мочевины фермент диссоциирует с образованием промежуточных форм: тримера, димера и четырех мономеров с молекулярной массой 90 000 каждый. Димер имеет молекулярную массу 180 000 и обладает каталитической активностью / Kapoor et al ,1969; Ward, Кароог ,1971/. На основании этих данных было выдвинуто предположение, что ГС N.crassa является тетрамером.
Однако Палациос и сотр./ Palacios et al ,1976/ показали, что ГС н.crassa имеет молекулярную массу 385 000, а молекулярная масса мономеров равна 47 000. На основании данных электронной микроскопии был сделан вывод, что нативный фермент является окта-мером, состоящим из идентичных мономеров.
В последующих работах теми же авторами / Palacios, Mora , 1978/ получены новые результаты, заставившие расширить ранее выдвинутое предположение о четвертичной структуре этого фермента. В диком штамме п.crassa было обнаружено присутствие нескольких форм ГС : октамера, тетрамера и димера. Яри этом выявлено, что в диком штамме преобладает октамер, а в случае мутанта-тетрамер, причем довольно часто встречается и димер.
Опытами по иммунопреципитации показано, что как тетрамер, так и октамер состоят из мономеров двух видов - аС и р . Причем, тетрамерная форма состоит из d -мономеров и незначительного количества ^-мономеров, а октамерная из /-мономеров и незначительного количества U -мономеров / Sanckez et al ,1980/. Таким образом, в настоящее время имеются данные о наличии не-
идентичных мономеров в молекуле ГС H.crassa и ГС печени крысы. Но для большинства изученных ГС показано, что они состоят из идентичных мономеров.
Значительный интерес представляет изучение структуры ГС корневых клубеньков бобовых растений, поскольку основным источником азота для них является аммиак, образующийся в процессе азотфикса-ции. Имеются три работы, посвященные изучению структуры ГС корневых клубеньков сои, люцерны и люпина. Так, показано, что ГС корневых клубеньков сои /Мс Pariand ,1976/ состоит из 8 идентичных субъединиц, которые образуют структуру куба с точечной группой симметрии 42. Молекулярная масса нативного фермента равна 376 000, молекулярная масса мономеров 46 000. В присутствии 10 мМ ЭДТА ГС распадается на мономеры. Исходя из этого, авторы предпо-
2 + 2 +
латают, что ионы Щ т и ш играют значительную роль в поддержании четвертичной структуры фермента.
Аналогичный тип структуры имеет ГС растительной фракции клубеньков люпина / Мс Cormack et al ,1982/. Фермент имеет молекулярную массу 358 000 и состоит из 8 идентичных мономеров с молекулярной массой 44 700.
Величины К^ для L-глутамата, аммония и АТО равны 4,1;0Д6
и 0,24 мМ, соответственно. При кинетическом исследовании установок, лено, что АТО связывается на ферменте в виде комплекса Мє -АТО.
Необычную структуру имеет ГС, выделенная из азотфиксирующих клубеньков люцерны /Medicago sativa L. / / Groat, Schrader ,1982/. ГС клубеньков люцерны очищена до гомогенного состояния и представлена двумя основными полипептидами с молекулярной массой 40 000 и 45 000. Авторы предполагают, что нативная ГС клубеньков люцерны состоит из двух основных субъединиц.
В работах на корневых клубеньках сои, люпина и люцерны не бы-
- 22 -ло проведено фракционирование клубеньков на растительную и бакте-роидную часть. Но поскольку активность ГС цитозоля растительных клеток клубенька значительно выше, чем активность ГС бактероидов, полученные этими авторами данные можно рассматривать как относящиеся именно к растительной ГС корней этих растений.
Таким образом, рассмотренные ГС корневых клубеньков трех видов растений, хотя этот орган является еимбиотрофной азотфиксиру-ющей системой, относятся по своей четвертичной структуре к так называемому "животному" типу, свойственному и ГС высших растений, как показали в группе Евстигнеевой в лаборатории Кретовича Дрето-вич и соав.,1983/.
ГС хлореллы представляет собой третий тип структурной организации, по сравнению с известными по этого времени, "бактериальным" и "животным". Фермент имеет молекулярную массу 320 000 и состоит из 6 идентичных мономеров, расположенных с точечной группой симметрии 32 по вершинам антипараллельной призмы /Расулов и соавт., 1977/.
Кинетические характеристики ГС хлореллы, подобно ГС бактерий, зависят от используемого катиона. В присутствии %2+ К^ для L -глутамата, аммония и комплекса Mg2+ -АТФ равны 8,0; 0,25 и 2,0мМ, а в присутствии Мп2+ - 6,0; 0,5 и 1,0 мМ, соответственно /Акимова и соавт. ,1976/. Кривые зависимости активности ГС от концентраций Mg2+ и Мп2+ имеют сигмоидный вид. Это свидетельствует о кооперативном связывании 1% и Мп +с ГС хлореллы, что предполагает существование межсубъединичных взаимодействий.
Таким образом, ГС хлореллы отличается от ГС первого и второго типа отсутствием двуслойности и более плотной упаковкой мономеров в олигомере, а также меньшей молекулярной массой и меньшим числом мономеров.
- 23 -1.2. Аминокислотный состав глутаминсинтетаз
В литературе имеются многочисленные данные по аминокислотному
составу различных ГС / Deuel ,1970; Hachimori et al ,1974; Stahl,
Jaenicke ,І9*Я2; Расулов,І977; Кретович,І983/.
Результаты исследований свидетельствуют о том, что ГС бактерий близки по аминокислотному составу между собой и характеризуются высоким содержанием диаминомонокарбоновых кислот (аргинина, лизина) и низким содержанием цистеина / Shapiro, stadtman ,1967; Hachimori et al ,1974; Deuel ,1970/.
ГС, выделенные из животных тканей значительно отличаются по аминокислотному составу от ГС бактерий. Характерной особенностью ГС животного происхождения является высокое содержание пистеина ( до 12 цистеиновых остатков на мономер) / stahl, Jaenicke ,1972; Wilk et al ,1969/.
ГС растительного происхождения отличаются от других ГС высоким содержанием моноаминодикарбоновых аминокислот (аспарагиновой,глу-таминовой) и моноаминомонокарбоновых (глицина, серина). Для ГС высших растений характерно самое высокое содержание цистеина (до 23 остатков на мономер) /Цжохаридзе,1979; Кретович,1983/.
Исследование аминокислотного состава ГС хлореллы показало, что данный фермент отличается высоким содержанием гистидина, глутамино-вой кислоты и низким содержанием цистеина, пролина, лейцина /3?асу-лов,1977/.
Таким образом, чем ближе организмы друг к другу в эволюционном отношении, тем более сходный аминокислотный состав имеют их ГС.
В настоящее время первичная структура ГС не изучена. Имеются лишь данные о последовательности аминокислот на С- и и -концах ГСЕ.соїі И ГС В. subtilis / Kingdon et al ,1972; Hsu et al, 1977/. Для двух бактериальных ГС имеются данные о ж -концевых ами-
- 24 -нокислотах, а именно, серии - у ГС Е. coli, аланин - у ГС В. sub-tilis / Kingdon et al,I972; Hsu et al ,1977/. (ЮОН-концевой аминокислотой ГС E. coli является валин / Kingdon et al ,1972/. В то же время для ряда растительных ГС показано, что к-концевой аминокислотой является глицин /Евстигнеева и соавт.,1979; Джоха-ридзе и соавт.,1979; Кретович,1983/. 1.3. Вторичная структура глутаминсинтетаз
В настоящее время в литературе имеются немногочисленные работы, касающиеся вторичной структуры ГС.
Анализ спектров кругового дихроизма ГС B.stearothermophilus показал, что в присутствии Mg и Мп ГС содержит 7$
Исследование вторичной структуры ГС листьев тыквы показало, что ГС хлоропластов и цитозоля имеют разную степень спирализации полипептидных цепей в молекуле. Доля ^-спирали в молекуле ГС хлоропластов составляет 17$, а в ГС цитозоля 34$ /Евстигнеева и соавт.,1979/.
Более полное исследование вторичной структуры проведено для ГС семян и цитозоля листьев гороха /Антонюк и соавт.,1983,1984/. ГС семян и цитозоля листьев гороха содержат оС -спираль, ^-структуру» f -изгибы и неупорядоченную конформацию, соотношение между которыми составляет 24,18,19,39 и 19,30,12,37$, соответственно.
Таким образом, ГС семян и цитозоля листьев гороха близки по вторичной структуре. Однако, ГС цитозоля листьев гороха отличается от ГС семян более высоким содержанием ^-структуры. Данных по вторичной структуре ГС хлоропластов гороха в литературе не имеется.
Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что ГС
- 25 -бактериального, животного, а также растительного происхождения представляют собой высокомолекулярные белки, состоящие из четного числа субъединиц (обычно 8 или 12) с различным типом четвертичной структуры.
При сравнении кинетических характеристик ГС различного происхождения установлено, что все ГС "бактериального" типа, кроме ГС E.coli , характеризуются высоким сродством к аммонию и АТФ. ГС высших растений и хлореллы, подобно ГС бактерий, также обладают высоким сродством и к аммонию, и к АТФ. ГС "животного" типа отличается от них более низким сродством к АН, а сродство к аммонию изменяется в зависимости от вида животной ткани. Для всех ГС установлено низкое сродство к L -глутамату. Сравнение величин К^ для
2+
АТФ и комплекса Me -АТФ свидетельствует о том, что все ГС об-
2+
ладают более высоким сродством к Me -АТФ, чем к АІФ, что подтверждает точку зрения о связывании АТФ на ферменте в виде комплекса Ме2+-А1Ф.
Наличие трех типов четвертичной структуры в мире животных, бактерий и растений является результатом эволюционного отбора форм, наиболее отвечающих одной из функций ГС. Принимая во внимание, что каталитическая функция, т.е. типы реакции, катализируемые ГС всех живых организмов, полностью идентична, различный тип четвертичной структуры, вероятно, связан с регуляторной функцией данного фермента, поскольку он занимает ключевую позицию в азотном метаболизме всех живых организмов. Как видно из данных, приведенных в этом разделе обзора, наиболее сложный тип структуры имеют бактерии. И как показано работами Стэдмана и сотрудников/ stadtman et al , 1980,1981/ именно бактериальная ГС обладает наиболее сложной регуляцией уровней ее активности. Как известно, системы регуляции активности ГС бактерий относятся к самому сложному и многообразному виду регуляции /Ленинджер,1976/.
