Введение к работе
Актуальность проблемы
Нормальная жизнедеятельность клеток сопряжена с постоянным координированным перемещением белковых молекул во внутриклеточном пространстве. Эти перемещения осуществляются с момента синтеза белковых молекул (полипептидных цепей) на рибосомах и продолжаются в ходе выполнения молекулами своих функций. Перемещения сопровождают такие процессы как внутриклеточный транспорт, секреция, созревание белков и образование белковых комплексов, различные регуляторные взаимодействия, осуществление процессов передачи сигналов между клетками и внутри клеток. Изучение характера и динамики внутриклеточных перемещений необходимо для понимания механизмов происходящих в клетке процессов.
Чрезмерные уровни соединений активного кислорода повреждают многие компоненты клетки, что приводит к окислительному стрессу. В тоже время, локальные колебания концентрации перекиси водорода служат медиатором многих сигнальных путей. Белки, регулирующие уровень кислородных радикалов, осуществляют защиту клетки от окислительных повреждений и могут контролировать процесс передачи сигналов. Исследование механизмов антиоксидантной защиты в клетке является важной задачей, которая в настоящий момент далека от полного решения. Семейство белков сестринов играет важную роль в антиоксидантной защите и контроле сигнальных путей, благодаря их способности восстанавливать активность пероксиредоксинов после переокисления их каталитических цистеинов до сульфинатов. Механизм действия этих белков включает внутриклеточные перемещения, изучение которых может дать важную информацию о регуляции передачи сигналов и функицонировании антиоксидантной защиты клеток.
Цель и задачи исследования
Целью работы было создание репортерной системы для количественного определения внутриклеточных перемещений белков и выяснение с помощью этой системы закономерностей внутриклеточного перераспределения сестринов и других компонентов системы регенерации пероксиредоксинов.
В ходе данного исследования были поставлены следующие задачи:
Сконструировать систему репортеров, использующих эффект а-комппементации, для определения внутриклеточной локализации исследуемого белка.
Получить репортерные линии клеток, характеризующиеся оптимальным уровнем экспрессии введенных белковых конструктов и обеспечивающие широкий динамический диапазон и высокую чувствительность определения внутриклеточных перемещений.
Провести испытания репортерной системы на примере транскрипционного фактора FOX03A.
Исследовать динамику перемещения сестринов в ядро в ответ на увеличение уровней внутриклеточных ROS.
Установить взаимосвязь между перемещающимися в ядро сестринами и локализацией связанного с ними белка Srx.
Определить возможные механизмы, регулирующие перемещение сестринов в ядро.
Научная новизна и практическая ценность работы
В настоящее время существует ряд методов, позволяющих регистрировать внутриклеточные перемещения белковых молекул. Однако, большинство этих методов требует либо фиксации клеток, что исключает возможность наблюдения за внутриклеточными перемещениями in vivo, либо присоединения к исследуемому белку громоздких маркеров, что вносит дополнительные искажения в характер внутриклеточной динамики исследуемого белка.
Описываемая система позволяет определять внутриклеточную локализацию белка путем прикрепления к нему короткого пептида, практически не влияющего на его внутриклеточные перемещения.
Были получены и испытаны линии культур клеток, несущие со-пептид р-галактозидазы, соединенный с сигнальными пептидами, определяющими внутриклеточную локализацию. Такие модельные репортерные клеточные линии могут быть использованы не только для изучения механизмов перемещения белков, но и в качестве удобных тест-систем, позволяющих проводить поиск модуляторов внутриклеточных перемещений путем скрининга библиотек химических соединений или генетических конструкций.
Пригодность локализационного репортера была испытана на примере транскрипционного фактора FOX03A, характер перемещений которого был ранее изучен другими методами и описан в литературе.
На заключительном этапе локализационная репортерная система была использована для изучения внутриклеточных перемещений сестринов в условиях окислительной нагрузки. Были установлены факторы и воздействия, способствующие перемещению сестринов из цитоплазмы в ядро, а также определены вероятные механизмы, принимающие участие в этих перемещениях.
Апробация диссертации
Материалы диссертационной работы были доложены на международном симпозиуме в Keystone, Colorado, США, февраль 2008, на конференции "Mechanisms of early differentiation: embryogenesis, myogenesis (cardiac differentiation) and hematopoiesis/ lymphopoesis", Barsinghausen, Германия, сентябрь 2008, и на конференции молодых ученых ИМБ РАН, октябрь, 2008.
Принцип действия и структура локализационного репортера
Существующие в настоящее время методы регистрации внутриклеточных перемещений белков далеки от совершенства. При использовании флуоресцентных белков или ферментов к исследуемому белку присоединяются значительные по размеру репортерные белки (GFP и т.п.), что может влиять на его подвижность. В основу предложенного нами метода положено явление а-комплементации, при котором активность фермента р-галактозидазы проявляется при совмещении короткого (56 аминокислот) N-концевого а-пептида и длинного, но неактивного ю-пептида фермента, имеющего делецию в области 11-51 аминокислот. Активность фермента реконструируется при простом сближении двух пептидов, даже если они входят в состав разных белков. Фактически, активность фермента проявляется в случае нахождения обоих пептидов в общем внутриклеточном объеме (компартменте). К исследуемому белку присоединяется короткий а-пептид, что минимально влияет на его свойства. Таким образом, если второй компонент (ш-пептид) снабжен сигналом, определяющим его расположение в определенной клеточной структуре, то при появлении в непосредственной близости от него белка, содержащего а-
пептид, возникает работоспособный фермент. По величине его ферментативной активности можно судить о количестве находящегося в данном объеме белка. Если ы-пептид присутствует в избытке, активность фермента меняется пропорционально изменению количества а-пептида, что позволяет оценивать перемещения белка количественно. В то же время, сила взаимодействия двух пептидных фрагментов Р-галактозидазы невелика, и поэтому она практически не влияет на перемещения взаимодействующих компонентов внутри клетки. Эффективность комплементации весьма высока и пригодна для определения перемещений белков между достаточно изолированными объемами, а именно, при определении перемещений из цитоплазмы в ядро и обратно. Однако, этот подход мало пригоден для регистрации перемещений белков в пределах одного объема или структуры, например, при перемещении из плазматической мембраны в эндоплазматический ретикулум, или из цитозоля в митохондрии. В этом случае более эффективно использование пары пептидов с еще меньшей аффинностью, что позволяет существенно снизить фоновый уровень ферментативной активности, наблюдаемый вне непосредственного контакта молекул.
При создания репортернои культуры клеток производится введение одной из генетических конструкций, экспрессирующих ш-пептид р-галактозидазы, снабженный сигналом внутриклеточной локализации для его доставки в клеточную структуру, в которой предполагается произвести измерения. Эта конструкция также содержит селективный маркер (ген устойчивости к флеомицину), экспрессирующийся под независимым промотором.
После трансдукции таким конструктом и проведения селекции, в клетки вводится вторая репортерная конструкция, экспрессирующая исследуемый белок, соединенный с а-пептидом фермента, и другой селективный маркер, для отбора успешно трансдуцированных клеток.
Для введения репортерных конструкций в клетку был выбран способ доставки с помощью лентивирусного вектора. В отличие от простых ретровирусов, которые способны эффективно заражать только клетки, находящиеся в S-фазе клеточного цикла, лентивирусы могут заражать также клетки, находящихся в G1 и G2 - фазах. Таким образом, достигается в десятки раз большая эффективность заражения клеточной популяции. Этот эффект особенно важен при работе с линиями медленно пролиферирующих клеток, существенно сокращая время, требующееся для селекции. Способность лентивирусов проникать в ядро клетки во время, когда в нем идет активная транскрипция и участки генома более открыты, вероятно, объясняет тот факт, что введенные при помощи лентивирусного вектора конструкции менее подвержены последующему затуханию экспрессии, что характерно для конструкций, введенных с помощью ДНК-трансфекции.
Таким образом, с помощью лентивирусной доставки ы-пептид р-галактозидазы был помещен в ядра клеток нескольких линий, которые могут быть использованы в качестве тест систем для анализа перераспределения исследуемых белков между ядром и цитоплазмой.
Конструирование вектора для экспрессии ы-пептида
В качестве основы для создания генетических конструкций был использован лентивирусный вектор pLCMV, в который вводили дополнительную кассету для экспрессии гена устойчивости к флеомицину (ген Ыео). Q-фрагмент р-галактозидазы был получен путем введения делеции (с помощью ПЦР) участка, кодирующего
аминокислотные остатки 11-51. Этот фрагмент помещался под промотор цитомегаловируса лигированием по сайтам Xbal и BamHI.
При создании конструкций, экспрессирующих ы-фрагмент в определенных клеточных структурах, использованы следующие сигнальные последовательности: сигнал для локализации в митохондриях, соответствующий N-концевым 29 аминокислотным остаткам субъединицы VIII цитохром с оксидазы человека; сигнал для локализации в эндоплазматическом ретикулуме, соответствующий двадцати N-концевым аминокислотам калретикулина; сигнал для локализации в плазматических мембранах, соответствующий двадцати N-концевым аминокислотам нейромодулина; сигнал ядерной локализации, расположенный на С-конце и соответствующий четырем копиям сигнала ядерной локализации Т-антигена вируса SV40.
Сборка конструкта, экспрессирующего ы-фрагмент (3-галактозидазы, проводилась в несколько стадий. Вначале в исходный вектор pLCMV вводился локализационный сигнал, снабженный соответствующими сайтами для рестриктаз, по которым в дальнейшем вводились прочие компоненты конструкций. Далее, в конструкцию вводили ы-пептид таким образом, чтобы он оказался в общей рамке считывания с сигналом локализации. На последнем этапе в конструкцию вводили кассету с геном Ыео под контролем конститутивного промотора гена р53 человека (NP-промотор).
Сконструированные рекомбинантные векторы вводились с помощью липофекгаминовой трансфекции в клетки культуры НЕК293Т, для получения вирулентных лентивирусных частиц одноразового действия. С их помощью рекомбинантные конструкции затем могут быть введены в любую выбранную в качестве клеточной модели культуру для получения стандартной репортерной линии клеток. Клетки такой культуры постоянно экспрессируют ы-фрагмент р-галактозидазы, заякоренный на определенной клеточной структуре за счет слитого локализационного белкового сигнала. Помимо этого, трансдуцированные клетки экспрессируют ген Ыео, который обеспечивает им устойчивость при селекции на антибиотике флеомицине. Было создано несколько типов подобных конструкций, заякоривающих ы-фрагмент на плазматической мембране, митохондриях, мембранах эндоплазматического ретикулума и направляющие белок в ядро. С их помощью получены стабильные репортерные линии клеток, постоянно экспрессирующие неактивный профермент в определенной клеточной структуре.
Конструирование векторов для экспрессии белков, слитых с а-пептидом
При создании конструкций, экспрессирующих а-пептид р-галактозидазы, последний помещали на С-конце слитого белка, перед антигенным эпитопом белка с-тус, или, в некоторых случаях, на N-конце. Варианты конструкций с направленной локализацией слитого исследуемого белка создавали с использованием тех же сигнальных пептидов, которые были использованы в ы-конструкциях.
Сборка а-конструкций также проводилась в несколько этапов. Вначале в вектор pLCMV вводили синтетический олигонуклеотид, содержащий а-пептид и эпитоп гена туе. При создании конструктов с направленной локализацией, синтетический олигонуклеотид вводили в векторы, уже содержащие соответствующие локализационные пептиды. Далее, в рамку считывания а-пептида вводили исследуемый белок, после чего вводили кассету для устойчивости к антибиотику G418 (ген пео под контролем NP-промотора).
Таблица 1. Варианты конструкций для локализационного репортера, использовавшиеся в работе
Готовые конструкции способны экспрессировать исследуемый белок, соединенный с коротким а-фрагментом фермента (3-галактозидазы и антигенным эпитопом белка с-тус (10 аминокислотных остатков), что позволяет контролировать количество и местонахождение белка стандартными иммунологическими методами. Это особенно удобно в случае отсутствия специфических антител, узнающих исследуемый белок.
В качестве контролей были также созданы несколько а-конструкций, в которых а-пептид р-галактозидазы расположен в составе гетерологичного зеленого флуоресцентного белка EGFP. В этих конструкциях белок EGFP либо не имеет локализационных сигналов, либо снабжен соответствующими сигнальными пептидами, направляющими его в различные клеточные структуры. Удобство EGFP заключается в возможности визуального контроля локализации белка. Все созданные репортерные конструкции описаны в таблице 1.
Получение клонов ы-пис-Ыео
После трансдукции культуры клеток рекомбинантными конструкциями, экспрессирующими ш-фрагмент (3-галактозидазы, слитый с сигналом внутриклеточной локализации, была проведена селекция клеток путем культивации с флеомицином. После прохождения селекции в культуру клеток вводились конструкты, содержащие флуоресцентный белок GFP, слитый с а-фрагментом р-галактозидазы, а также с сигналом ядерной локализации (GFP-nuc-PMN), или не обладающий специфическим локализационным сигналом (GFP-PMN). Затем, в этих клеточных культурах, с помощью тест-системы Gal-Screen измерялся уровень активности (3-галактозидазы для определения функциональной активности репортера.
RKO-ш-пис-Ыео
Рис. 1. Уровень активности р-галактозидазы в массовых культурах клеток RKO с введенной конструкцией pLCMV-to-nuc-bleo, после введения экспрессоров GFP-PMN и GFP-nuc-PMN.
клеток, экспрессирующие
Уровень активной р-галактозидазы различается в этих массовых культурах лишь незначительно (рис. 1). Однако, внутри массовой культуры возможны широкие вариации уровня экспрессии трансгена, что обусловлено местом интеграции, влиянием окружающих регуляторных элементов, а также эпигенетическим состоянием всего прилегающего участка. Для получения оптимальной репортерной линии были отобраны индивидуальные клоны в определенных клеточных структурах ю-пептид (3-галактозидазы.
В качестве примера опишем отбор репортерной линии для анализа ядерной локализации белков. В индивидуальные клоны клеток RKO с введенной конструкцией pLCMV-w-lacZ-nuc-bleo параллельно вводили конструкции pLCMV-GFP-PMN, pLCMV-GFP-nuc-PMN или pLCMV-mem-GFP-PMN, которые экспрессируют слитый с а-пептидом зеленый флуоресцентный белок (содержащий или не содержащий сигналы внутриклеточной локализации). После селекции на антибиотике G418 экспрессию оценивали флуоресцентной микроскопией (рис. 2).
Рис. 2 Результаты флуоресцентного анализа, проведенного на клонах клеток RKO с введенными конструктами pLCMV-GFP-PMN, pLCMV-GFP-nuc-PMN или pLCMV-mem-GFP-PMN, соответственно.
Были отобраны клоны с приблизительно одинаковым уровнем экспрессии GFP, после чего определялась активность (3-галактозидазы. Критерием для отбора оптимального клона было максимальное соотношение между уровнями активности р-галактозидазы в культурах, содержащих ядерный и мембранный ш-фрагмент. Немаловажное значение имела также чувствительность системы, которая зависит от уровня (3-галактозидазной
активности. Поэтому из 24 первичных
клонов были вначале отобраны клоны,
демонстрирующие максимальную
ферментативную активность при введении конструкции pLCMV-GFP-nuc-PMN (рис. 3).
mass GFP-NUC
Рис. 3. Уровни активности (3-галактозидазы в различных клонах клеточной линии RKO с введенным конструктом pLCMV-w-nuc-blco и pLCMV-GFP-nuc-PMN. Шкала логарифмическая.
Далее из отобранных клонов (NZ1 и NZ11) выявляли клон, в котором наблюдается максимальное соотношение уровней ферментативной активности при введении ядерного белка по сравнению с мембранным белком.
EGFP-nuc EGFP-mem
Как видно из Рис. 4, клон N21 обладает наиболее выраженной специфичностью. Высокий фон, полученный с линией NZ11, может обуславливаться либо присутствием части w-фрагмента вне ядра, либо сравнительно высоким уровнем митотической активности клеток - во время митоза происходит смешивание белковых продуктов ядра и цитоплазмы.
Ї 0.5
Рис. 4. Уровни активности |3-галактозидазы, измеренные по GalScrecn в репортерных клонах RKO-NZI и RKO-NZU с введенным конструктом EGFP-nuc (положительный контроль) и EGFP-mem (отрицательный контроль).
Аналогичным образом были получены и испытаны клоны с оптимальной экспрессией ш-фрагмента с сигналом митохондриальной, мембранной и эндоплазматической локализации. Полученные результаты указывают на то, что I
репортеры, локализованные в «закрытых» клеточных структурах, таких как ядро и митохондрии, характеризуются существенно большим динамическим диапазоном работы. Скорее всего, это связано с тем, что в «открытых» структурах повышена вероятность встречи двух компонентов репортерного комплекса, даже если связанный с а-пептидом белок имеет другой сигнал локализации. Однако, даже при введении іо-конструкта в «открытые» структуры, было показано достоверное различие в уровне активации репортера между положительным (с той же локализацией а-пептида) и отрицательным (а-пептид располагается в другой структуре) контролями. Это дает основания предполагать, что такие репортеры могут быть успешно использованы для определения внутриклеточной транслокации белков в «открытых» структурах, по крайней мере, в том случае, если эти перемещения будут велики в процентном отношении к общему количеству белка, входящего в данную структуру.
Отработка функционирования репортера на примере белка FOXQ3A
В качестве проверки функционирования локализационного репортера, полученные репортерные линии клеток были применены для количественной оценки ядерной транслокации белка FOX03A. Этот белок участвует в сигнальном пути, запускаемом инсулин-подобным фактором роста IGF1, и относится к транскрипционным факторам семейства Forkhead. Известно, что белки подсемейства FOXO курсируют между ядром и цитоплазмой, за счет чего происходит регуляция их активности. Проникая в ядро, они взаимодействует со специфическими участками ДНК контролируемых ими генов, активируя транскрипцию. Белки FOXO содержат как сигнал ядерной локализации, так и сигнал ядерного экспорта, а их перемещение между ядром и цитоплазмой, по-видимому, является равновесным, зависящим от ряда вспомогательных белков процессом. Известно, что импорту белка FOXO в ядро способствуют импортины, в то время как его выход из ядра контролируется экспортином СггтїІ. Ключевую роль в определении соотношения процессов ядерного импорта и экспорта белков FOXO играет серин-треониновая протеинкиназа В (РКВ или Akt). Протеинкиназная функция белка Akt активируется за счет связывания с вторичным липидным посланником, фосфатидилинозитолом, который, в свою очередь, фосфорилируется фосфатидил-инозитол-3-киназой (PI3K). Активированный Akt фосфорилирует ядерный FOX03A по Thr32, что приводит к взаимодействию комплекса белка FOXO и экспортина Crm1 с белком 14-3-3, приводящему к подавлению сигнала ядерной локализации и преимущественному расположению белка FOXO в цитоплазме. Влияя на данные регуляторные процессы, можно манипулировать внутриклеточным расположением белка FOX03A, что представляет собой хорошую модель для проверки эффективности разрабатываемой локализационной репортерный системы.
Помимо конструкции pLCMV-FOX03A-PMN, были созданы две контрольные конструкции для экспрессии белка FOX03A, снабженного а-пептидом и локализующегося в ядре и в плазматической мембране. Уровень ферментативной активности при введении таких конструкций в репортерную линию RKO-NZ1 позволяет определить максимально и минимально возможный уровень присутствия белка FOX03A в ядре. Большая часть белка FOX03A в клетках RKO располагалась вне ядра, поскольку ферментативная активность у клеток, экспрессирующих конструкт pLCMV-FOX03A-PMN, всего в два раза превышала значение отрицательного контроля, т.е. клеток, с введенным pLCMV-mem-F0X03A-PMN, но была в 8 раз ниже активности в клетках с введенной конструкцией, экспрессирующей ядерный белок (Рис. 5).
Рис. 5. Уровни ферментативной активности в репортерных клетках
линии RKO-NZ1 с введенным FOX03A с сигналом ядерной,
мембранной локализации, или без сигналов локализации.
Далее, нами было определено влияние среды культивирования на перераспределение белка FOX03A между ядром и цитоплазмой. Известно, что недостаток глюкозы сопровождается угнетением активности киназы РКВ, что приводит к ослаблению фосфорилирования и ядерного экспорта белка FOX03A. Это адаптивное движение белка FOX03A из ядра должно подавляться в случае конститутивной активации киназы РКВ, что может быть достигнуто введением активированного онкогена Akt. При помощи лентивирусной инфекции мы ввели конститутивно активированный Akt в клетки линии RKO-NZ1 и использовали эту линию в качестве контроля. Инкубация контрольных клеток RKO-NZ1 в течение одного часа в среде DMEM, лишенной глюкозы приводила к почти двукратному повышению ферментативной активности, в то время как в клетках, экспрессирующих активированный Akt, повышение было в пределах 20%.
-глюкоза + АКТ + глюкоза + АКТ -глюкоза- АКТ + глюкоза- АКТ
Рис. 6. Переход FOX03A в ядро при культивации
клеток в среде без глюкозы и возвращение FOX03A в
цитоплазму при добавлении глюкозы в среду. Показана
2,5 Н + глюкоза- акт _ динамика в клетках RKO-NZ1 с введенным FOX03A-
PMN в присутствии и отсутствие Akt.
После восстановления нормального
L содержания глюкозы в среде в течение одного
часа наблюдалось практически полное
восстановление исходного уровня
ферментативной активности, что указывает на выход части белка FOX03A из ядра (рис. 6). В
0,5-1—- 1— —і— , , контрольном опыте с культурой,
Часы 8 экспрессирующей белок EGFP вместо белка
FOX03A, изменения содержания глюкозы не сказывались на уровне ферментативной активности. Обратная тенденция с уменьшением ферментативной активности в ответ на глюкозное голодание и ее последующее восстановление при добавлении глюкозы была отмечена в репортерной линии RKO-MemZ11, содержащей ш-фрагмент в плазматической мембране. Другим приемом для изменения внутриклеточного распределения белка FOX03A является обработка клеток ингибитором Р13-киназы вортманнином, который опосредованно подавляет активность РКВ и тем самым препятствует перемещению белка FOX03A в цитоплазму. Обработка клеток RKO-NZ1-FOX03A-PMN в течение двух часов вортманнином в концентрации 40 пМ приводила к четырехкратному увеличению ферментативной активности. Последующая отмывка вортманнина свежей средой в течение двух часов приводила к обратному процессу, указывающему на выход белка FOX03A из ядра (рис. 7).
Смена среды с DMEM на Earle + wortmannln с
Рис. 7. Результаты измерения активности локализашюшюго репортера методом GalScrccn в клетках RKO-NZ1-FOX03A-PMN после смены среды с DMEM на Earle (1) и обработки клеток 40пМ вортмашша (2) с последующей отмывкой через а) 2 часа инкубации; б) четыре часа инкубации; в) без отмывки
Для подтверждения того, что наблюдаемые изменения ферментативной активности связаны не с повышением или снижением общего уровня белка FOX03A в клетке, нами было проведено количественное определение белка FOX03A методом Вестерн-анализа с использованием антител, узнающих пришитый к этому белку С-концевой антигенный эпитоп с-тус. Было установлено, что как в контрольных необработанных клетках, так и после обработки вортманнином и последующей его отмывки, уровень рекомбинантного белка FOX03A существенно не меняется. Очевидно, изменения активности р-галактозидазы связаны с перераспределением рекомбинантного белка внутри клетки, что делает его более или менее доступным для функционального взаимодействия с расположенным в определенных клеточных структурах ш-фрагментом фермента.
Влияние обработки hTNF и культивации в среде без сыворотки на изменение внутриклеточной локализации белка Sesn2
В ходе метаболических реакций в клетке постоянно образуются соединения активного кислорода, которые затем нейтрализуются антиоксидантными ферментами. Кроме того, многие взаимодействия лигандов с мембранными рецепторами сопровождаются образованием Н2О2, молекулы-медиатора внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих, в том числе, такие важные процессы, как пролиферация и апоптоз. Предотвращение негативных последствий, связанных с окислительным стрессом, достигается за счет специальных механизмов, регулирующих уровень сигнальных молекул Н2Ог. Большая часть кислородных радикалов восстанавливается в клетке за счет тиол-содержащих пероскидаз семейства пероксиредоксинов (Prxns). В ходе этой реакции активные цистеины каталитических центров пероксиредоксинов, образующих гомодимер, окисляются и связываются друг с другом, формируя дисульфидную связь. В дальнейшем, окисленные пероксиредоксины подвергаются восстановлению тиоредоксин-редуктазной системой. Однако образование дисульфидной связи происходит довольно медленно, и если концентрация ROS в клетке слишком высока, активные цистеины пероксиредоксинов подвергаются более полному окислению. Продукт такого окисления, Cys-S02H, не может быть восстановлен тиоредоксин-редуктазной системой. Несмотря на это, в клетках, подвергшихся сильному окислительному стрессу, количество переокисленных пероксиредоксинов с течением времени падает. По некоторым данным восстановление таких пероксиредоксинов осуществляет белковый комплекс, компонентами которого
являются как тиоредоксин-редуктаза, так и белки семейства сестринов (Sesns). Белок Sesn2 принадлежит к этому семейству и принимает непосредственное участие в восстановлении переокисленных пероксиредоксинов, что важно для предотвращения окислительного стресса.
MCF7/tet-Hi95Flag
Необработанные H202,500цМ
Данные иммунофлуоресцентного анализа, проведенного на клетках линии MCF7, показывают, что Sesn2, находящийся в отсутствие окислительного стресса преимущественно в цитоплазме, после обработки клеточной культуры 500цМ Н202, приводящей к значительному повышению ROS, переходит из цитоплазмы в ядро (рис. 8).
Рис. 8. Клетки линии MCF7, содержащие тетрациклин-зависимый экспрессор Scsn2-Flag, были обработаны 500цМ Н2О2 в присутствии (ряд +tet) и в отсутствие (ряд -tct) тетрациклина, и подвергнуты иммунофлуорссиентному окрашиванию антителами на Flag.
Рис. 9. Доля популяции клеток RKO и MCF7, демонстрирующих надпороговые уровни окисленного DCF-DA после смены среды DMEM на свежую, обработки 500цМ Н2О2, 100 ng/ml эпидермальным фактором роста (EGF), и 0.25 ng/pl фактора некроза опухолей hTNF. В качестве положительного контроля использовалось УФ-облучснис культуры с добавленным DCF-DA в течение 20 секунд. Все обработки длились 40 минут. При измерении использовалось по 10' клеток на точку.
Параллельная инкубация в присутствии 500рМ Н202 культур RKO, экспрессирующих что уже через 2 часа после начала
При помощи локализационного репортера был предпринят анализ влияния условно-физиологических обработок, приводящих к повышению внутриклеточного уровня ROS, на передислокацию Sesn2 в ядро. В качестве отправной точки было решено использовать обработку 500рМ Н202. Результаты иммунофлуоресцентного анализа были получены на клетках линии MCF7, а локализационный репортер был разработан на основе линии клеток RKO, которые больше подходят для измерений активности фермента системой GalScreen из-за высоких темпов пролиферации. Сравнение уровня ROS после обработки клеток 500рМ Н202, выявило примерно одинаковые значения для обеих клеточных линий (рис. 9). %
_мпЛ
хЬлІ
нгог
500uM
DMEM смена
K+ (UV 20sec)
репортеры Sesn2-PMN и Sesn2-nuc-PMN, показала,
обработки уровень ферментативной активности в репортере Sesn2-PMN практически в два раза превышает контрольные значения. С течением времени уровень активности возрос еще больше. При этом репортер Sesn2-PMN имел довольно низкий фоновый уровнь активности, который был в 5 раз ниже уровня активности репортера Sesn2-nuc-PMN (с введенным сигналом ядерной локализации), что говорит о довольно широком динамическом диапазоне системы (рис. 10).
Рис. 10. Динамика изменения уровня активации локализационного репортера Scsn2-PMN под действием 500 цМ Н2О2 с течением времени. В качестве контроля был использован репортер Scsn2-nuc-PMN с введенным сигналом ядерной локализации. Измерения проводились через 1, 3,6, 9 и 12 часов после добавления Н2О2.
Добавление 500 рМ Н2С>2 вызывает
быстрое и значительное увеличение
ферментативной активности.
нетНг02 1чН,0, ЗчНгОг 6чНг0, 9чНг02 12чН,0г
Однако, это воздействие выходит за
физиологически-допустимые
пределы. Такие высокие
концентрации ROS могут приводить к необратимым нарушениям клеточной жизнедеятельности, окислительному стрессу, и, впоследствии, к апоптозу. Не исключено, что такие высокие уровни перехода Sesn2 в ядро на поздних сроках после добавления перекиси в значительной степени вызваны пост-стрессорными нарушениями клеточного метаболизма и не являются адаптивным, физиологическим ответом на повышенные уровни ROS. В пользу этого также свидетельствует статистически достоверное увеличение присутствия в ядре Sesn2 с введенным сигналом ядерной локализации, происходящее в ответ на обработку Н2О2.
Рис. 11. Динамика активации
локализационного репортера Scsn2-PMN
после добавления к клеткам,
культивировавшимся на среде без сыворотки, 10%FCS (линия "FCS"), и обработки клеток 50nM hTNF (линия "TNF"). По оси Y: кратность увеличения уровня сигнала относительно исходных значений.
Напротив, культивация клеток на среде DMEM без фетальной сыворотки (FCS), с последующим добавлением FCS до 10% объема среды, или добавление в клеточную среду умеренных доз фактора некроза опухолей человека (hTNF) также достоверно повышают уровни внутриклеточных ROS, не приводя при этом к летальным последствиям.
Испытание воздействия таких обработок на переход Sesn2 в ядро с помощью локализационного репортера показало, что под действием hTNF Sesn2 демонстрирует впечатляющую динамику ядерной передислокации. Однако, добавление сыворотки,
несмотря на наблюдаемые увеличения уровней ROS, не приводило к значимым увеличениям уровня ядерного Sesn2 (рис. 11).
Перемещения Sesn2 в митохондрии и к плазматической мембране при окислительном стрессе
Для того, чтобы определить, не является ли наблюдаемый переход Sesn2 в ядро под действием перекиси следствием простого увеличения количества белка за счет изменения темпов транскрипции или трансляции, были отобраны репортерные клоны, содержащие со-пептид в митохондриях или плазматических мембранах. В эти клоны были введены а-конструкции, экспрессирующие свободный Sesn2, либо Sesn2, заякоренный на митохондрии или плазматические мембраны. Далее, клеточные культуры подверглись обработке Н202 в течение 2-х часов, после чего в них была измерена активность репортера. В спокойном состоянии количество Sesn2, локализованного в митохондриях, было достаточно велико, причем, существенно выше, чем количество Sesn2 с сигналом митохондриальной локализации. При обработке перекисью Sesn2, не обладающий локализационным сигналом, покидает митохондрии, a Sesn2-mit, наоборот, накапливается в них. Такая разнонаправленная динамика движения, вероятно, связана с конкуренцией за возможность связывания различных форм Sesn2 в митохондриях, причем при перекиси свободный Sesn2 выходит из митохондрий в ядро, освобождая место для Sesn2, имеющего специфический сигнал митохондриальной локализации. Уменьшение уровня свободного Sesn2 в митохондриях, в свою очередь, указывает на то, что обработка Нг02 способна приводить к внутриклеточному перераспределению Sesn2, которое не может быть объяснено простым увеличением количества белка.
Контроль
Н.О»
Рис.12. Уровни активности
локализационного
репортера в клонах с
митохондриальной
(M1ZP3, M1ZA3) и
мембранной (MEZP1I,
MEZA11) локализацией
щ-пептида Р-галактозидазы
Контроль Нг02 д0 и после обработки
в течение 2 часов 500 рМ Но02. В клетках MIZP3 и MEZP11 присутствует Scsn2-PMN, в клетках M1ZA3 присутствует Sesn2-mit-PMN, а в клетках MEZAI1 присутствует Scsn2-mem-PMN.
Репортер, экспрессирующий мембранный ш-пептид, напротив, выявляет противоположную динамику перемещения Sesn2 в ответ на окислительный стресс. Исходно невысокие уровни активности для свободного Sesn2 после обработки Н2О2 увеличиваются более чем в 3 раза. Имеющий сигнал мембранной локализации Sesn2-mem-PMN, напротив, отходит от плазматической мембраны (рис. 12). Можно предположить, что Sesn2, в норме слабо представленный вблизи плазматической мембраны, активно накапливается на ней в ходе реакции на окислительный стресс. Уменьшение же количества Sesn2 с сигналом мембранной локализации может быть объяснено супрессией нейромодулиновых локализационных механизмов, возникающей в ответ на стресс.
Чтобы оценить возможные уровни стресс-индуцированного неспецифического перемещения Sesn2 в ядро, которое может быть вызвано, например, повышением проницаемости ядерных пор в результате окислительного повреждения некоторых нуклеопоринов, Sesn2-mit-PMN, имеющий сигнал митохондриальной локализации, был
введен в клетки репортерной линии NZ1 (содержит ядерный ы-пептид), с последующей обработкой перекисью водорода. Для сравнения была использована а-конструкция, экспрессирующая свободный Sesn2.
Рис. 13. Динамика перемещения в ядро Scsn2-mit (NZlmi), и свободного Scsn2 (NZIP) после обработки клеток 500 |JM Н2О2.
Полученная динамика перемещения Sesn2-mit-PMN в ядро подтверждает предположение о нарушении ядерной проницаемости при значительном окислительном стрессе (рис. 13). Однако факт, что свободно перемещающийся Sesn2-PMN переходит в ядро более интенсивно, указывает на то, что наблюдаемые перемещения связаны не только с неспецифическим увеличением ядерной проницаемости.
Влияние сульфиредоксина на передислокацию Sesn2
Белковый комплекс, осуществляющий восстановление переокисленных
пероксиредоксинов, помимо тиоредоксин-редуктазы и сестринов, включает в себя белок сульфиредоксин (Srx). Этот относительно небольшой (11 кД) белок способен восстанавливать пероксиредоксины in vitro в присутствии Sesn2. В нашей лаборатории установлено, что при ко-экспрессии белков Sesn2 и Srx они образуют комплекс, выявляемый методом иммунопреципитации с последующим иммуноблоттингом. При этом значительная часть Sesn2, присутствующего в клетке, находится в комплексе с Srx. Возможно, образование комплекса с белком Srx также влияет на внутриклеточную локализацию Sesn2. Мы транедуцировали клетки репортерной линии NZ1-Sesn2-PMN, конструктом, экспрессирующим Srx, снабженный сигналом митохондриальной или мембранной локализации. В ходе селекции выяснилось, что белок Srx-mem чрезвычайно токсичен для клеток, и получить соответствующую стабильную культуру невозможно. Экспрессор Srx-mit, в свою очередь, также несколько подавлял рост клеток. После проведения селекции клетки NZ1-Sesn2-PMN с введенным Srx-mit были обработаны 25нг/мл hTNF в течение 20 часов.
Результаты указывают на то, что Sesn2 способен переходить в ядро в присутствии Srx-mit, однако интенсивность перехода достоверно снижена по сравнению с контрольной культурой, где Srx-mit не экспрессируется. Также, абсолютные значения активности [3-галактозидазы свидетельствуют о том, что в присутствии Srx-mit фоновый уровень Sesn2 в ядре в 2,5 раза ниже, чем в контрольных культурах. Под действием hTNF уровень ядерного Sesn2 в культурах с введенным Srx-mit едва достигает фонового уровня для контрольного ядерного Sesn2 (рис. 14). Эти данные указывают на то, что Srx оказывает влияние на внутриклеточные перемещения белка Sesn2.
Рис. 14. Динамика перемещений Sesn2 в ядро под действием hTNF в присутствии (NZlPSrx-Mit)HB отсутствие (NZ1P) Srx-mit.
Контроль
Контроль
Переход Sesn2 в ядро под действием РМА
Все воздействия, описанные выше и применявшиеся для анализа внутриклеточной локализации Sesn2, приводили к подъему уровня внутриклеточных ROS, но, либо были недостаточно сильны, чтобы вызвать значимую передислокацию Sesn2, либо оказывались избыточными и со временем вызывали апоптоз. В частности, при обработке 25нг/мл hTNF происходило существенное замедление пролиферации и наблюдалось заметное количество апоптозных клеток. В ходе поиска нетоксичных обработок, вызывающих существенное повышение ROS, было обнаружено, что обработка форболовым эфиром РМА, вызывая увеличение уровня кислородных радикалов, приводит к интенсивному и продолжительному переходу Sesn2 в ядро. РМА, являясь промотором опухолевого роста, приводит к активации протеинкиназы С (РКС), что, в свою очередь, стимулирует активность NADPH-зависимых оксидаз (NOX) и приводит к запуску ROS-опосредованных сигналов. Примечательно, что при одновременной обработке репортерных клеток NZ1-Sesn2-PMN hTNF и РМА наблюдалось их кумулятивное действие на ядерную транслокацию Sesn2 (рис. 15).
3,5
2,5
1,5
0,5
РМА
PMA+TNF
Рис. 15. Перемещение Sesn2 в ядро в клетках рспортерной культуры NZ1-Sesn2-PMN под действием РМА, hTNF, и их смеси, в зависимости от добавленной концентрации препаратов. Обработки проводились в течение 5 часов.
2.5nM 5nM25ng 10nM
12,5ng 50ng
20n 100ng
К 0,3125пМ 0,625пМ 1,25пМ
1,6125ng 3,125ng 6,25ng
Длительные измерения динамики перехода Sesn2 в ядро под действием РМА показали, что даже спустя 36 часов после обработки, активность ядерного репортера в несколько раз превышает контрольные значения (рис. 16).
Рис. ] 6. Динамика перемещения Scsn2 в ядро в клетках NZI-Scsn2-PMN при добавлении 5пМ РМА.
Обработка РМА приводила также к
стойкому повышению уровня ROS.
Таким образом, РМА приводит к
запуску сигнальных путей,
использующих Н2О2, причем после
удаления РМА этот сигнал остается
активным длительное время.
Наблюдения за культурой клеток после обработки РМА показали, что он не оказывает токсического действия на клетки, не приводит к апоптозу и несколько стимулирует пролиферацию. Таким образом, переход Sesn2 в ядро в данном случае не является следствием
РМА (обработка 2 часа) РМА (обработка без отмыва )
1000 1500 минуты
токсического, предапоптозного перераспределения белков.
Известно, что Sesn2 участвует в восстановлении переокисленных пероксиредоксинов, образуя с ними единый белковый комплекс. Поэтому, если переход Sesn2 в ядро под действием РМА связан с процессом восстановления пероксиредоксинов, то количество комплексов Sesn2-Prx в ядре также должно возрастать, что может происходить в связи с увеличением ядерного импорта пероксиредоксинов.
Рис. 17. Изменения активности ядерных локализационных репортеров на Prxl, Ргх2 и РгхЗ, (NZI-Prxl-PMN, NZl-Prx2-PMN и NZl-Prx3-PMN) после обработки 5пМ РМА в течение 18 часов.
Для того чтобы пронаблюдать перемещения
пероксиредоксинов в ядро под воздействием РМА, в
репортерные клетки NZ1 были введены конструкты,
экспрессирующие Ргх1, Ргх2, и РгхЗ, соединенные с а-
пептидом. Далее, клетки инкубировали с 5 пМ РМА в
течение 18 часов, после чего была измерена активность
репортера. Репортеры на Ргх1 и РгхЗ показали, что
количество этих белков в ядре не претерпевает
существенных изменений под действием РМА. Однако,
количество Ргх2 в ядре после обработки РМА
возрастало в 3 раза (рис. 17). Таким образом, в клетках,
контроль рмА 18ч стимулированных РМА, происходит одновременная
передислокация Sesn2 и Ргх2, что возможно указывает на их совместную роль в ядре.
Исследование механизмов РМА-индуцированной передислокации Sesn2
РМА является активатором протеинкиназы С, которая способна активировать сигнальные пути, приводящие к повышению внутриклеточных уровней ROS. Это, в свою очередь, приводит к ядерной транслокации Sesn2. РКС играет также роль в ряде клеточных сигнальных путей, использующих Н2О2 в качестве медиатора, например, при передаче сигнала от рецептора эпидермального ростового фактора (EGFR). Мы решили выяснить,
какой из компонентов сигнальных путей, активируемых РМА, перемещение Sesn2 из цитоплазмы в ядро.
непосредственно вызывает
Рис. 18. Схема Н202-1
опосредованного пути передачи!
сигналов на примере сигнального,
пути эпидермального ростового
фактора (EGF). EGF, связываясь о
рецептором (EGFR), воздействует на!
ГТФазу Rac и активирует РКС, что
приводит к активации связанного с
Поддержание защиты мембраной комплекса NOX, который
eMpeoHeL"Apa Т вызывает выброс супероксида, ej
дальнейшем превращающегося г
Н2О2. Это, в свою очередь, приводит1
к модификации редокс-
чувствитсльных мишеней, г!
способствует передаче сигнала!
Обработка клеток антиоксидантом №
ацетил-цистсином (NAC) или каталазой нейтрализует образовавшийся Н2О2. DPI является специфическим
ингибитором NOX5. Ингибиторы Н7 и BMI подавляют активность протеинкиназы С. ;
Для этого были использованы специфические ингибиторы отдельных стадий передач
сигнала. Diphenylene iodonium (DPI) специфически подавляет NOX, предотвращав
образование кислородных радикалов в ответ на обработку РМА или действие EGF:
Ингибиторы киназ Н7 и BMI угнетают протеинкиназу С, подавляя РКС-зависиму;;
активацию NOX. NAC и каталаза нейтрализуют Н2О2, и предотвращают модификации
редокс-чувствительных компонентов сигнальных путей (рис.18). I
Контроль
+РМА
+Н,02
rf
Рис. 19. Влияние ингибиторов NOX, РКС и ROS на повышение уровня соединений активного кислорода после обработки клеток РМА и Н2О2.
Измерение уровня ROS iJ
клетках, инкубированных ;
5 пМ РМА или 500 рМ Н20:'
и обработанные
ингибиторами NOX, РКС і
ROS (по флуоресценции
DCF-DA, измеряно:
методом проточно.'
Контроль
Каталаза
флуориметрии) показал::
что обработка клетої
каталазой и D1
эффективно защищает клетки от повышения уровней ROS под действием РМ«
В то же время, ВМІ, специфический ингибитор РКС, сам по себе приводя к некотором:
повышению уровней ROS, ослаблял способность РМА и Н2О2 повышать уровни ROS
(рис 19). I
Параллельно, на репортерной культуре NZ1-Sesn2-PMN была испытана способность указанных ингибиторов влиять на перемещение Sesn2 в ядро под действием 5nM РМА.
Несмотря на то, что и каталаза, и DPI эффективно предотвращают повышение уровня внутриклеточных ROS, вызванное РМА, только ингибиторы протеинкиназы С Н7 и BMI оказались способными предотвращать РМА-индуцированный переход Sesn2 в ядро (рис. 20). По-видимому, именно протеинкиназа С, активированная под действием РМА, подвергает фосфорилированию либо сам Sesn2, либо белки, с которыми он ассоциирован, что приводит к перемещению Sesn2, в ядро.
контроль D +РМА
4,5-і
3,5
2,5
Рис. 20. Переход Sesn2 в ядро в клетках репортера NZl-Scsn2-PMN, обработанных ингибиторами РКС, NOX и ROS после культивации в среде с 5 пМ РМА в течение 15 часов.
Помимо физиологических
ЇЛШ.
1,5
0.5- Н
выбросов ROS, которые
возникают за счет активности
NOX при проведении сигнала,
клетка может подвергаться
окислительному стрессу,
контроль
Каталаза
например при обработке Н202.
Под действием экзогенных ROS
Sesn2 также переходит в ядро,
однако регуляция этого
процесса может быть иной по сравнению с транслокацией Sesn2 под действием лигандов мембранных рецепторов и РМА. Для того, чтобы проверить это, репортерные клетки NZ1-Sesn2-PMN обрабатывали ингибиторами NOX, РКС и ROS и культивировали в среде с 5 пМ РМА, 500 рМ Н202 или 25 нг/мл hTNF.
Отдельные обработки могут по-разному влиять на общий уровень ядерного импорта. Для исключения влияния артефактных воздействий, приводящих к неспецифическим эффектам, параллельно с локализационным репортером на Sesn2 (NZ1-Sesn2-PMN), аналогичным обработкам была подвергнута контрольная репортрная культура, экспрессирующая GFP (NZ1-GFP-PMN). Сравнивая динамику перемещения не участвующего в проведении редокс-сигналов GFP с перемещениями Sesn2, можно вычленить вклад, который могут вносить неспецифические изменения ядерного импорта-экспорта.
Рис. 21. Культуру клеток репортера NZl-Sesn2-PMN культивировали в течение 2-х часов с ингибиторами РКС (Н7, BMI), NOX (DPI) и ROS (катализа), и обрабатывали РМА, Н202 и hTNF в течение 5 часов. Перемещение Sesn2 в ядро определяли путем измерения активности р-галактозидазы тест-системой GalScreen. Зеленым цветом отмечено движение в ядро белка GFP в контрольной репортерной культуре NZ1-GFP-PMN, подвергнутой тем же обработкам.
Обработка ингибиторами РКС (Н7 и BMI) приводила к резкому подавлению перехода Sesn2 в ядро под действием РМА, что подтвердило вывод о ключевой роли этой киназы в ядерной транслокации Sesn2. Переход Sesn2 в ядро под действием Н2О2 наиболее эффективно подавлялся под действием каталазы и ингибитора киназы Н7. В то же время, транслокация Sesn2 под действием hTNF, была чувствительна к ингибитору киназ Н7, и, в меньшей степени, к обработке каталазой и ингибитором NOX DPI. Видимо, Нг02-индуцированный переход Sesn2 в ядро имеет регуляцию, в меньшей мере зависимую от РКС, поскольку Н7, в отличие от BMI, обладает меньшей специфичностью действия, а BMI, в свою очередь, не подавляет транслокацию Sesn2 под действием перекиси. Аналогично, hTNF, по-видимому, влияет на транслокакцию Sesn2 как посредством активации NOX, так и путем активации киназ, отличных от РКС и угнетаемых Н7 (рис. 21).
Влияние сайтов фосфорилирования белковой молекулы Sesn2 на динамику ядерной транслокации
Хотя роль протеинкиназы С в процессе передислокации Sesn2 в ядро в ответ на оксидативный стресс кажется установленной, остается неясным, какие мишени этой киназы опосредуют ее действие. РКС может как непосредственно фосфорилировать специфические сайты на самом Sesn2, так и действовать на другие белки, либо находящиеся с ним в комплексе, либо косвенно влияющие на процесс транслокации. Амнокислотная последовательность Sesn2 содержит несколько потенциальных сайтов для фосфорилирования такими протеинкиназами как РКС, фосфотирозинкиназа (РТК), протеинкиназа А (РКА) и казеинкиназа II (СКП). Для изучения влияния фосфорилированного статуса этих сайтов на внутриклеточную динамику Sesn2, была изготовлена серия локализационных репортеров, экспрессирующих белок Sesn2, в который были введены точечные мутации двух типов по каждой категории сайтов фосфорилирования. Первый тип мутаций (РКСа, РКАа, СКИа, РТКа) имитировал
перманентно-фосфорилированное состояние сайта (замена Ser, Thr и Туг на Asp), а второй тип (PKCr, PKAr, СКИг, РТКг) имитировал нефосфорилированный белок (замена Ser или Thr на Ala; Туг на Cys или Phe) и делал сайт недоступным для фосфорилирования киназами.
Репортерные конструкции, экспрессирующие мутантные Sesn2, вводили в клетки RKO-NZ1, которые затем обрабатывали 5 пМ РМА в течение 8 часов, и измеряли активность фермента. Мутантные варианты Sesn2, содержащие перманентно активированные сайты фосфорилирования РТК, СКП и РКА, перемещались в ядро в ответ на обработку РМА аналогично нормальному Sesn2, причем, перемещения мутанта РТКа также оказалось чувствительным к ингибитору РКС BMI. В то же время, перманентно-репрессированные по сайтам РТК и РКС мутантные Sesn2, а также Sesn2, перманентно-активированный по сайтам РКС, переходили в ядро под действием РМА гораздо более интенсивно, причем, переход сохранял чувствительность к обработке BMI (рис. 22).
4,5 4
3,5 3
2,5 2
1,5
РТКа
РТКа BMI И РТКг
РТКг BMI
РКСа
РКСа BMI
іїРКСг
аPKCrBMI
В95Р
95PBMI
CIIKa
РКАа
Контроль
8ч РМА
Рис. 22. Динамика перемещения в ядро мутантных Scsn2, содержащих перманентно-активированные сайты фосфорилирования фосфотирозинкиназы (РТКа), протсинкиназы С (РКСа), казсинкипазы-2 (СКПа) и протсипкиназы А (РКАа), или перманентно-репрессированные сайты фосфорилирования фосфотирозинкиназы (РТКг) и протсинкиназы С (PKCr), и контрольного Scsn2 (95Р), после культивации в течение 8 часов с 5 пМ РМА. Параллельно, репортерные линии на некоторые мутанты и контрольный Sesn2 были обработаны ингибитором протсинкиназы С ВМІ (РТКа BMI, РТКг BMI, РКСа BMI, PKCr BMI, 95Р BMI).
Исходя из предположения, что Sesn2 переходит в ядро под действием прямого фосфорилирования при помощи, например, РКС, следовало бы ожидать, что РМА не будет оказывать существенного влияния на перемещения перманентно активированного мутантного Sesn2, поскольку он будет располагаться в ядре даже в отсутствие сигнальных воздействий. Однако, несмотря на высокую кратнность перехода отдельных мутантных Sesn2 в ядро, их абсолютные концентрации в ядре могут быть незначительными, если
исходный уровень экспрессии данного мутанта ничтожен. Количественный анализ образцов белка из клеток, экспрессирующих различные варианты Sesn2 (иммуноблоттинг с антителами к с-тус с последующей денситометрией на инфракрасном сканнере Odyssey) выявил значительные количественные различия, вероятно указывающие на разницу в скорости их разрушения в клетке.
Полученные количественные данные были использованы для нормализации значений активности покализационного репортера. Скорректированные данные указывают, что мутанты PTKr-Sesn2 и PKCr-Sesn2, несмотря на впечатляющую динамику перемещения в ядро под действием РМА, практически отсутствуют в ядре как в спокойном состоянии, так и после обработки РМА. Также довольно низки количества локализованных в ядре мутантов CKIIa-Sesn2 и PKAa-Sesn2. Мутант PKCa-Sesn2, напротив, содержится в ядре в спокойном состоянии в количестве, аналогичном количеству нормального Sesn2, а при обработке РМА накапливается там гораздо интенсивнее, чем нормальный Sesn2 (рис. 23).
Контроль
8ч РМА
Рис. 23. Абсолютные значения активности [З-галактозидазы в репортерах с мутантами Scsn2, из предыдущего опыта. См. рис. 22.
На основании представленных данных можно сделать вывод о том, что фосфорилирование сайтов РКС, а также, в той или иной степени, сайтов других киназ, влияет на перемещение Sesn2 в ядро. Однако фосфорилирование этих сайтов не является единственным необходимым условием, поскольку перемещение мутантных белков продолжает зависеть от ингибитора РКС.
Заключение
Разработанная система локализационных репортеров является мощным инструментом для определения изменений внутриклеточной локализации белков. Широкий динамический диапазон и высокая чувствительность позволяют использовать локализационный репортер для определения небольших, относительно общего количества, перемещений исследуемого белка внутри клетки. Изучение внутриклеточной динамики белка Sesn2, являющегося компонентом клеточной защиты от переокисления, показало, что в ответ на окислительный стресс, комплекс белков, в который входит Sesn2, передислоцируется из цитоплазмы в ядро. Возможно, транслокация в ядро способствует повышению устойчивости компонентов ядра к окислению под действием сигнальных молекул Нг02. Важную роль в процессе перехода белка Sesn2 из цитоплазмы в ядро играет протеинкиназа С. Sesn2 содержит три сайта фосфорилирования при помощи РКС. Фосфорилирование этих сайтов увеличивает интенсивность перехода Sesn2 из цитоплазмы в ядро в ответ на окислительный стресс, однако само по себе фосфорилирование недостаточно для транслокации Sesn2 в ядро. Весьма вероятно, что для перемещения требуется также фосфорилирование других белков, возможно входящих в комплекс с Sesn2. В настоящий момент детали процесса, приводящего к перемещению Sesn2 в ядро, неизвестны и требуют дальнейшего изучения.
Выводы
Сконструирована репортерная система для определения внутриклеточных перемещений исследуемого белка, основанная на эффекте а-комплементации р-галактозидазы
Получены клоны клеток линии RKO, стабильно экспрессирующие компоненты локализационной системы. Возможности репортерной системы испытаны на примере флуоресцентного белка GFP и транскрипционного фактора FOX03A.
При исследовании антиоксидантного белка Sesn2 установлено, что повышение внутриклеточных уровней ROS приводит к перемещению Sesn2 из цитоплазмы в ядро, что может способствовать защите генома от окислительных повреждений.
Установлено, что активация протеинкиназы С вызывает переход Sesn2 из цитоплазмы в ядро, а ее ингибирование предотвращает такой переход. Фосфорилирование сайтов РКС в структуре Sesn2 усиливает его переход в ядро в ответ на стресс, а предотвращение фосфорилирования по этим сайтам снижает количество Sesn2 в ядре.
Предложена модель, объясняющая механизм перемещения Sesn2 в ядро в ответ на внешние стимулы, Под влиянием активации мембранных рецепторов происходит стимуляция протеинкиназы С, которая, в свою очередь, стимулирует активность NOX и продукцию соединений активного кислорода. Одновременно протеинкиназа С стимулирует переход Sesn2 в ядро, тем самым настраивая ядерные антиоксидантные системы перед ожидаемым повышением уровня соединений активного кислорода.
