Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1. Метод оптического биосенсора для исследования взаимодействия биомолекул в реальном времени
2.2. Термодинамические параметры . 13
2.3. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов 15
2.3.1. Ингибиторы протеиназ из бобовых. Распространение и классификация 17
2.3.2. Семейство ингибитора Кунитца 18
2.3.3. Реактивные центры ингибиторов 21
2.3.4. Механиз действия ингибиторов 22
2.4. Калликреин-кининовая система 26
2.4.1. Калликреины 27
2.4.2. Прекалликреин и калликреин плазмы крови 28
2.4.3. Контактная система активации прекалликреина 30
2.4.4. Тканевые калликреины 37
2.5. Общие представления о молекулярной организации электрон-транспортных цепей в Р450-содержащих монооксигеназных системах 41
2.5.1. Молекулярная организация электрон-транспортной цепи Р450сат-содержащей монооксигеназной системы 43
2.6. Рапамицин и FKPB 48
2.6.1. Рапамицин и циклоспорины 48
2.6.2. Иммунофилины - FKPB 52
2.7. Актинопорины 53
2.7.1. Фармакологические исследования актинопоринов 54
2.7.2. Механизм действия актинопоринов 56
2.7.3. RTX-SII -актинопорин тропической актинии Radianthus macrodactylus 58
3. Материалы и методы 59
3.1. Процедура иммобилизации белка на подложку кюветы 60
3.1.1. Иммобилизация белка на карбоксиметилдекстрановую и аминосилановую кюветы 60
3.2. Расчет кинетических и термодинамических параметров образования и распада комплексов 74
4. Результаты исследования и их обсуждение 76
4.1. Анализ взаимодействия РРТ с STI 76
4.2. Анализ взаимодействия ВРС с ВРТ 82
4.3. Анализ взаимодействия РРК с STI 87
4.4. Анализ взаимодействия Р450 cam с t-, d-b5 91
4.5. Анализ взаимодействия FKPB с рапамицином 98
4.6. Анализ взаимодействия G-актина с RTX-SII 102
Заключение 106
Выводы 109
Благодарности 110
Список литературы 111
- Термодинамические параметры
- Контактная система активации прекалликреина
- Иммобилизация белка на карбоксиметилдекстрановую и аминосилановую кюветы
- Анализ взаимодействия РРТ с STI
Введение к работе
Актуальность
5 Актуальность исследования белок-белковых взаимодействий обусловлена их важной ролью в реализации жизненно-важных функций в организме. В то же время белок-белковые взаимодействия являются наиболее перспективной мишенью лекарственных веществ [Veselovsky et al., 2002]. При конструировании лекарственных форм нового поколения бывает необходимо выявить и охарактеризовать функциональные белковые комплексы с целью предсказания влияния лекарства на взаимодействие белков в этих комплексах.
Для адекватного описания белок-белкового взаимодействия важно знать кинетические параметры комплексообразования (константы скоростей образования и * распада комплексов), а также термодинамические параметры этих реакций (энтальпию и энтропию). Анализ значений термодинамических величин может раскрыть природу сил, связывающих молекулы друг с другом.
В настоящее время существуют различные методы определения характеристик комплексообразования: спектрофотометрический метод, метод изотермальной титрационной калориметрии, метод тушения флуоресценции и т.д. Однако, как правило, они не позволяют измерить одновременно все перечисленные выше параметры, либо обладают сравнительно невысокой чувствительностью [Данилов и соавт., 1986] и требуют большого количества образца. Новые методы, основанные на использовании нанотехнологии, такие как оптический биосенсор, позволяют быстро и с высокой точностью определять одновременно все кинетические характеристики: константы скоростей образования и распада комплексов, константы ассоциации и диссоциации, энтальпию и энтропию реакции комплексообразования [Stites, 1997]. Преимуществом метода оптического биосенсора также является то, что он позволяет регистрировать в реальном времени межмолекулярные взаимодействия без введения каких-либо меток в анализируемые молекулы. Этот метод характеризуется высокой чувствительностью (до 10"12 М) и быстротой анализа - несколько минут [Davies et al., 1994]. Метод оптического биосенсора в последнее время широко используется для определения кинетических параметров белок-белковых взаимодействий [Ivanov et al., 2001; Ivanov et al., 2001; Ivanov et al., 1997; Ivanov et al., 1999; Archakov and Ivanov, 1999; Морозов и соав., 1999; Ivanov et al., 2000; Ivanov et al., 1999].
В данной работе был использован метод оптического биосенсора для изучения белок-белковых взаимодействий следующих белковых пар: белки цитохром Р450-содержащей системы и протеолитические ферменты.
Протеолитические ферменты представляют огромный интерес для изучения, так как играют важную роль в обмене веществ всех живых организмов. Белки-ингибиторы протеолитических ферментов чрезвычайно широко распространены и встречаются у животных, растений и микроорганизмов. Имеются данные о том, что присутствие значительных количеств ингибиторов протеиназ в пищевых продуктах может играть благоприятную роль, например, препятствовать развитию ряда злокачественных образований, таких как рак простаты, прямой кишки, грудной полости и некоторых других [Troll and Wiesner, 1983]. Ингибиторы протеиназ могут играть важную роль в защите растений от поражения вредными насекомыми и патогенными микроорганизмами [Мосолов, 1983; Richardson, 1977]
Калликреин - кининовая система (ККС) является ключевой протеолитической системой, участвующей в регуляции широкого спектра физиологических функций организма и развитии многих патологических состояний. Этим объясняется большой интерес к структурно - функциональным особенностям и молекулярной биологии отдельных компонентов системы, молекулярным механизмам их взаимодействия и связи с другими системами регуляции. Накопленный в этой области за последние два десятилетия материал проясняет роль ККС в морфогенезе клеток, контроле тонуса гладкой мускулатуры некоторых органов, снижении кровяного давления, увеличения проницаемости сосудистой стенки, в том числе гематоэнцефалического барьера, развитии воспаления, трансформации клеток и других физиологических и патологических процессов [Яровая, 2000].
Актуальность изучения взаимодействия цитохром Р450-содержащих систем обусловлена их важной ролью в организме, так как эти системы ответственны за протекание ключевых биологических реакций, в которых участвуют посредством белок-белковых взаимодействий [Archakov and Bachmanova, 1990]. Цитохром Р450-содержащие монооксигеназные системы ответственны за метаболизм широкого класса эндогенных (холестерин, стероидные гормоны, простагладины) и экзогенных (лекарственные препараты, канцерогены, мутагены) веществ. Превращая исходный гидрофобный субстрат в более полярный продукт, цитохромы Р450 выполняют
, функцию по удалению неполярных молекул из организма и препятствуют накоплению токсичных гидрофобных соединений.
Циклоспорины - совершенно новый класс иммуносупрессивных препаратов. rs Это циклические пептиды, продуцируемые грибками. К белкам группы циклоспоринов относятся циклоспорин А, рапамицин, FK-506, они обладают сходным механизмом действия. Рапамицин - макролид, выделенный из Stephomyces higroscopicus. Рапамицин, лекарственный препарат, широко используемый для предотвращения отторжения трансплантированных органов, также он может найти применение и в онкологии. Как показали американские исследователи, его применение во время курса лучевой терапии опухолей головного мозга резко снижает вероятность прогрессирования опухолевого процесса и вероятность развития рецидивов [Зимин, 2002]. «. Цитолитические токсины (цитолизины) - это вещества белковой природы, которые при взаимодействии с цитоплазматической мембраной вызывают нарушение её структуры, приводящее к потере морфологической целостности клеток. В настоящее время возрос интерес к веществам, обладающим мембранотропным и/или цитостатическим действием, лежащим в основе противоопухолевого, кардиостимулирующего, дерматонекротического, антимикробного, антипаразитарного и других фармакологических свойств этих соединений, и в последнее десятилетие в изучении цитолизинов актиний наблюдается значительный прогресс [Anderluh, Macek, 2002].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью настоящей работы являлось создание стабильных белок-содержащих биочипов для определения с помощью оптического биосенсора кинетических и термодинамических параметров формирования и распада белок-белковых комплексов:
Трипсин/соевый ингибитор трипсина, а-химотрипсин/основной панкреатический ингибитор трипсина, « - калликреин/соевый ингибитор трипсина,
Р450 cam/t-b5, Р450 cam/d-b5, рапамицин/РК-связывающий белок, :* - G-aKTHH/RTX-S II.
ЗАДАЧИ РАБОТЫ:
Произвести экспериментальный подбор условий ковалентной иммобилизации каждого из белков-партнеров на подложке оптического биосенсора для создания стабильных биочипов с целью исследования взаимодействий белковых пар: трипсин/соевый ингибитор трипсина, а-химотрипсин/основной панкреатический ингибитор трипсина, калликреин/ соевого ингибитора трипсина, P450cam/t-b5, P450cam/d-b5, рапамицин/РК-связывающий белок, G-aKTHH/RTX-S II.
Осуществить подбор регенерационных буферов для полного распада комплексов, не приводящий к деградации иммобилизованного белка.
Разработать методику измерения и определить температурную зависимость констант скорости образования и распада белок-белковых комплексов с помощью оптического биосенсора и рассчитать термодинамические параметры формирования белковых комплексов.
Подтвердить теоретические представления о том, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары P450cam/t-b5, но не P450cam/d-b5.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА:
Разработана методика ковалентной иммобилизации на поверхности кюветы оптического биосенсора следующих белков: трипсина, соевого ингибитора трипсина, а-химотрипсина, основного панкреатического ингибитора трипсина, калликреина, P450cam, t-b5, d-b5, рапамицина, FK-связывающего белка, G-актина и RTX-S II.
Впервые измерены зависимости констант скорости образования и распада комплексов от температуры и рассчитаны константы равновесия, энтальпии и энтропии реакций комплексообразования P450cam/t-b5, рапамицин/РК-связывающий белок, G-aKTHH/RTX-S II.
Показано, что энтропийная составляющая играет ведущую роль в образовании комплексов: P450cam/t-b5, рапамицин/РК-связывающий белок, G-актин/RTX-S II.
Подтверждены теоретические представления о том, что стабильный комплекс может образовываться только в случае пары P450cam/t-b5, но не P450cam/d-b5.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ:
Созданы стабильные оптикобиосенсорные белок-содержащие биочипы, которые позволяют измерять кинетические характеристики белок-белковых взаимодействий.
Полученные температурные зависимости констант скоростей образования и распада комплексов могут быть использованы для проверки математических моделей, описывающих эти взаимодействия.
Измеренные кинетические и термодинамические параметры важны для поиска мишеней и конструирования лекарственных форм нового поколения.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Основные положения диссертации были представлены на следующих конференциях:
15th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation: Chemical Biology in the Postgenomic Era New Approaches and Applications (Mainz, Germany, 2004);
International Symposium "Nano and Giga Challenges in Microelectronics Research and Development Opportunities" (Cracow, Poland, 2004);
Региональная научная конференция "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии" (Владивосток, 2004);
14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics (Dallas, Texas, U.S.A., 2005); HUPO 4th Annual World Congress from Defining the Proteome to Understanding Function (Munich, Germany, 2005).
Работа выполнена в ГУ НИИ БМХ РАМН при финансовой поддержке гранта "Медицинские диагностические системы будущего", в рамках работы: "создание нового поколения биоиммуносенсоров и биочипов", грантов РФФИ ( № 05-04-48690 и научной школы № 325.2003.4), INTAS № 01-470, а также Janssen Research Foundation, Федеральной целевой программы: "Протеомика в медицине и биотехнологии (государственная поддержка протеомных исследований: нанобиотехнология и компьютерное конструирование лекарств)", контрактами с Федеральным агентством по науке и инновациям по теме лотов ЖС-13.5/002), ЖС-КП.6/003, ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы", а также грантом 1.2.29 ОАО МКНТ (2005 г). ^ СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.
Н.И. Раченкова, Ю.Д. Иванов, B.C. Скворцов, А.С. Иванов, А.А. Молнар, А.И. Арчаков, Уи Бон Уа. Исследование взаимодействия цитохромов Р450сат и Ь5 с і помощью метода оптического биосенсора и компьютерного моделирования.
Биомедицинская химия, 2005, т. 51, № 5, с. 501-512;
Н.И. Раченкова, Ю.Д. Иванов, А.А. Молнар, А.И. Арчаков. Исследование взаимодействия трипсина и соевого ингибитора трипсина с помощью метода оптического биосенсора. Биомедицинская химия, 2005, т. 51, № 6, с. 617-625;
Ivanov Yu.D., Konstantinova N.A., Svetlov S.K., Hui Bon Hoa G. and Archakov A.I. The optical biosensor study of redox partners' interactions in the P450cam system in hydroxylation conditions. 15th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation: Chemical Biology in the Postgenomic Era New Approaches and Applications. 4-9 July, > 2004. Mainz, Germany, p. 124;
Ivanov Yu.D., Konstantinova N.A., Gnedenko O.V., Lipov P.A., Viglinskaya A.O., Archakov A.I. Optical resonant mirror biosensor nanochips for investigation of cytochrome P450cam and P4502B4 monooxygenase systems. International Symposium "Nano and Giga Challenges in Microelectronics Research and Development Opportunities". 13-17 September, 2004. Cracow, Poland, p. 126;
Клышко E.B., Константинова Н.И., Иванов Ю.Д., Монастырская М.М., Киселева М.И., Козловская Э.П., Исследование межмолекулярного взаимодействия G-актина и актинопорина RTX-S II из актинии Radianthus macrodactylus. Региональная научная конференция "Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии". 2004. Владивосток, с. 57;
Ivanov Yu.D., Ivanov A.V., Kuznetsov V. Yu., Konstantinova N.A., Strushkevich N.V., Usanov S.A. and Archakov A.I. Nanospies trace the formation and decay of P450-contaning complexes. 14th International Conference on Cytochromes P450: Biochemistry, Biophysics and Bioinformatics. 31 May-5 June, 2005. Dallas, Texas, U.S.A., p. 150;
Ivanov Yu.D., Ivanov A.V., Gnedenko O.V., Konstantinova N.A., Pleshakova Т.О., я Svetlov S.K., Frantsuzov P.A. and Archakov A.I. AFM and Optical Biosensor Nanotechnology in Revelation of Protein Complexes. HUPO 4th Annual World Congress from Defining the Proteome to Understanding Function. 29 August - 1 September, 2005. Munich, Germany, p. 330.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Термодинамические параметры
Любая физическая величина, значение которой определяется термодинамическими свойствами системы в данный момент времени, то есть ее термодинамическим состоянием, независимо от того, как это состояние достигнуто, называется функцией состояния системы. Особую роль играют функции состояния, с помощью которых можно в явном виде выразить все термодинамические свойства системы. Такие функции называются характеристическими. Наиболее часто применяются пять характеристических функций: внутренняя энергия (U), энтропия (S), энтальпия (Н), энергия Гиббса (G), энергия Гельмгольца (А).
Термодинамика занимается количественным описанием изменений энергии и теплоты системы, связанных с достижением химического равновесия. Зная изменение термодинамических величин, таких, как И и S, можно предсказать пойдет ли в данных условиях реакция или нет, и описать состояние равновесия. Анализ значений термодинамических величин может раскрыть природу сил, связывающих молекулы друг с другом.
Наиболее серьезное ограничение при использовании положений классической термодинамики определяется тем, что эта наука всегда имеет дело с равновесным состоянием и не говорит о кинетики процессов. Отсюда иногда делают вывод, что термодинамика не имеет отношения к биохимии. Это, безусловно, не так; нам важно знать энергетические соотношения для биохимических реакций. Но нельзя утверждать, что термодинамические расчеты, выполненные для состояния равновесия, можно прямо перенести на случай стационарного состояния, которое характерно для живой клетки. [Мецлер, 1980].
Свободная энергия F = Е — TS складывается из энергии системы и ее энтропии S. В чем смысл вхождения в свободную энергию этой энтропии (в виде члена S)? В том, что — если посмотреть на exp[-F//c7], забыв о — то: exp[-(S)/kT\ = ехр[-(k\nV)/kT\ = V есть просто доступный объем, а он определяет число возможных состояний частицы в пространстве. Чем выше энтропия, тем больше это число состояний, тем вероятнее поэтому нахождение частицы именно в этом объеме. Величина F = Е — TS называется свободной энергией Гельмгольца. Ее просто и удобно вычислять, так как эта величина относится к системе, которая находится в замкнутом и неизменном объеме. Однако обычно на опыте измерения ведутся не при постоянном объеме V, а при постоянном внешнем давлении Р (например — при атмосферном давлении). В этом случае измеряется не изменение чистой энергии изучаемого вещества, а изменение его энтальпии H=E+PV: в изменение энтальпии Н, помимо собственно изменения энергии тела (), входит работа, совершенная против постоянного внешнего давления Р при изменении объема V этого тела. Несущественно различие между свободной энергией Гельмгольца F = Е— TS и свободной энергией Гиббса G = H—TS = (E+PV) — TS = F + PV. И то, и другое (и G, и F) можно именовать просто свободной энергией. Обсуждая процессы, протекающие в замкнутом объеме, следует употреблять буквы и F, а обсуждая процессы, протекающие при постоянном внешнем давлении — буквы Hv\G. И еще следует запомнить то, что равновесному, стабильному состоянию любой системы при заданной температуре (T=const) соответствует минимум величины F=E S, если равновесие устанавливается при фиксированном объеме, и минимум величины G - HTS, если оно устанавливается при фиксированном внешнем давлении. [Финкельштейн, 2000]. Энтальпия. Как показано выше, изменение внутренней энергии может быть обусловлено потоком тепла и увеличением объема. Для многих химических реакций, связанных с образованием газа, существенна функция состояния, зависящая от давления, определяемая следующим образом: H=U+pV, которую называют энтальпией системы. Вклад в изменение внутренней энергии, связанный с совершением работы, мал по сравнению с вкладом тепловых явлений. Поэтому данные о приросте внутренней энергии можно приравнивать энтальпии. Энтропия. Очень существенной, но часто неверно истолковываемой функцией состояния системы является энтропия - экстенсивная величина подобно внутренней энергии, энтальпии и объему. Изменение энтропии системы равно: AS=AQ/T. Согласно второму закону термодинамики, в изолированной системе общая энтропия не может убывать. В идеализированных обратимых экспериментах она может оставаться константой (будучи при этом функцией состояния), но во всех реальных процессах, происходящих в изолированных системах, энтропия стремиться к максимуму. Для получения экспериментальных результатов часто пользуются методом прямой каллориметрии. Различают два типа аппаратуры в прямой калориметрии -изотермическую и адиабатическую. Адиабатическая калориметрия менее употребима в биологических экспериментах, так как теплота, выделяемая организмами в таких калориметрах, увеличивает температуру среды, в то время как при нормальных условиях температура сохраняется постоянной или периодически меняется с известным временным ритмом [Зотин, 1976]. Белки-ингибиторы составляют особую группу белков растений, объединяемых общей способностью образовывать с различными ферментами стехиометрические белок-белковые комплексы, что приводит к конкурентному ингибированию 5 каталитической активности. Среди различных белков-ингибиторов наиболее распространенными и в наибольшей степени изученными являются ингибиторы протеолитических ферментов и ингибиторы а-амилаз [Мосолов, 1983; Garcia-Olmedo І et al., 1987; Richardson, 1977; Richardson, 1981] Первое сообщение о наличии ингибиторов протеиназ в растениях относится к 1938 году, когда было показано, что водный экстракт из соевой муки подавляет способность трипсина гидролизовать желатину [Нортроп, 1950]. Белок, ответственный за эту активность, был подвергнут частичной очистке в работах Баумана [Bowman, 1946] и первый высоко очищенный кристалический ингибитор трипсина был выделен из бобов сои М. Кунитцем в 1945-1946 годах [Нортроп, 1950]. Начиная с этих первых исследованй, белки-ингибиторы протеиназ наиболее интенсивно изучались у основных культурных растений, являющихся главным источником пищевого и кормового белка, таких как злаки, бобовые и картофель. Это связано с тем, что многие, особенно ранние, работы по изучению ингибиторов протеолитических ферментов проводились с целью изучения их возможного влияния на питательную ценность растительных продуктов. Все ингибиторы сериновых протеиназ следуют единому стандартному механизму действия, существо которого состоит в том, что ингибитор выступает как высокоспецифичный субстрат фермента-мишени, подвергающийся ограниченному и очень медленному протеолизу. В результате вся система ведет себя таким образом, как будто бы свободный фермент и ингибитор находятся в простом равновесии с комплексом фермент/ингибитор. При этом на поверхности молекулы ингибитора располагается, по крайней мере, одна реактивная пептидная связь (Р1-Р11), которая взаимодействует с активным центром фермента [Laskowski, Kato, 1980]. Указанные представления о механизме взаимодействия ингибиторе с сериновыми протеиназами подтверждаются результатами кристаллографических исследований трехмерных структур комплексов протеиназа/ингибитор [Read, James, 1986].
Контактная система активации прекалликреина
В настоящее время детально расшифрован молекулярный механизм активации плазменного прекалликреина в так называемой "контактной системе активации" (КСА), которая вызывает сложную серию реакций, запускающих протеолитические системы плазмы крови, ответственные за процессы адаптации и защиты, такие как гемокоагуляция, фибринолиз, комплемент, калликреин - кининовая и ренин -ангиотензиновая. В контактной системе участвует четыре белка: прекалликреин (ПК), факторы XII и XI гемокоагуляции и ВМК. Механизм взаимодействия этих белков изучен в различных условиях: на чужеродной активирующей анионной поверхности, на анионной поверхности поврежденного эндотелия, на коллагене, кристаллах уратов и других биологических структурах. На поверхности сорбируются циркулирующие в кровотоке биомолекулярные комплексы ВМК и ПК, ВМК и фактора XI, а также отдельно XII фактор гемокоагуляции [Colman, 1996]. Сорбция ПК и фактора XI осуществляется через ВМК, который связывается с анионной поверхностью катионным участком расположенным в D5 (рис. 4) и является своеобразным якорем для комплексированных с ним зимогенов; XII фактор свертывания имеет центры связывания в N - концевой области молекулы [Schmaier et al, 1987; DeLa Cadena et al, 1992; Scott etal, 1984; Colman, 1984]
В результате на активирующей поверхности формируется ансамбль из 4-х белков с взаимной ориентацией молекул и их локальной концентрацией, обеспечивающих высокую скорость процесса активации зимогенов [Colman, 1984; Davie et al, 1991]. Изучены количественные характеристики белок - белкового взаимодействия участников контактной активации, и аминокислотные последовательности, обеспечивающие связывание ВМК и ПК (рис. 4.), ВМК и фактора XI. Молекула фактора XI представляет собой зеркальный димер очень сходных по структуре с прекалликреином субъединиц [Retxios et al, 1987]. Из рисунка 4 видно, что центры связывания находятся в легкой цепи ВМК и тяжелой цепи ПК. Показано, что взаимодействие между этими цепями не зависит от дополнительной белковой структуры молекул ВМК и ПК (или К), т.е. возникает специфическое неэнзиматическое связывание указанных центров этих белков [Retxios et al, 1987; Tayeh et al, 1985; Hojima et al, 1983]. Однако, обе цепи калликреина необходимы для полной активации фактора XII и расщепления ВМК; при гидролизе лишь одной связи в тяжелой цепи калликреина скорости обеих реакций резко снижаются [Hojima et al, 1983; DeLa Cadena et al, 1974; Page et al, 1994].
Многочисленные исследования контактной фазы активации ПК, XII и XI факторов гемокоагуляции позволили расшифровать последовательность событий в этом процессе и постулировать его биологическое значение. Есть основания полагать, что фактор XII (зимоген) при адсорбции на поверхности в присутствии ВМК подвергается активации, связанной со ступенчатыми конформационными изменениями, приводящими к экспонированию активного центра в зимогене и формированию активной формы фактора Xlla [Stadnicki et al, 1996; Scott et al, 1984].
Небольшое количество фактора Xlla активируют плазменный ПК в калликреин и фактор XI в фактор Xla. Калликреин путем расщепления ВМК освобождает брадикинин и образует активный кофактор ВМК(а), при этом возрастает скорость активации зимогенов контактной системы [Stadnicki et al, 1996; Fujikawa, Davie, 1981]. Калликреин, являясь наиболее эффективным активатором фактора XII, осуществляет протеолитическую активацию последнего в две активные формы: аХИа и ЬХИа. аХПа состоит из двух цепей, связанных дисульфидной связью, и образуется путем гидролиза одной пептидной связи (арг353 и вал354), в предшественнике без изменения его молекулярной массы [Dunn, Kaplan, 1982]. ЬХИа формируется в результате гидролиза еще одной пептидной связи (арг334 - асп335), при этом отщепляется легкая цепь фермента, несущая активный центр (с небольшим фрагментом тяжелой цепи) в результате чего из молекулы предшественника в 80 кДа образуется молекула ЬХИа с молекулярной массой 30 кДа [Tans, Rosing, 1987; Scott et al, 1985]. ЬХИа является наиболее эффективным активатором прекалликреина, а аХИа - фактора XI [Scott et al, 1985]. Известно также, что связанные с поверхностью калликреин и факторы Xla и аХИа менее доступны действию ингибиторов [Stadnicki et al, 1996; Fujikawa, Davie, 1981], поэтому реципрокный активирующий механизм является решающим в системе контактной активации. Взаимоактивация ПК и фактора XII приводит к ускорению и распространению процесса их активации. Фактор Х1а может прерывать каскад контактной системы активации зимогенов путем гидролиза молекулы ВМК в зоне домена, связывающегося с поверхностью [Nuigens et al, 1989], при этом ВМК лишается своей кофакторной функции.
Наиболее трудно объяснимым в системе контактной активации является тот факт, что фактор ХИа, фермент первого этапа каскада активации зимогенов, ответственен за активацию собственного активатора. Существует несколько версий для объяснения этого парадокса, которые сводятся главным образом к стремлению понять каким образом инициируется процесс взаимоактивации факторов XII и ПК. Основываясь на наблюдениях [Tans, Rosing, 1987; Scott et al, 1985], можно предположить автоактивацию фактора XII в присутствии анионной поверхности следовыми количествами фактора ХИа всегда присутствующими в крови. Можно также полагать, опираясь на теоретические соображения, что конформационные изменения при связывании с поверхностью нативной молекулы фактора XII приводят к проявлению слабой каталитической активности зимогена, как это известно для трипсиногена [Miles et al, 1983]. Такие конформационные изменения могут так же увеличивать чувствительность фактора XII к протеолизу калликреином или фактором ХИа [Miles et al, 1983; Scott et al, 1985]. В подтверждение этой теории было продемонстрировано индуцирование активации фактора XII в очищенной системе под действием моноклональных антител, связывающихся с зимогеном в районе тяжелой цепи молекулы [Miles et al, 1983; Ichinose et al, 1986]. He исключена возможность активации фактора XII под действием небольших количеств калликреина или других содержащихся в плазме и клетках крови неизвестных протеиназ, активирующих фактор XII или ПК.
Таким образом, увеличение относительной доступности субстратов, связанных с поверхностью в оптимально сориентированном микроокружении, а также оптимальная локальная концентрация всех участников контактной системы обеспечивают высокую скорость активации зимогенов и изменяют баланс между активацией протеиназ и их ингибированием в пользу активации.
В настоящее время контактная система активации (КСА) рассматривается как триггерный механизм, запускающий активацию всех пяти протеолитических систем плазмы крови: свертывание, фибринолиз, комплемент, а так же калликреин-кининовую и ренин-ангиотензиновую, кооперативное действие которых обеспечивает процессы адаптации и защиты организма.
Иммобилизация белка на карбоксиметилдекстрановую и аминосилановую кюветы
Актинии, относящиеся к типу кишечнополостных, являются богатейшим источником биологически активных соединений полипептидной природы, таких как нейро- и цитотоксины, протеолитические ферменты, ингибиторы протеиназ [Орлов, Гелашвили, 1985; Turk, 1991; Norton, 1998]. Нейротоксины являются модуляторами и блокаторами Na+ и \С каналов и используются в качестве инструментов в нейрофизиологических и фармакологических исследованиях. Цитолитические токсины (цитолизины) - это вещества белковой природы, которые при взаимодействии с цитоплазматической мембраной вызывают нарушение её структуры, приводящее к потере морфологической целостности клеток. В настоящее время возрос интерес к веществам, обладающим мембранотропным и/или цитостатическим действием, лежащим в основе противоопухолевого, кардиостимулирующего, дерматонекротического, антимикробного, антипаразитарного и других фармакологических свойств этих соединений, и в последнее десятилетие в изучении цитолизинов актиний наблюдается значительный прогресс [Anderluh, Macek, 2002].
Более чем из 30 видов актиний выделены и охарактеризованы цитолитические токсины, которые на основании их первичной структуры и физико-химических свойств были разделены на 4 группы [Anderluh, Macek, 2002]. К первой (I) группе относятся низкомолекулярные цитолизины (5-8 кДа). Вторую (II) группу цитолизинов составляют полипептиды с молекулярной массой 20 кДа, так называемые актинопорины, выделенные из различных видов семейств Actiniidae и Stichodactylidae [Blanquet, 1968]. В третью (III) группу входят летальные 30-40 кДа цитолитические фосфолипазы А2 и подобные им по физико-химическим свойствам цитолизины без ферментативной активности. Единственным представителем четвертой (IV) группы цитолизинов является метридиолизин, выделенный из актинии Metridium senile, молекулярная масса которого составляет 80 кДа.
Наиболее многочисленна вторая группа - актинопорины. Начиная с первых работ, касающихся выделения этих полипептидов [Blanquet, 1968, Hessinger, 1973, Ferlan, 1974, Devlin, 1974], интерес к ним продолжает расти. По систематической IUBMB классификации актинопорины являются трансмембранными полипептидами, принадлежащими к семейству пороформирующих эквинатоксинов 1.С.38 [Saier, 2000]. Это однодоменные, не содержащие цистеин полипептиды с изоэлектрической точкой выше 9. Значительные достижения в их структурном и функциональном исследовании - это клонирование, кДНК секвенирование, функциональная экспрессия, а также установление пространственных структур эквинатоксина II из A. equina [Athanasiadis, A. et all, 2001] и стихолизина II из Stichodactyla helianthus [ Mancheno et al, 2003] і методом рентгеноструктурного анализа. Актинопорины являются прекрасными моделями для изучения мембранных липид-белковых взаимодействий, а также исследуются возможности их использования в качестве антиопухолевых и антипаразитарных агентов. 2.7.1. Фармакологические исследования актинопоринов Актинопорины, в зависимости от дозы и фармакологической системы, обладают широким спектром фармакологического действия. Они проявляют высокую летальную активность для млекопитающих: ЛДБО (В/В) ДЛЯ мышей находятся в диапазоне от 20 до 300 мкг/кг, [Turk, 1991; Macek, 1992]. Введение мышам летальной дозы актинопорина приводит к прекращению дыхания, коронарным вазоспазмам и кардиотоксии [Sket et al., 1974; Но et al., 1987; Drevensek et al., 2000]. Детальное исследование, проведенное [Bunc et al, 1999] по методу Лангендорфа, подтвердило, что Eqtll в концентрации 0,1-1 нМ обладает кардиотоксическим эффектом. Однако в небольших дозах (пМ) тенеброзины (актинопорины A. tenebrose) являются кардиостимуляторами [Thomson et al., 1987; Galettis, Norton, 1990]. He зависимо от проявления порообразующей активности, актинопорины селективно изменяют некоторые функции клеток; они ингибируют синаптосомальный выход у-аминомасляной кислоты и холина [Khoo et al., 1995], стимулируют экзоцитоз ъ глутаминовой кислоты и катехоламина [Migues et al., 1999; Ales et al., 2000], а также вызывают дегрануляцию тромбоцитов и гранулоцитов. [Bunc et al., 1994; Supuz et al., 2001]. Актинопорины обладают высокими цитотоксической и цитолитической активностью к ряду клеток и их везикулярным органеллам. В концентрациях меньших чем 0,1 нМ, Eqtll влияет на ультраструктуру V-79-379 клеток [Batista et al., 1987]. Иммуногенные свойства актинопоринов практически не изучены. Известна только одна работа по исследованию гуморальных и клеточных ответов на действие актинопоринов у млекопитающих. Обнаружено, что Eqtll, связанный с липидами с целью ингибирования его литической активности, вызывает выработку специфического IgG и активацию спленоцитов мыши [Narat, 1994]. Актинопорины (стихолизин и Eqtll), вследствие своих высоких цитолитической и цитотоксической активностей, использовались как активный компонент иммунотоксинов. Использование стихолизина для этой цели впервые было описано [Авилла и соавт., 1988]. Eqtll был химически связан с трансферрином (использовался как часть митотоксина). Результаты коньюгации оценивались на нормальных и опухолевых клетках человека, экспрессирующих трансферриновые рецепторы [Pederzolli, 1995]. Гибридные молекулы сохраняли значительную неспецифическую литическую активность. Антипаразитарная активность была выявлена для стихолизинов Stl, Stll и Eqtll [Tejuca, 1999]. Высокая чувствительность к актинопоринам обнаружена для паразита Giardia lamblia (синоним duodenalis). Большинство исследований указывает на то, что лейтмотив активности актинопоринов состоит в неспецифичном действии, приводящем к проницаемости мембраны, что может стимулировать различные токсические эффекты в клетках, типичные для других порообразующих токсинов. Фактически клеточная проницаемость, вызываемая актинопоринами, является следствием проявления глубоких изменений всей клетки и морфологии органелл, клеточной фрагментации [Batista et al., 1990; Batista и Jezernik, 1992], а также увеличения размера (набухания) клеток [Zorec et al., 1990; Meunier et al., 2000]. Большинство эффектов, проявляемых актинопоринами, является следствием увеличения проницаемости клеточных мембран для низкомолекулярных растворов, включая неорганические электролиты, в результате образования de novo пор в липидном бислое. При взаимодействии актинопоринов с эритроцитами наблюдается быстрый выход ионов калия с последующим высвобождением гемоглобина [Иванов и соавт., 1987; Macek et al., 1994], что является характеристикой коллоидно осмотического типа клеточного лизиса. При низких концентрациях актинопорины проявляют цитотоксический эффект, являясь медиаторами процессов, увеличивающих проникновение внеклеточных ионов кальция в цитозоль, вызвая инициацию разнообразных неконтролируемых внеклеточных процессов [Zorec et al., 1996].
Анализ взаимодействия РРТ с STI
Метод оптического биосенсора в последнее время широко используется для изучения белок-белковых взаимодействий [Ivanov et al, 2001а; Ivanov et al, 2001 в; Ivanov et al, 1997; Ivanov et al, 1999a; Archakov and Ivanov, 1999; Морозов и соав, 1999; Ivanov et al, 2000; Ivanov et al, 1999в]. Основное преимущество данного метода -анализ в реальном времени межмолекулярных взаимодействий без введения каких-либо меток в исследуемые молекулы.
Природа реакции трипсин-ингибитор к настоящему времени исследовалась достаточно подробно. STI имеет две дисульфидные связи, содержит S-S связи в положениях Cys(39)-Cys(86) и Cys(136)-Cys(145). В молекуле STI трипсинсвязывающий центр, в состав которого входит пептидная связь Arg(63)-lle(64) [Kortt, 1979], локализован внутри большой пептидной петли, образованной первым из указанных выше дисульфидных мостиков. В настоящее время установлено, что для существования прочного комплекса с ферментом ингибитора не требуется образования ковалентной связи между реагирующими белковыми молекулами. Конформация петли активного центра ингибитора высоко комплементарна поверхности фермента в области его активного центра [Read and James, 1986]. Анализ пространственной модели комплекса STI с трипсином показал, что между молекулами фермента и ингибитора образуется 9 водородных связей [Sweet et al, 1974]. Аминокислотные остатки STI, принимающие участие в образовании комплекса с ферментом, соответственно, следующие: Asn(13)-Gln(192), Ser(61)-Gly(216), Tyr(62)-Asn(97), Arg(63)-Asp(189), Arg(63)-Gly(193), Arg(63)-Ser(195), Arg(63)-Ser(214), Arg(65)-His(40), His(71)-His(57).
В данной работе исследовалось взаимодействие трипсина (PPT - porcine pancreatic trypsin) с соевым ингибитором трипсина (STI - soybean trypsin inhibitor) в реальном времени с помощью двухканального оптического биосенсора "резонансное зеркало" (RM-оптического биосенсора) [lAsys, 1993] с целью определения температурных зависимостей константы скорости ассоциации, константы скорости диссоциации реакции комплексообразования этих белков. Из них были рассчитаны термодинамические барьеры реакций образования и распада комплексов, энтропия и энтальпия реакции комплексообразования.
Исследование формирования комплексов PPT/STI с помощью оптического биосенсора было проведено в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 200 мМ KCI, 50 мМ СаСЬ, рН 5,0. Наблюдалось формирование комплексов PPT/STI при иммобилизации РРТ, эти комплексы были достаточно прочные, поэтому для проведения измерения концентрационной зависимости связывания на одной кювете необходимо было подобрать регенерационный буфер, который бы приводил к распаду комплексов на подложке оптического биосенсора. Нами было установлено, что комплексы PPTim/STI полностью распадаются при инкубации в 1 мМ HCI.
При иммобилизации STI образования комплексов PPT/STI не наблюдалось (рис. 20 А). Формирование комплексов PPT/STI при иммобилизации РРТ через их аминогруппы и отсутствие комплексообразования при иммобилизации STI означает, что аминогруппы STI важны для образования комплекса на подложке оптического биосенсора. Действительно, из данных рентгено-структурного анализа видно, что аминогруппы STI: Lys 76, Lys 145, Lys 165, Lys 178 находятся вблизи места связывания с трипсином [PDB], и иммобилизация STI через эти аминогруппы может блокировать образование комплекса. На рис. 22 Б приведены температурные зависимости связывания PPTjm/STI. Как видно, с ростом температуры от 15 до 40 С, наблюдается повышение амплитуды сигнала связывания. Это указывает на то, что константа равновесия реакции комплексообразования возрастает с ростом температуры. Из рис. 20 Б видно, что наблюдается повышение начального угла наклона кривой связывания с ростом температуры, это указывает на рост константы скорости формирования комплексов. Из таблице 4, где представлены рассчитанные значения кинетических параметров комплексообразования и рис. 21 А, видно, что наблюдается рост скорости формирования комплексов в диапазоне температур 15-40 С, а константа скорости диссоциации практически не изменяется. Так как константы коп растут с увеличением температуры, то это указывает на существование термодинамического барьера на стадии формирования комплекса PPTjm/STI (рис. 21 Б).
Рассчитанное из уравнения (3) значение активационного барьера реакции ассоциации AGon# составляет - 23,2 ккал/моль, а значение активационного барьера реакции диссоциации AG0ff#, рассчитанное из уравнения (4) составляет - 22,9 ккал/моль. Порядок константы скорости диссоциации комплексов PPTjm/STI составляет -6 10"5 с"1 , что соответствует времени жизни комплексов порядка 4-5 часов. Данные были обработаны с помощью программного обеспечения прибора (lAsys software, Fastfit). Из таблицы 4 и рисунке 21 Б видно, что константа равновесия Кр растет с ростом температуры в интервале (1,6 -3,3) 109 М 1. В таблице 4 представлены значения энергии Гиббса (AG) (рис. 22) реакции комплексообразования PPTjm/STI, рассчитанные из уравнения (7). Интервал этих значений составляет от (-12,1) до (-13,6) ккал/моль, что хорошо согласуется с литературными данными, где при температуре 25 С значение AG составляет (-12,3) ккал/моль [Stites, 1997]. Температурная зависимость AG реакции комплексообразования PPT/STI (рис.22) удовлетворительно аппроксимируется полиномом первого порядка и ее можно представить уравнением (8).
Из уравнения (8) были определены АН и AS, которые составляют 7,7±0,7 kcal/mol и 68,0±6,0 кал/(моль К), соответственно. Как видно, энтальпийный член положительный, энтропийный (TAS) также положительный. Отсюда, можно сделать вывод, что реакция комплексообразования PPTjm/STI эндотермическая, а вклад энтропийной составляющей гораздо больше, чем энтальпийной. Это согласуется с данными работы [Stites, 1997, Baugh and Trowbridge, 1972]. Кинетические константы, полученные нами: коп = 1,3 105 M"V1, koff =6,5 1 (Г5 с"1, Кр=2,0 109 М 1 при 25 С, хорошо согласуются с полученными раннее константами, которые были измерены другими методами [Song and Suh Se, 1998; Onesti et al., 1992].
