Введение к работе
Актуальность проблемы. Реализация эпигенетической программы в развитии эукариотических организмов является на данный момент одной из наиболее изучаемых проблем современной биологии. То или иное состояние отдельных участков генома (эухроматиновое или гетерохроматиновое) эпигенетически наследуется в ряду клеточных поколений. Было показано, что эухроматиновые и гетерохроматиновые районы реплицируются неодновременно (Schubeler et al, 2002; Mac Alpine et al., 2004). Параметры пространственно-временной картины репликации генома четко контролируются в клеточном цикле (Berezney et al., 2000; Blow and Dutta, 2005; DePamphilis et al, 2006; Groth et al, 2007; Gilbert et al, 2010). Однако многие аспекты регуляции такой дифференцированной программы остаются невыясненными.
У Drosophila melanogaster временная картина репликации в политенных тканях имеет свои характерные особенности: в силу укороченного общего времени S-фазы, поздно реплицирующиеся гетерохроматиновые районы политенных хромосом слюнных желез не успевают завершить свою репликацию до конца S-фазы и последовательности ДНК в них остаются недопредставленными (Gall et al, 1971; Smith and Orr-Weaver, 1991; Lilly and Spradling, 1996). У D. melanogaster фактором, влияющим на регуляцию времени репликации таких районов в политенных хромосомах слюнных желез личинок, является белок SUUR {Suppressor of Underreplication). Он способен связываться с районами прицентромерного и интеркалярного (расположенного в плечах хромосом) гетерохроматина (Makunin et al, 2002, Zhimulev et al, 2003). В мутации SuUR эти районы хромосом заканчивают репликацию раньше в S-фазе, вследствие чего, недореплипированные в норме районы становятся полностью политенизированными (Belyaeva et al, 1998). В экспериментах на культуре клеток дрозофилы для белка SUUR было показано, что его геномные мишени соответствуют транскриппионно неактивным типам хроматина (Pindyurin et al, 2007; Filion et al, 2010). Кроме того, была продемонстрирована способность SUUR замедлять скорость движения вилок репликации при амплификации хорионовых генов в фолликулярных клетках яичников (Sher et al, 2012). Однако остается открытым вопрос - как именно SUUR осуществляет свою функцию? Связано ли это с прямым воздействием на машину репликации или же основное влияние SUUR оказывает на структуру хроматина, что, в свою очередь, уже регулирует скорость репликапионной вилки?
Чтобы исследовать механизм работы SUUR, необходима информация о его взаимодействиях с другими белками. К настоящему моменту, единственным белком, для которого было показано физическое взаимодействие с SUUR, является гетерохроматиновый белок НР1 (Pindyurin et al, 2008). Однако, этой информации недостаточно, чтобы объяснить эффект белка SUUR в разных тканях.
В данной работе, чтобы приблизиться к пониманию механизмов действия SUUR, был осуществлен поиск новых белков, с которыми SUUR может взаимодействовать. Была создана система для выделения и очистки белковых комплексов, в которые входит SUUR, на основе метода двойной аффинной очистки (ТАР - tandem affinity purification). Эта система была использована для выделения комплексов SUUR-TAP из белковых экстрактов, полученных из линии культуры клеток S2 дрозофилы, и их состав был проанализирован при помощи масс-спектрометрических методов. После обработки данных масс-спектрометрии был получен список вероятных белков-партнеров SUUR и проведены эксперименты по исследованию функциональности этих взаимодействий генетическими методами. Кроме того, система экспрессии химерного белка SUUR-TAP была использована для проверки гипотезы взаимодействия SUUR и репликационной машины методом коиммунопреципитапии белков из эмбриональных экстрактов дрозофилы. Результаты данной работы указывают на возможное участие SUUR в процессе ремоделинга хроматина во время репликации. Дальнейшая биохимическая проверка обнаруженных взаимодействий позволит построить конкретную модель механизма работы SUUR.
Основная цель данной работы - прояснить роль белка SUUR в процессе репликации у D. melanogaster через выявление белков, способных взаимодействовать с SUUR, методом двойной аффинной очистки белковых комплексов.
Задачи данного исследования:
-
Создать систему экспрессии функционального химерного белка SUUR-TAP в организме и в культуре клеток дрозофилы.
-
Проверить взаимодействие SUUR с PCNA, как с основной структурной компонентой репликационной машины, в эмбрионах дрозофилы.
-
Выделить комплексы белка SUUR-TAP из экстрактов культуры клеток S2 дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки белковых комплексов. Идентифицировать компоненты комплекса при помощи масс-спектрометрии.
-
Проверить обнаруженные потенциальные взаимодействия SUUR генетическими методами.
Научная новизна работы. Создана система для выделения комплексов белка SUUR дрозофилы при помощи метода двойной аффинной очистки. Выявлены ранее не описанные взаимодействия SUUR: установлено физическое взаимодействие SUUR и PCNA (структурной основой репликационной машины) в эмбрионах дрозофилы; определены потенциальные компоненты комплексов SUUR-TAP в культуре клеток дрозофилы S2, среди которых оказались белки, участвующие в процессах регуляции клеточного цикла, репликации, репарации двуцепочечных разрывов ДНК и ремоделинга хроматина. Первичный анализ обнаруженных взаимодействий выявил генетические взаимодействия SuUR с генами Ssrpl, CG12018
(ss Dpol 8) и hd, что позволяет предположить участие SUUR в ремоделинге хроматина во время репликации.
Научно-практическая ценность работы. Результаты данного исследования вносят вклад в фундаментальные знания о процессе репликации у дрозофилы и дают серьезные предпосылки для изучения роли SUUR в таких процессах, как ремоделинг хроматина, контроль репликации и репарации ДНК. В ходе работы была создана система экспрессии SUUR-TAP и проведен ряд необходимых проверок функциональности этого химерного белка. Полученную систему можно эффективно использовать не только для дальнейшего изучения белок-белковых взаимодействий SUUR, но и в качестве более удобного и точного инструмента для цитологического анализа функции SUUR в клетке.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Белок SUUR физически взаимодействует с PCNA, структурной основой репликапионной машины, что отражает связь SUUR с процессом репликации ДНК.
В культуре клеток дрозофилы S2 SUUR ассоциирован с белками, связанными с процессами регуляции клеточного цикла и репликации, ремоделинга хроматина, детекции и репарации двуцепочечных разрывов ДНК, а также гетерохроматиновым белком HP 1.
Личный вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Эксперименты по трансформации культуры клеток дрозофилы конструкцией SuUR-TAP были проведены при участии к.б.н. А.А. Горчакова и к.б.н. А.А. Алексеенко. Анализ локализации SUUR и PCNA на политенных хромосомах слюнных желез был проведен при участии к.б.н. Т.Д. Колесниковой. Анализ частот разломов на политенных хромосомах слюнных желез был проведен совместно с д.б.н. Е.С. Беляевой. Фракционирование экстрактов проведено при участии СВ. Кулемзина.
Апробация работы. Результаты работы представлены на российских и международных конференциях в устных докладах: на 44-ой Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, Россия, 2006 г.), на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 12-ой Всероссийской молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, Россия, 2009 г.), на 10-й Международной конференции по гетерохроматину дрозофилы (Губбио, Италия, 2011 г.); а также в стендовых сообщениях: на 1-ой Международной научной конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, Россия, 2007 г.), на 8-м Европейском симпозиуме по изучению белков (Цюрих, Швейцария, 2009 г.), на 51-ой конференции по изучению дрозофилы (Вашингтон, США, 2010 г.), на 72-м симпозиуме лаборатории Колд Спринт Харбор «Метаболизм и заболевания» (Колд Спринт Харбор, США, 2011 г.), на 3-ей конференции
Европейского общества молекулярной биологии «The EMBO Meeting» (Вена, Австрия, 2011 г.).
Публикации. По теме исследования опубликовано 3 статьи и 14 тезисов конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в которые входит 126 ссылок. Работа изложена на 121 странице печатного текста, содержит 3 таблицы и 12 рисунков.
