Содержание к диссертации
Введение
Цель работы 7
Основные задачи работы 7
Положения, выносимые на защиту 8
Литературный обзор 9
Локирование целой молекулы: виртуальный скрининг 10
Фрагментарные методы: создание лигандов de novo 14
Методы оптимизации счета 17
Материалы и методы 19
Аппаратная база работы 19
Программная база работы 19
Оптимизация комплекса двух молекул .19
Оптимизация конформации лиганда при поиске в базах данных 21
Моделирование полного цитохрома Ь5 22
QSAR модели и их параметры 23
Параметры работы программы DockSearch 24
Информационные ресурсы, использованные в работе .26
Результаты и обсуждение 30
Программа DockSearch 30
Оценка эффективности программы DockSearch 34
Уточнение результатов докинга 35
Полностью автоматизированная процедура локирования 42
Моделирование комплекса цитохром Р4 50сат - цитохром Ь5
4 4 Моделирования полного цитохрома Ь5 4 4
Моделирование комплексов цитохромов Р450сат и Ь5 50
Применение программы DoсkSеагch при поиске низкомолекулярных лигандов для ферментов
1. Поиск лигандов к ферментам с известной трехмерной структурой .60
2. Поиск лигандов к моноаминоксидазе А - ферменту с неизвестной трехмерной структурой 8 0
Заключение 84
Выводы 87
Список литературы
- Литературный обзор
- Фрагментарные методы: создание лигандов de novo
- QSAR модели и их параметры
- Моделирования полного цитохрома
Введение к работе
Введение. Актуальность темы
Лекарственные соединения управляют биохимическими процессами, как правило, взаимодействуя с макромолекулами-мишенями: белками и нуклеиновыми кислотами. Образование комплексов лекарство-мишень характерно для действия биологически активных соединений разного типа, в том числе активаторов и ингибиторов различных ферментов. В таких комплексах молекулы-лиганды пространственно (геометрически) комплементарны участку связывания на поверхности белка и удерживаются на нем благодаря кулоновскому и/или вандерваальсову взаимодействию, водородным связям и т.п.
Создание новых лекарственных препаратов с необходимостью включает поиск соединений, которые комплементарны функционально важным участкам белков. Современные компьютеры позволяют осуществить такой поиск посредством вычислительного эксперимента, суть которого - в своего рода «прилаживании» пространственных образов лиганда и белка. Эта процедура называется геометрическим докингом. Наиболее адекватным подходом при этом является использование данных о структуре белка, полученных рентгеноструктурным методом; в случае их отсутствия сведения о пространственном строении участка связывания (часто называемого рецепторним) могут быть получены путем анализа структуры уже известных эффективных лигандов.
Компьютерные программы, осуществляющие геометрический докинг, позволяют выявлять комплементарные молекулы в обширных базах химических структур, в том числе и в каталогах коммерчески доступных соединений. Однако известные программы этого типа далеки от идеала в отношении как скорости, так и точности.
Далее, пространственная комплементарность лиганда к рецепторному участку является необходимым, но далеко не всегда достаточным условием эффективного связывания. Поэтому геометрический докинг как средство поиска потенциальных лигандов среди десятков и сотен тысяч органических соединений должен сочетаться с оценкой энергии взаимодействия лиганда с белком, равно как и с процедурами, позволяющими в определенных пределах максимизировать эту энергию. Настоящая работа посвящена разработке оптимального алгоритма геометрического докинга, созданию на его основе программного обеспечения поиска потенциальных лигандов в базах химических структур, а также выработке методологии использования результатов докинга для оценки устойчивости соответствующих комплексов.
Поиск потенциальных низкомолекулярных лигандов - далеко не единственная область применения геометрического докинга. В частности, эта процедура может быть также использована для нахождения контактирующих участков при моделировании взаимодействия белковых молекул.
Цель работы
Разработка нового алгоритма геометрического докинга и его применени для моделирования межбелковых комплексов и поиска потенциальны низкомолекулярных белковых эффекторов.
Основные задачи работы
-
Разработка нового алгоритма геометрического докинга и создани на его основе соответствующего программного обеспечения.
-
Оптимизация процедуры максимизации энергии взаимодействия в систем лиганд-белок посредством конформационнои адаптации лиганда и уточнени его положения на рецепторном участке белка.
-
Выработка совокупности критериев для оценки эффективности лиганд белкового взаимодействия в комплексах, найденных в вычислительно эксперименте.
-
Создание программного комплекса, позволяющего быстро выявлят потенциальные лиганды белков в обширных базах, содержащих десятки тыся структур органических соединений.
-
Применение геометрического докинга для моделирования белок-белковь комплексов.
А. Моделирование комплекса цитохрома Р450сат с водорастворимк фрагментом цитохрома Ь5 (белок с известной трехмерной структурой) .
Б. Создание трехмерной модели полной структуры цитохрома і, и ег комплекса с цитохромом Р450сат.
6. Применение геометрического докинга для поиска потенциальны
лигандов для белков с известной трехмерной структурой (цитохром Р450сагг
субтилиэин, нейраминидаза), а также для белков, о строении рецепторної
участка которых можно судить по структуре их ингибиторов и субстрате
(моноаминооксидаза А).
Положения, выносимые на защиту
-
Разработан алгоритм геометрического докинга, обладают.^ существенными преимуществами по сравнению с описанными в литературе.
-
Создано программное обеспечение, позволяющее удовлєтворительї моделировать строение белок-белковых комплексов и быстро выявляв потенциальные эффекторы белков среди большого числа органических соединениі
Научная новизна и практическая ценность работы
Геометрический докинг - давно известный метод моделирования комплексе биологических макромолекул. В разных вариантах он входит как один і инструментов в состав различных специализированных программных комплексе (например, GRAMM [Vakser, 1995] или FLOG [Miller, 1994]). Темне менее существовала потребность в универсальной и автономно функционируют^
программе докинга, возможности которой отвечают уровню современной вычислительной техники.
Универсальность алгоритма докинга обеспечивается адекватностью описания молекул как совокупности атомов, а не их блоков, представленных сферами или эллипсоидами. Повышение точности описания молекул при докинге расширяет область его применения и улучшает надежность результатов, особенно для низкомолекулярных лигандов.
Автономность программы геометрического докинга позволяет более гибко сочетать его с различными методами оценки результатов, а также другими подходами и инструментами компьютерного моделирования биологически активных соединений.
Обоим этим требованиям удовлетворяет разработанная в настоящей работе программа геометрического докинга DockSearch, которая по вышеуказанным свойствам превосходит обычно используемую программу DOCK [Kuntz, 1982, 1994].
Возможности и ограничения программы DockSearch были изучены при решении различных проблем, связанных с моделированием межбелковых взаимодействий и поиском низкомолекулярных эффекторов ферментов. Разработана методология препроцессинга банков структур, выбора критериев селекции гипотетических комплексов, предложен и проверен новый метод моделирования участка связывания слепком с пространственно совмещенных известных лигандов.
В ходе тестирования и практического применения программы DockSearch предсказаны новые потенциальные лиганды субтилизина, нейраминидазы вируса гриппа, цитохрома Р450сат и монооксидазы А.
Апробация работы
Основные положения диссертации были доложены на следующих симпозиумах и конференциях:
International Conference on Molecular Structural Biology, Vienna, 1995.
3rd IUBMB Conference «Molecular Recognition», Singapore, 1995.
XI international Symposium on Microsomes and Drug Oxidation, Los Angeles, USA, 1996.
17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, USA, 1997.
NATO ASI Molecular & Applied Aspects of Oxidative Drug Metabolizing Enzymes. Tekirova, Turkey. 1997.
2nd International Conference on Molecular Structural Biology, Vienna,
1997.
Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лабораторий НИИ Биомедицинской химии РАМН 30 сентября 1998 года. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы
Литературный обзор
Тогда как в пакете DOCK для небольших молекул предполагается только жесткая конформация, в ряде работ до некоторой степени принимается во внимание конформационная гибкость лиганда [Leach, 1992]. В данной процедуре сначала некая выбранная жесткая часть (якорный фрагмент) молекулы лиганда располагается в месте связывания, а затем генерируются и кластеризуются возможные ориентации гибких частей. В конечном счете, отбираются представители из каждого кластера. Подобный анализ исспользуется в качестве исходной точки для оценки того, как конформационная изменчивость лиганда может влиять на процесс связывания.
Другой подход к описанию места связывания в молекуле белка был предложен группой Рут Нусинов [Fischer, 1995; Sandak 1995]. Набор критических узлов, сформированный из впадин, выпуклостей и седловин на молекулярной поверхности белка и его потенциального лиганда, используется для определения вероятных соответствий между молекулами. Этот метод использует технику геометрического перемешивания (рандомизации) , применяемую в технологиях компьютерной визуализации, и большей частью приспособлен для стыковки поверхностей в крупных системах. Также существует подход который локир\ ет молек\ ля]эные поверхности основываясь на совмещении решеточных моделей методом наименьших квадратов [Bacon 1 9 92] Точечная решеточная модегть именл/етулая па\/тиной гтоинимает и скрытых областей поверхности. Тестовые вычисления демонстрируют эффективность методики. Для вычисления максимального числа соответствий между точками поверхности рецептора и лиганда также использовалась теория графов [Kasinos, 1992]. Идея использования исключительно стерических критериев путем формирования матриц представления молекулярных поверхностей в виде двухмерных решеток позволяет проводить исчерпывающий анализ возможной ориентации белка, выявляя подматрицы согласования [Helmer-Citterich, 1994; Walls,1992].
В вопросах решения проблем межмолекулярного соответствия весьма перспективна программа GRAMM, предлагающая некоторые интересные альтернативы. В ее основу положено сглаживание функции энергии межмолекулярного взаимодействия путем варьирования атом-атомных потенциалов, что позволяет учитывать масштаб стерических препятствий в самом начале процесса. Этот способ не требует дополнительного описания места связывания, необходимы только координаты лиганда и мишени [Katchalski-Katzir, 1992; Vakser, 1994; Vakser, 1995; Vakser, 1996a; Vakser, 1996b].
В последние годы все более многочисленны попытки учета гибкости лигандов. Программа FLOG [Miller, 1994], развившаяся из DOCK, учитывает гибкость лигандов путем использования серии конформеров, которые для каждой молекулы хранятся в базе данных. Описывается только один, получивший наилучшую оценку, конформер лиганда. FLOG использует концепцию критических точек, где используются определенные центры строго соответствующие атомам лиганда. FLOG имеет также несколько других особенностей, изначально отличающих его от DOCK. Однако по многим особенностям функционирования самые новые реализации DOCK эквивалентны FLOG.
Существует целый ряд других подходов, рассматривающих конформационную вариабельность лиганда. Например, предложен метод, где вероятные способы связывания находятся и оцениваются с точки зрения образования водородных связей [Mizutani, 1994]. Рассчитываются и рассматриваются все модели взаимодействия для всех конформаций лиганда, после оценки строения моделей выбирается лиганд в конформации с наилучшими параметрами. Другая программа, GREEN, опирается на метод построения решеточных моделей и разработана той же группой. GREEN имеет многочисленные встроенные функции для минимизации и покомпонентного анализа энергии, существенно облегчающие процесс локирования [Tomioka, 1994].
Разрабатываются подходы и с использованием более сложных систем, включая методы основанные на технологии виртуальной реальности. Пользовательский интерфейс STALK программы CAVEAT [Lauri, 1994] является системой виртуальной реальности, позволяет визуализировать процесс оптимизации и разрешает пользователю напрямую взаимодействовать с алгоритмом путем изменения параметров. Autodock использует протокол оценки решеточных моделей в сочетании с моделированием отжига для конформационного поиска. Основное его преимущество - использование метода Монте-Карло при моделировании отжига, что позволяет исследовать возможные варианты взаимодействии лигандов с молекулой мишенью [Morris, 1996] Docking-d представляет собой инструмент, разработанный как часть большого программного пакета для вычисления и предсказания взаимодействия рецептора с лигандом. Эта программа использует технологии визуализации сходные с теми которые применяет Nussinov и оценочные функции использующие параметры LUDI [Rarey 1996]
Были сделаны попытки свести описание места связывания к отдельным фармакофорным точкам, и использовать расположение этих точек для поиска потенциальных лигандов. Первоначально данная идея была внедрена компанией Chemical Design в программе ChemProtein, а недавно она была использована другой группой как часть пакета для проектирования лекарств Prometheus [Clark, 1996].
В рамках всех вышеописанных методов, используется жесткая конформация рецептора, и осуществляются некоторые попытки учесть гибкость малых молекул либо путем их оптимизации в пределах места связывания, либо путем использования многочисленных заранее рассчитанных конформеров. Несмотря на то, что разработано большое число методов предсказания взаимодействия между макромолекулой и небольшим лигандом, было предпринято очень мало попыток учесть конформационную подвижность элементов места связывания макромолекулы. Одна из подобных попыток предполагает создание набора различных конформационных состояний белка-мишени в процессе проведения молекулярной динамики и реализована в программе SYSDOC [Pang, 1994] . Также представляется весьма многообещающим подход, где возможные конформации боковых цепей аминокислот варьируются на основании закономерностей, установленных для них по кристаллографическим данным. Этот способ также предполагает гибкость рассматриваемого лиганда, опираясь при этом на теоретический конформационный анализ [Leach, 1994].
Фрагментарные методы: создание лигандов de novo
Видно, что все вычисления простые и не требуют сложного математического аппарата, но объем вычислений огромен, а в большинстве случаев "хороших" гипотез значительно меньше, чем "плохих". Для сокращения времени счета в схему вычислений были введены некоторые изменения. Во-первых, величина скрытой поверхности оценивалась не для всего комплекса, а только для "закрытого" участка лиганда, так как, как правило, эта молекула эдзньше мишени Оценка же полной скрытой поверхности производилась только для тех гипотетических комплексов, у которых величина поверхности "закрытого" участка, лиганда была достаточно велика (как правило, 8 0% от максимально полученной) ((ис. б)) Во-вторых, для быстрой оценки величины скрытой поверхности и элиминации стерических пересечений использовалась решеточная модель представления молекулы мишени (рис. 7).
Результат фильтрации выборки по величине скрытой поверхности комплекса на примере локирования камфоры к цитохрому Р450сат и при различном уровне (60, 70, 90 % от максимально полученного значения соответственно). Красный - цитохром Р4 5 0сат, черный - гем, малиновый - камфора в реальном комплексе, фиолетовый - положение молекулы камфоры после процедуры локирования.
Зона недоступная атомам лиганда. п Зона прикрытия поверхностных точек лиганда. п Зона доступная атомам лиганда. Рисунок 7 Принципы решеточной аппроксимации мишени. Эффективность работы программы ОоскЗеагсЬ контролируется путем установки ряда параметров. Эти параметры включают в себя: число точек на поверхности атома (может принимать фиксированные значения 42, 162, 642); угол вращения молекулы лиганда вокруг каждой из осей (по умолчанию 20 градусов); шаг трехмерной решетки аппроксимации (по умолчанию 0.2 А); допустимая величина пенетрации (по умолчанию О А, не более величины разрешения трехмерной решетки аппроксимации); радиус сферы зонда (по умолчанию 1.4 А); радиус сферы атома (по умолчанию 1.6 А); уровень отбора гипотетических комплексов по величине скрытой поверхности лиганда (по умолчанию 80% от максимально полученного значения, но не менее 65%); уровень отбора гипотетических комплексов по величине скрытой поверхности комплекса (по умолчанию 90% от максимально полученного значения, но не менее 50%); допустимое среднеквадратичное отклонение расстояний между атомами лигандов в гипотетических комплексах в пределах одного кластера (по умолчанию 2 А).
Оценка эффективносии программы DockSearch
Для проверки эффективности программы ВоскЗеаrch в базе данных РОВ были отобраны 10 белок-лигандных комплексов с известной трехмерной структурой. Лиганды и белки при докинге сохраняли ту же конформацию, что и в комплексах, а начальная ориентация лигандов в подвижной системе координат была случайной.
Для оценки результатов докинга гипотетические комплексы ранжировались по доле скрытой поверхности, после чего определялось положение (ранг) комплекса, который по среднеквадратичной разности расстояний между тождественными атомами (RMSО) наиболее близок к реальному. Оказалось, что в большинстве случаев такой комплекс обладает наивысшим рангом (табл. 4), причем соответствующее ему значение КМЗВ, безусловно, можно считать удовлетворительным для предсказания. Таким образом, докинг позволил, как выявить участки связывания лигандов на белковой поверхности, так и определить расположение на них соответствующих лигандов.
Геометрическому докингу как методу определения структуры лиганд-белковых комплексов присущи некоторые недостатки. Во-первых, он предполагает неизменность конформаций лиганда и мишени, которые, в действительности, адаптируются друг к другу. Во-вторых, площадь скрытой поверхности отражает пространственную комплементарность взаимодействующих молекул, но не позволяет оценить энергию их взаимодействия и предсказать устойчивость комплексов. В принципе, может оказаться, что в реальном комплексе скрытая поверхность меньше максимально возможной, т.к. при этом более эффективно, скажем, кулоновское взаимодействие или образуются дополнительные водородные связи.
Перечисленные принципиальные недостатки удалось преодолеть, сочетая докинг с последующей оптимизацией структуры гипотетических комплексов при использовании в качестве критерия вычисленные значения энергии связывания. Выбор соответствующих процедур зависит от особенностей задачи. Так в данной работе, при моделировании комплекса двух белков при оптимизации учитывалась конформационная подвижность обоих белков (лиганда и мищени). Если лигандами служили низкомолекулярные соединения, то учитывалась только их конформационная подвижность.
Результаты оптимизация структуры гипотетических комплексов, описанных выше, приведены в таблице 5, где представлен ранг комплекса, наиболее близкого к реальному. Из таблицы видно, что гипотетические комплексы с наибольшей вычисленной энергией белок-лигандного взаимодействия чаще всего по структуре наиболее близки к реальным. На примере комплекса latp видно, что оптимизация позволяет увеличить вероятность предсказания "правильной" структуры гипотетического комплекса.
Объем вычислений, связанных с оптимизацией может быть сокращен, если предварительно отбросить гипотетические комплексы, заведомо неудачные по легко оцениваемому критерию, например, по энергии электростатического взаимодействия между лигандом и мишенью. Данные о такого рода фильтрации представлены в таблице 5.
QSAR модели и их параметры
Мембранный участок белка (остатки 104-126) был помещен в неполярный растворитель. Для этой цели были использованы молекулы бензола, предварительно приведенные в состояние равновесия молекулярной динамикой. Полученный комплекс был в свою очередь помещен в водное окружение, также уравновешенное молекулярной динамикой. Таким образом, была получена система, имитирующая положение молекулы цитохрома Ь в мембране (рис. 10) . Для нее было проведено моделирование молекулярной динамики на протяжении 600 пс с временньм шагом 1 фс. Фактическое равновесие системы было достигнуто после 500 пс (рис. 11) . сравнение значений среднеквадратичного отклонения положения атомов в пространстве для fl-b5t t-Щ и модели мембрансвязанного фрагмента показывает, что максимальные изменения имели место для последнего. Строение t-b$ изменилось в небольшой степени (RMSВ 2А) и стабилизировалось уже после 50 пс. Процедура минимизации энергии текущей конформации была выполнена после каждых 5 пс без остановки молекулярной динамики. Таким образом, были получены более 100 вероятных конформации fl-b5. Потенциальная энергия системы белок/бензол/вода была от -2,7-Ю 1 до -4,2-Ю ккал/моль. Конформация fl-bs в системе с минимальным значением потенциальной энергии представлена на рисунках 12 и 13. Эта же конформация fl-b$ использовалась в докинге
Результаты геометрического докинга цитохрома Ь5 и его водорастворимого фрагмента с цитохромом Р450сат приведены в таблице 9. Число гипотетических комплексов, найденных с помощью программы DoсkSеагсЬ, было значительно уменьшено с помощью описанных выше процедур кластеризации и фильтрации по энергии электростатического взаимодействия. Оставшиеся комплексы были подвергнуты оптимизации по энергии межбелкового взаимодействия [с помощью программного комплекса Зуbyl) с изменением конформации как лиганда, так и мишени.
Для двух полученных выборок гипотетических комплексов был рассчитан ряд дополнительных параметров. Зависимости этих параметров друг от друга были проанализированы и представлены на рисунках 16, 17, 18, 19, 20 и 21. Зависимость для ДЕ {в ккал/моль) от скрытой поверхности (S, число поверхностных точек) показана на рисунке 15. Очевидно, отсутствие корреляции между этими параметрами, так как значения S мало различаются и изменяются в пределах от 350 до 450. Это определяется основными принципами геометрического локирования и способом отбора результатов. В то же время ДЕ колеблется в широком диапазоне значений от -20 до -130 ккал/моль. Энергия взаимодействия ДЕ складывается из двух компонентов: вандерваальсовых взаимодействий (AEVDW) И электростатических взаимодействий (ДEQ) . Их значения для комплексов P450cam/t-Jb5 (А) и P450сат/г"1-Ь; (В) показаны на рисунке 16. Так как ДЕупи строго коррелирует со скрытой поверхностью комплекса, для обеих выборок это значение мало вариабельно, а все вариации ДЕ связаны с изменением электростатической энергии. Также были вычислены расстояния между атомами железа в гем группах Р450сат и b5l расстояния между самыми пространственно близкими атомами в гем группах Р450саго и Щ, а также число и энергия возможных водородных связей. Результаты для ДЕ и Fe-Fe расстояний, ДЕ и гем-гем расстояния, АЕ+ДЕнБ и Fe-Fe расстояний и ДЕ+ЛЕНВ и гем-гем расстояний представлены на рисунках 17, 18, 19 и 20 соответственно. Принимая во внимание нелинейную зависимость туннелирования электрона от расстояния, может быть предсказана вероятность электронного транспорта между молекулами. Десять лучших положений цитохрома bs с минимальными гем-гем расстояниями представлены на рисунке 21. На рисунке представлены только положения гем групп bs, раскрашенные согласно значениям ДЕ+ДЕцв После отбрасывания гипотетических комплексов, у которых полная энергия межбелкового взаимодействия [ДЕ) меньше -80 ккал/моль, оказалось, что оставшиеся комплексы могут быть объединены по сходству в строении в небольшое число групп: три - для водорастворимого фрагмента и всего две - для полного цитохрома bs (рис. 22 и 23) . Выбор между этими вариантами связывания не может быть пока осуществлен чисто вычислительными приемами, однако он вполне реален с помощью экспериментальных методов (ковалентные сшивки, флуоресцентные и/или ЭПР-метки) , поскольку каждому предполагаемому типу связывания соответствуют различные наборы аминокислотных остатков в цитохроме Р450сапк находящихся в контакте со связанными белковыми лигандами (табл . 10).
Тем не менее, полученные результаты позволяют предполагать, что комплексообразование возможно как в случае Р450сam/1-b5 так и P450cam/fl-b$. Однако возникающие комплексы могут отличаться позицией цитохрома bs в пространстве, ориентацией гем группы и энергией комплексообразования. Эти результаты в определенной мере совпадают с результатами, полученными в экспериментах на биосенсоре [табл. 11) . Если рассматривать энергетические параметры гипотетических комплексов, то формирование комплекса в случае P450cam/t-bj более вероятно. Из данных же эксперимента на биосенсоре видно что только в случае P450cam/t-b5 образуются реальные комплексы с Kd 10 8 М [Skvortsov, 1997]
Моделирования полного цитохрома
При поиске низкомолекулярных лигандов для белков наиболее значимым критерием отбора является расчетное значение константы диссоциации гипотетических комплексов. Методология использования этого критерия при скрининге большого числа структур с помощью геометрического докинга была выработана на примере цитохрома Р450сат - фермента, для которого известна как трехмерная структура, так и локализация участка связывания субстратов. Этот участок был принят в качестве области докинга потенциальных лигандов.
На первом этапе данные о трехмерной структуре и устойчивости 15 комплексов этого фермента с различными лигандами (табл. 13) были использованы для построения QSAR-модели с использованием в качестве независимых дескрипторов энергетических параметров hint_hh и hint_hb по Келлогу [Kellogg, 1992], вычисленных с помощью программы HINT [Kellogg, 1991]. В результате было получено регрессионное уравнение: lOOOpKd = -6315.51 + 2.32 hint_hh - 6.91 hint_hp Стандартная ошибка вычислений (SE): 7 84.029. Коэффициент множественной корреляции (R ) : 0.560.
Зависимость предсказанных значений Kd от экспериментально определенных для 15 известных лигандов представленна на рисунке 35.
С помощью программы DockSearch был выполнен поиск потенциальных лигандов среди соединений, представленных в базе MayBridge и содержащих 10-30 неводородных атомов. Из 20000 таких молекул только 6300 могут быть размещены во внутримолекулярной полости, представляющей собой участок связывания субстратов цитохрома Р450сат. Из 10 генерированных таким образом гипотетических комплексов были отобраны 77000 комплексов (-1900 молекул) у которых доля скрытой поверхности не менее 80% (рис. 36). Таблица 13. Известные лиганды цитохрома Р450сат и соответствующие им экспериментальные и предсказанные значения Kd.
Распределение величины скрытой поверхности для гипотетических комплексов цитохрома Р450сат с найденными лигандами. в среднем на каждую отобранную молекулу приходится несколько десятков "удачных" гипотетических комплексов. Эта, не вполне обычная ситуация возникает благодаря тому, что молекулы, по форме близкие к сфере, могут занимать в квазисферической полости многие положения, близкие по величине скрытой поверхности. Кроме того, многие молекулы обладают внутренней симметрией, которую не может распознать программа DockSearch. Чтобы сократить объем вычислений, максимальное число гипотетических комплексов на молекулу было ограничено 20, с наибольшей долей скрытой поверхности. После такой селекции общее число гипотетических комплексов сократилось до 23000.
Структура этих комплексов была оптимизирована с помощью программы LeapFrog, использующей вычисленное значение энергии лиганд-белкового взаимодействия (АЕ) в качестве оценочного критерия. Далее, из них были отобраны по одному "лучшему" комплексу для каждой молекулы при условии, что АЕ - 35 ккал/моль. В результате такой фильтрации осталось 863 комплекса (молекулы) (рис. 337)
Константы диссоциации этих комплексов, вычисленные с помощью регрессионного уравнения лежат в пределах 1мкМ К$ 8000 мкМ (рис. 38). Для 77 соединений предсказывается величина Kd 100 мкМ. Эти соединения предстоит испытать в качестве потенциальных лигандов цитохрома Р4 50сат, часть из них представлена на рисунке 39.
Описанный эксперимент дает возможность сравнить эффективность предложенного подхода с программой DOCK. В ходе аналогичной работы американских авторов [Ortiz de Montellano, 1996] в результате работы программы DOCK, после поиска в базе данных из 2500 0 соединений, были отобраны 500, которые были рассмотрены специалистами для вынесения решения о целесообразности экспериментальной проверки.
Геометрический докинг лигандов предполагает знание пространственной структуры (профиля) участка их связывания на поверхности молекулы-мишени. Косвенно об этом профиле можно судить, если известно достаточно много родственных по структуре соединений, предположительно однотипно связывающихся на этом участке. Для этого следует совместить молекулы в пространстве так, чтобы совпали общие для них структурные фрагменты, и изготовить объемный "слепок". Чем представительнее выборка молекул, тем больше оснований ожидать сходства между профилями "слепка" и реального участка связывания.
Этот подход лег в основу применения геометрического докинга для поиска новых лигандов моноаминоксидазы А - фермента, для которого получено множество синтетических конкурентных ингибиторов, но неизвестна трехмерная структура.
Для получения "слепка" участка связывания в моноаминоксидазе А был использован 41 известный ингибитор - производные индола и пиразинокарбазола. Эти молекулы были совмещены по общим для них индольным фрагментам (рис. 40) с помощью программы DISCO (программный комплекс Sybyl, Tripos).
