Введение к работе
Актуальность темы. Рибосом-инактивирующие белки II типа (РИБП) представляют собой гетеродимеры, состоящие из субъединиц двух типов: В-субъединицы, обладающей лектиновой активностью благодаря наличию как минимум двух углевод-связывающих центров, и А-субъединицы, обладающей N-гликозидазной активностью по отношению к 28S-pPHK эукариот. Действие РИБИ приводит к остановке синтеза белка и последующей гибели эукариотических клеток [Barbieri et al., 1993].
РИБИ, строение и лектиновая природа которых позволяют им взаимодействовать с большим количеством клеточных рецепторов, используются особенно интенсивно в качестве инструментов для изучения особенностей связывания лектинов с углеводами и их внутриклеточного транспорта. Данные белки широко применяются при исследовании структурной организации плазматической мембраны, а также при изучении особенностей везикулярного транспорта, сортинга, рециклинга и дислокации белков из эндоплазматического ретикулума (ЭР). Интерес к РИБН также вызван возможностью создания на их основе вакцин нового поколения и иммунотоксинов - препаратов, избирательно элиминирующих определенные клеточные популяции [Kreitman, 2000].
Описан внутриклеточный путь рицина, включающий такие этапы, как клатрин-зависимый и клатрин-независимьте пути эндоцитоза, доставка в ранние эндосомы, сортинг, рециклинг, ретроградный транспорт в ЭР через аппарат Гольджи (АГ) и транслокация токсина или его А-субъединицы в цитозоль для обеспечения цитотоксического воздействия на рРНК эукариотических клеток [Sandvig, van Deurs, 2000]. Однако существующие в настоящее время литературные данные, описывающие взаимодействие с рецепторами, интернализацию и внутриклеточный путь рицина, не дают полного представления об участии различных клеточных структур в транспорте данного токсина с плазматической мембраны к рибосоме. Более того, та фракция интернализованного рицина, которая достигает АГ и затем ЭР, составляет не более 5% всего пула внутриклеточного рицина. При этом транспорт рицина в АГ не зависит от гаЬ9 и rabll [Iversen et al., 2001]. Остается неясным, куда поступают оставшиеся 95%, хотя в литературе есть свидетельства того, что большая фракция интернализованного рицина подвергается транспорту в лизосомы.
"^ада,,
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА СП< О»
Особенности интернализации и внутриклеточного транспорта вискумина исследованы менее детально по сравнению с рицином, но из-за структурного сходства с рицином для вискумина предполагают механизмы эндоцитоза и внутриклеточного транспорта, аналогичные таковым у рицина.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было исследование клеточных структур, участвующих в транспорте РИБП.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить взаимодействие сходных по структуре РИБП: рицина и
вискумина - с клетками-мишенями.
Разработать модельные системы для изучения особенностей взаимодействия лектинов с углеводами, организованными в трехмерные надмолекулярные структуры.
Получить клеточные линии, экспрессирующие малые ГТФазы как маркеры функциональных доменов эндосомального компартмента. Использовать полученные клеточные линии для изучения ранних этапов транспорта токсинов.
4. Выявить внутриклеточные компартменты, вовлеченные в транспорт
токсинов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые приведена сравнительная характеристика особенностей связывания с клеточной поверхностью, интернализации и внутриклеточного транспорта рицина и вискумина. Впервые показано, что, несмотря на структурное сходство, данные токсины связываются с различными участками плазматической мембраны; при этом специфичность к той или иной структуре на поверхности клетки определяется не только сродством лектина к определенным углеводным остаткам, но и пространственным расположением молекул, составляющих клеточные структуры, а также различной трехмерной организацией лектинов. Также показано, что после интернализации с разных участков плазматической мембраны рицин и вискумин, даже находясь в составе одной клеточной структуры, занимают в ней разные домены. Впервые проведено детальное исследование распределения рицина во внутриклеточных структурах после его интернализации. Показано, что рицин, интернализуемый с помощью как клатрин-зависимого, так и клатрин-независимых механизмов эндоцитоза,
поступает в гаЬ5/гаЬ4-содержащие ранние эндосомы и не проходит в rabl 1-позитивный перинуклеарный рециклинговый компартмент (ГТРК), участвующий в транспорте трансферрина (Тф), внутриклеточный путь которого был подробно описан ранее [Sonnichsen et al., 2000]. Структуры, с которыми длительное время ассоциирован большой пул интернализованного рицина, впервые охарактеризованы как гаЬ5/гаЬ4-позитивные. Впервые показано, что лишь малая часть интернализованных рицина и вискумина проходит в лизосомы. Полученные результаты могут быть использованы для решения ряда прикладных задач, таких как создание препаратов направленного действия и вакцин нового поколения, а также изучение направленной доставки этих препаратов к клеткам-мишеням и особенностей их внутриклеточного транспорта.
Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на международной конференции «55th Harden Conference -Dynamics of Membrane Traffic meeting» (Ambleside, UK, 2002), на международной конференции «12th Internationa] Conference on Scanning Tunelling Microscopy/Spectrocopy and Related Techniques» (Eindhoven, the Netherlands, 2003), на межлабораторном семинаре Центра «Биоинженерия» РАН (Москва), на межлабораторных семинарах НИИ трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО) и ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва), на межлабораторных семинарах в Биоцентре Университета им. Гете (Франкфурт-на-Майне, Германия). Апробация диссертации проведена на заседании кафедры физиологии микроорганизмов Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. По материалам диссертации было опубликовано 5 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 158 страницах, иллюстрирована 34 рисунками и 3 таблицами. Список литературы содержит 312 источников.
