Содержание к диссертации
Введение
1 Дифференцировка и созревание В-лимфоцитов 10
2 Плазматические клетки и UPR (Unfolded Protein Response) 14
3 Механизмы транспорта белков из ЭР в аппарат Гольджи. 15
4 Рецепторы лейкоцитов и сигнальная трансдукция. 18
5 Лейкоцитарные Fc-рецепторы человека 21
6 FcR-подобные рецепторы человека 22
7 Характеристика внутриклеточного члена семейства FCRL - FCRLA 26
8 Связь FcR-подобных белков с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов 28
8.1 Общая характеристика патологий, связанных с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов 28
8.2 Ингибирующие рецепторы ЦТЛ, и их роль в патогенезе 29
8.3 FCRL6 - новый потенциально ингибирующий рецептор 33
2. Материалы и методы 35
2.1. Материалы и реактивы 35
2.2. Биологические материалы 36
2.3. Работа с эукариотическими клетками 36
2.3.1. Культивация эукариотических клеток 36
2.3.2. Выделение периферических мононуклеарных клеток крови 36
2.3.4 Химическая трансфекция эукариотических клеток. 37
2.4. Клонирование ДНК. 37
2.5 Выделение РНК и синтез кДНК 37
2.6 Электрофорез белков 39
2.6.1. Гель-электрофорез белков (ДСН-ПААГ) (Laemmli, 1970) 39
2.6.2. Синий нативный гель-электрофорез белковых комплексов (НC ПААГ). (по Shagger, 1991) 39
2.6.3. Гель-электрофорез белков (ДСН-ПААГ) во втором измерении, после СН-ПААГ 39
4 2.6.4. Окрашивание гелей при помощи нитрата серебра (по Shagger, 2006) 40
2.7. Иммуноферментный анализ (ИФА) (под ред. Фримеля, 1987) 40
2.8. Иммуноблоттинг 40
2.9. Иммунофлуоресцентной окрашивание и микроскопия 41
2.10 Дегликозилирование белков 42
2.11 Выделение микросом из клеток Bjab или лейкоцитов миндалины. 42
2.12 Мутагенез, с использованием мегапраймера по (Sarkar, 1990) 43
2.13 Аффинная очистка FCRLA-содержащих комплексов при помощи моноклональных антител. 43
2.14 Выделение FCRLA-содержащих комплексов при помощи тандемной аффинной очистки. 43
2.15 Масс-спектрометрический анализ белков FCRLA-содержащего комплекса. 44
2.16 Измерениие относительного уровня экспрессии РНК FCRL6 методом
RealTime PCR. 44
2.17 Анализ белков взаимодействующих с цитоплазматической частью FCRL6. 45
2.18 Анализ коэкспрессии FCRL6 с другими поверхностными маркерами методом проточной цитометрии . 46
3. Результаты и обсуждение 48
3.1 Изучение функциональной активности изоформ FCRLA 48
3.1.1 Анализ экспрессии изоформ FCRLA 48
3.1.2 Исследование внутриклеточной локализации изоформ FCRLA 51
3.1.4 Исследование статуса гликозилирования изоформ FCRLA. 54
3.1.5 Сигнальный пептид отщепляется в процессе созревания большинства изоформ FCRLA. 55
3.1.6 Характер взаимодействия четырехдоменной изоформы FCRLA с мембраной ЭР. 59
3.1.7 Идентификация участка FCRLA, определяющего его локализацию в ЭР. 60
3.1.8 Определение молекулярной массы FCRLA-содержащего комплекса . 64
3.1.9 Взаимодействие FCRLA с иммуноглобулинами. 65
3.1.10 Поиск белков, взаимодействующих с FCRLA. 67
3.1.11 Обсуждение роли FCRLA в клетке. 69
3.2 Изучение функциональных свойств рецептора лимфоцитов человека FCRL6 71
3.2.1 Сигнальные свойства FCRL6 на модели in vitro. 71
3.2.2 Экспрессия FCRL6 при ВИЧ инфекции 73
Выводы 79
Список литературы 80
Приложение 94
- Общая характеристика патологий, связанных с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов
- Синий нативный гель-электрофорез белковых комплексов (НC ПААГ). (по Shagger, 1991)
- Анализ коэкспрессии FCRL6 с другими поверхностными маркерами методом проточной цитометрии
- Определение молекулярной массы FCRLA-содержащего комплекса
Введение к работе
Актуальность исследования
В геноме человека имеются сотни генов, экспрессия которых ограничена клетками иммунной системы. Большая часть этих генов кодирует поверхностные рецепторы. Некоторые из них непосредственно вовлечены в распознавание чужеродных патогенов, другие участвуют в межклеточных взаимодействиях при развитии иммунного ответа и в транспорте клеток. Часть специфичных для иммунной системы генов кодирует внутриклеточные белки, ответственные за трансдукцию сигналов от поверхностных рецепторов и утилизацию антигена. Несмотря на впечатляющий прогресс иммунологии и иммуногенетики в течение последних пятидесяти лет, функция многих генов, специфично экспрессирующихся в клетках иммунной системы, остается неизвестной. В практическом плане, имеющиеся пробел в знаниях ограничивают возможности эффективно управлять иммунным ответом и лечить многие социально значимые заболевания.
Относительно недавно несколькими группами исследователей и, в том числе, лабораторией иммуногенетики, было описано семейство генов, кодирующих FcR-подобные белки лимфоцитов человека – FCRL (Fc Receptor-Like). Шесть членов этого семейства (FCRL1-FCRL6) являются трансмембранными рецепторами и экспрессируются на поверхности лимфоцитов. Еще два, FCRLA и FCRLB, являются внутриклеточными белками (Guselnikov, 2002 Mechetina, 2002 Ershova, 2005 Davis, 2007). FCRLA на высоком уровне экспрессируется в В-клетках зародышевых центров вторичных лимфоидных органов, где, как известно, происходит активация и дифференцировка В-лимфоцитов в плазматические клетки и В-клетки памяти. Сведения о функции FCRLA отсутствуют, однако профиль экспрессии, внутриклеточная локализация и гомология с Fс-рецепторами, позволяют предположить, что FCRLA участвует в процессах регуляции синтеза и созревания иммуноглобулинов. Уникальной в рамках FCRL-семейства особенностью FCRL6 является экспрессия на цитотоксических Т- и NK-лимфоцитов человека. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) являются основными эффекторами клеточного иммунного ответа, направленного на элиминацию вирус-инфицированных или злокачественно-трансформированных клеток. Для успешного функционирования клеточного звена иммунного ответа необходима точная регуляция степени активации ЦТЛ, так как избыточная или недостаточная активность этих клеток в скором времени приводит к развитию иммунопатологий. Прецизионная регуляция активности ЦТЛ осуществляется множеством активирующих и ингибирующих рецепторов, приобретенных иммуной системой в процессе эволюции.
FCRL6 является наименее изученным трансмембранным рецептором семейства FCRL, однако структура его цитоплазматической части и предварительные данные о характере его экспрессии, указывают на то что FCRL6 является ингибирующим рецептором.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является изучение функций FCRLA в В-лимфоцитах, а также исследование функциональной активности рецептора лимфоцитов человека FCRL6 в норме и при патологии. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить клеточные компартмент , в которых локализованы наиболее распространенные изоформы FCRLA, модификацию, локализацию и характер его мембранной ассоциации.
-
Установить участки FCRLA, влияющие на его локализацию и ответственные за взаимодействие с лигандами.
-
Идентифицировать белки, с которыми FCRLA взаимодействует внутри
-
Изучить фосфорилирование FCRL6 и особенности связывания этого клетки.
белка с сигнальными молекулами.
Научная новизна
Обнаружено, что FCRLA экспрессируется в виде нескольких изоформ,
отличающихся последовательностью сигнального пептида и количеством
доменов. Установлено, что четырехдоменные изоформы FCRLA с
коротким и длинным сигнальным пептидом, а также двухдоменная
изоформа с коротким сигнальным пептидом локализованы исключительно
в эндоплазматическом ретикулуме. Четырехдоменная изоформа FCRLA
ориентирована внутрилюменально и является мембранно-
ассоциированным белком. Идентифицирован домен FCRLA,
определяющий его локализацию в ЭР и показано, что свободный цистеин
FCRLA не участвует в локализации FCRLA в ЭР. Выяснен механизм,
который определяет локализацию двухдоменной изоформы FCRLA с
коротким сигнальным пептидом в ЭР. Показано, что в клеточной линии
BJAB, являющейся моделью активированных В-лимфоцитов, FCRLA
взаимодействует с -цепью IgM, BiP и MHC II. На основании полученных
нами данных, можно предположить, что FCRLA проявляет себя как
специфический B-лимфоцитарный шаперон/транспортер.
Обнаружено взаимодействие сигнальных белков SHP-1, SHP-2, SHIP-1, SHIP-2, Grb2 с ITIM мотивами в цитоплазматической области FCRL6 на модели in vitro. Показана роль отдельных аминокислотных остатков тирозина в этом взаимодействии. Выявлена отрицательная корреляция между уровнем экспрессии рецептора лимфоцитов человека FCRL6 и количеством CD4+ клеток у ВИЧ-инфицированных больных.
5. Проанализировать изменения экспрессии FCRL6 при хронических
вирусных инфекциях (на примере ВИЧ-инфекции).
Научно-практическая ценность
Полученные в настоящей работе данные дополняют современные представления о рецепторах В- и Т-лимфоцитов. Впервые получены сведения о внутриклеточной локализации FCRL , взаимодействующих с ним белках и влиянии сигнального пептида FCRLA на транспорт изоформ. Обнаруженная нами положительная корреляция между уровнем экспрессии FCRL6 и степенью прогрессии СПИДа, позволяет
рассматривать FCRL6 в качестве потенциального прогностического маркера тяжести ВИЧ-инфекции.
сновные положения диссертации, выносимые на защиту
Основная изоформа белка В-лимфоцитов человека FCRLA является резидентным фактором эндоплазматического ретикулума. FCRLA вместе с ВІР и -цепью HLA-DR входит в состав высокомолекулярного комплекса. FCRLA взаимодествует с -цепью IgM.
Белок Т-лимфоцитов человека FCRL6 взаимодействует с сигнальными белками SHP-1, SHP-2, SHIP-1 и SHIP-2. Экспрессия FCRL6 коррелирует
Материалы диссертации были представлены на:
13-м Международном иммунологическом конгрессе, Монреаль, Канада, 2006;
2-м Европейском конгрессе иммунологов, Берлин, Германия, 2009;
Отчетных сессиях аспирантов Института цитологии и генетики СО РАН в
2008 и 2009 годах.
Конференции «Фундаментальные науки — медицине», Новосибирск, 2011.
Вклад автора
Автором выполнена практически вся экспериментальная работа, описанная в диссертации, за исключением отдельных случаев создания реагентов или проведения анализов, что отражено в тексте работы. Подготовка публикаций проводилась автором совместно с А.В. Тараниным, Л. В. Мечетиной и А. М. Наякшиным.
Структура и объем диссертации
Общая характеристика патологий, связанных с истощением цитотоксических Т-лимфоцитов
Типичным примером дисфункции ЦТЛ является истощение Т-клеток. Исследования последних лет показали, что хроническая стадия таких заболеваний как инфекция вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита С (ВГС) и другие, связана не только и не столько с элиминацией цитотоксических клеток, сколько с нарушением их функциональной активности (Barber, етки переста т продуцировать стимул и теряют способность исто ённ х. аиболее вероятными представля тся следу ие причины. К известно, в процессе контакта АПК и Т-клетки происходит не только активация клетки но и взаимная активация АПК. Такой процесс, называемый также Т-“T-cell в ответ на соответству ий стимул и теря т способность синтезировать цитолитические агенты, такие как перфорин и гранзимы, несмотря на сохранение способности распознавать инфицированную клетку (Wherry, 2011). До сих пор нет полного понимания того, каким образом активированные клетки переходят в состояние истощённых. Наиболее вероятными представляются следующие причины. Как на Т-клетке и лигандов для них на К ( i , 2005). Биологический смысл этого заключается в том, чтобы контролировать активированную клетку при помощи ингибирующих рецепторов и предотвратить её гиперактивацию. Однако, при и годами, Т-клетка кой процесс, наз ваемый т licensing” вызывает некоторое повышение экспрессии ингибирующих рецепторов Т-клетке и лигандов для них на АПК (Kim, 2005). Биологический ингибиру их рецепторов и предотвратить её гиперакти хронической инфекции, которая может длиться месяцами и годами, Т-клетка слишком часто вступает в контакт с АПК, в результате чего экспрессия ингибирующих рецепторов на Т-клетке чрезмерно возрастает (Richter, 2012). Вторая причина развития истощения – это использование патогенами специальных механизмов для снижения экспрессии костимулирующих рецепторов. Так, например, Mycobacterium tuberculosis снижает у АПК экспрессию CD80, CD86, и CD40; ВИЧ снижает у заражённых Т-хелперов экспрессию CD40L; U. donovoni и L. chagasi заражает макрофаги и снижает в них экспрессию в дендритных клетках ш ющзом с одной с— апо В 2006 году учёные из группы R. Ahmed обнаружили, что функциональная случае хронического лимфоцитарного 29 CD40; ВИЧ снижает у заражённых Т-хелперов экспрессию CD40L; Leishmania CD80 и все апоптозу. 2006 году учёные из группы R. Ahmed обнаружили, что функциональная инактивация цитотоксических клеток в случае хроничесго лимфоцитарного хорио_„та у мышей связана с увеличением экспрессии этими клетками ингибирующего рецептора PD-1 (Barber, 2006). Блокирование взаимодействия рецептора PD-1 с его лигандом позволило восстановить функциональную 1.8.2 Ингибирующие рецепторы ЦТЛ, и их роль в патогенезе Среди ингибирующих Т-клеточных рецепторов наиболее известен PD-1, как потенциальная мишень для терапии хронических вирусных заболеваний. Однако целый ряд других ингибирующих рецепторов (CD160, BTLA, B7-H3, B7-H4, Tim-3, Lag-3 и др.) представляющих интерес как для фундаментальной науки, так и для медицины, изучен значительно слабее (Foell, 2007 Blackburn, 2009). CD160 и BTLA имеют одинаковый лиганд – HVEM, однако CD160 также взаимодействует с разнообразными молекулами семейства MHC I. CD160 в норме экспрессируется на NK-клетках и лишь небольшой популяции Т-лимфоцитов, а при хронических инфекциях обнаруживается уже на большой доле ЦТЛ. Недавно было показано, что при помощи CD160 можно точнее маркировать истощённые Т-клетки: транскрипционный профиль CD160-PD1+ клеток был ближе к профилю неистощенной клетки, чем транскрипционный профиль CD160+PD1+ клетки, Ингибирующие рецепторы - маркеры Т-клеточного истощения.
При определенных условиях эффекторные клетки переходят в состояние функционально истощенных, что сопровождается экспрессией на этих клетках ингибирующих рецепторов в различных комбинациях. Функционально активные клетки также экспрессируют ингибирующие рецепторы, но на меньшем уровне и с другими паттернами. (Vigano, 2012) ) (Vigano и в норме, бо на Т-клетках птор Ti -3, так е является маркером арактерн является (Shui, 2011). ля молекул B7- 3, B7- 4 и рецепторов семейства SL более характерно не прямое ингибирующее действие на Т-клетку, а модуляция сигналов, приводящая более того NK-клеточного созревания, а Т-клетках его экспрессия характерна для значительной доли исто ённ х клеток (Ndhlovu, 2012). СTLA-4 является одним из наиболее хорошо характеризованных рецепторов наряду с PD-1. Показано, что CTLA-4 запускает Hippo сигнальный каскад, что приводит к повышенной экспресии транскрипционного фактора Blimp, который во многом определяет транскрипционный профиль истощённой клетки (Thaventhiran, 2012). Несмотря на приоритет PD-1 как первого рецептора, описанного в качестве клеточного истощения, именно CTLA-4 являлся первой мишенью памяти чем к истощённых 2013). Это говорит о том, что на а картина ингибирующих рецепторов неполна, и блокада сигналов от одного из них, вероятно, не является залогом успеха. Необходимо действия клеточного исто ения, именно CTL -4 являлся первой ми ень для терапии заболеваний сопровождающихся Т-клеточным истощением. Первым препаратом, одобренным для терапевтического применения был Ipilimumab (Yervoy) - IgG1 блокирующие антитела против CTLA-4 (Mansh 2011 Lotem, 2012). Примечательным является тот факт, что ингибирующие рецепторы, которые описаны как маркеры истощения, экспрессируются на истощённых клетках дифференциально (Рис. 4). Так, например, при инфекции ВГС показано существование субпопуляции PD1im3+ истощённых клеток (Golden-Mason, 2009), в то время как некоторые PD1+ клетки при SIV (Simian immunodeficiency унодефицита обезьян) инфекции фенотипически ближе к клеткам к истощённым клеткам (Hong, 2013). Значительная часть LAG-3 исто ённ х клеток экспрессирует PD-1 на слабом или промежуточном уровне (Grosso, 2009). Таким образом, кроме функциональных показателей (падение продукции IFN-, TNF-, IL-2 и блокада цитотоксичности), в настоящее время не сущетсвует других способов точно идентифицировать всю совокупность истощённых клеток. Нет ни одного ингибирующего рецептора, который экспрессировался бы на всех истощенных ЦТЛ и являлся бы универсальным маркером. Нет и полной картины функциональных различий субпопуляций истощённых клеток, маркированных комбинацией разных рецепторов. Первые опыты практического, медицинского применения этих фундаментальных сведений, с одной стороны дали обнадёживающие результаты по терапии хронических вирусных заболеваний и рака, с другой стороны, показали наличие побочных эффектов (Voskens, 2013). Это говорит о том, что наша картина дальней ее изучение является залогом успеха. еобходимо дальней ее изуч ингибирующих рецепторов, и, возможно, поиск новых молекул, вносящих свой вклад в модулирование клеточной активности. В свете этого, представляет интерес белок Т- и рецептора. лирование клеточной активности. В свете этого, представляет интерес NK-лимфоцитов FCRL6, обладающий признаками ингибирующего активности.
Синий нативный гель-электрофорез белковых комплексов (НC ПААГ). (по Shagger, 1991)
Микросомы из 107 клеток Bjab лизировали 2 % -додецил мальтозидом в объеме 30 мкл. Лизат центрифугировали, супернатан переносили в другую пробирку и добавляли 1 мкл 5% раствор кумасси синего G-250 в 500 мМ аминокапроновой
Дорожку геля после СН-ПААГ вымачивали 30 мин при 50С в 0,125 М трис-НСl, pH 6,8, 1% ДСН, 2% 2-меркаптоэтанол, затем 30 мин при комнатной температуре при покачивании в 0,125 М трис-НСl, pH 6,8. Дорожку геля разворачивали на 90 и помещали между стекол вплотную к концентрирующему гелю, залитому без поме али ме ду стекол вплотну «карманов». Далее вели электрофорез как в 2.6.1. 2.6.4. Окрашивание гелей при помощи нитрата серебра (по Shagger, 2006) Гель после электрофореза фиксировали 1 час в 50% метаноле с 10% уксусной кислотой. Гель отмывали в течении часа 3 сменами деионизованной воды при покачивании. Сенсибилизировали гель при помощи инкубации в 0.005% енами деионизованной в помощи инкубации в 0.005 тиосульфате натрия, 20 мин. Гель ополаскивали и инкубировали 30 минут на льду в растворе 0.1% нитрата серебра. Гель ополаскивали водой и визуализировали белки 0.02% формальдегидом в 2% карбонате натрия до появления четкой картины. Останавливали окраску 50 мМ ЭДТА.
В каждую лунку полистирольного планшета вносили раствор антигена в ФСБ в концентрации от 1мкг/мл до 1нг/мл, и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Несорбировавшийся антиген отмывали 5 сменами по 5 минут отмывочным раствором (0,1 M NaHCO3, 0,1% тритон-Х100). В каждую лунку планшета добавляли по 100 мкл раствора содержащего анти-FCRLA сыворотку мыши или кролика. Инкубировали 1 час при комнатной температуре. Отмывали антитела отмывочным раствором, затем в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл раствора содержащего вторые антитела в разведении 1/1000 (конъюгаты GAR или RAM). Инкубировали 1 час при комнатной температуре. После отмывки, в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл раствора, содержащего: цитратный буфер (2,4 объема 0,5 M NaOH, 1 объем 0,5 M лимонной кислоты, pH 5.2), 0,5 мг/мл ортофенилендиамина и 0,01% H2O2. Инкубировали при комнатной температуре в течение 5-10 минут до проявления окраски. Реакцию останавливали добавлением 1М Н2SO4 и измеряли оптическую плотность раствора на длине волны 490 нм.
Проводили электрофоретическое разделение белковых проб согласно протоколу приведенному выше. Электроперенос белков с полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C extra или PVDF проводили в буфере (3,03 ии 1 м и 0,1 инкубировали мембрану на качалке 1 час при комнатной температуре. Мембрану -100, 0,5 качалке 1 буфером г/л трис, 14,4 г/л глицин, 20% метанол) 1,5 часа при напряженности поля 22 В/см. Мембрану блокировали ночь при 4С в растворе, содержащем: 1% желатин, 0,3% казеин, 0,1 М NaHCO3 и 0,03% NaN3. Моноклональные антитела против FCRLA человека клон М616 разводили до концентрации 1 мкг/мл в растворе, содержащем: 1% желатин, 0,1% тритон Х-100, 0,5 М KCl и 0,1 М NaHCO3. В этом растворе инкубировали до проявления окраски. После этого мембрану сканировали или фотографировали. промывали 5 раз по 5 минут буфером для отмывки (0,1 М NaHCO3, 0,1% Тритон Х-100). Вторые антитела (конъюгаты RAM) разводили до конечной концентрации 1/1000 в растворе, содержащем: 1% желатин, 0,1% тритон Х-100, 0,5 М KCl и 0,1 М NaHCO3. В этом растворе инкубировали мембрану на качалке в течение 1 часа при комнатной температуре. После отмывки мембрану помещали в трис-имидазольный буфер (0,05 М имидазол, 0,05 М трис-НCl, pH 7.4) с 0,01% Н2О2 и 0,5 мг/мл ДАБ и
Клетки промывали в рабочем растворе (0,1% NaN3, 1% эмбриональная телячья сыворотка в PBS), суспендировали в 500 мкл рабочего раствора с поликлональными кроличьими антителами против FCRLA человека (конечная чьими антителами против FC L человека (конечная мышиными антителами против p58K (Abcam, Cambridge, UK) или мышиными антителами против кальнексина (BD TransductionLab). концентрация 2 мкг/мл) и вторыми антителами GAR-PE и RAM-FITC (BD TransductionLab) едении 1/500. Инкубировали в темноте 30 минут при 4С. Клетки промывали суспендировали в 25 мкл рабочего раствора и наносили на стекло. водили сотрудники центра коллективного пользования «Центр микроскопического анализа биологических объектов» СО РАН на микроскопе ZEISS ctionLab). Инкубировали 30 минут при 4С. Клетки промывали 3 раза в рабочем растворе, центрифугируя по 5 минут при 200g. Клетки суспендировали в 50 мкл рабочего раствора с вторыми антителами GAR-PE и RAM-FITC (BD TransductionLab) в разведении раза, Микросокопию проводили сотрудники центра коллективного пользования «Центр микроскопического LSM 510
Анализ коэкспрессии FCRL6 с другими поверхностными маркерами методом проточной цитометрии
Все манипуляции с клетками проводили в буфере ФСБ с 1.5% ФКС и 0.05% NaN3. Периферические мононуклеарные клетки крови в количестве 106 на пробирку окрашивали биотинилированными моноклональными антителами против FCRL6 клон 7В2 в концентрации 5 мкг/мл на льду в течение часа. Затем клетки отмывали и инкубировали 30 мин на льду с раствором конъюгата стрептавидин-PE и антителами против CD8, CD56, CD4, PD-1 (Ebioscience, CA, США) мечеными различными флюорохромами. После этого клетки повторно отмывали, инкубировали с ДНК-интеркалирующим красителем 7AAD (Sigma, США) и анализировали на проточном цитометре BD FACSCanto II. Анализ полученных данных проводили в программе FACSDiva.
Изучение функциональной активности изоформ FCRLA локализована внутри клетки белка в клеточных окализация белка в клеточн х компартментах не была исследована. Так как локализация белка в клетке определяет его белковое окружение и потенциальные функции, мы исследовали влияние доменного состава и длины сигнального пептида на локализацию FCRLA
FCRLA и FCRLB отличаются от остальных членов семейства FCRL отсутствием явной трансмембранной последовательности, из чего можно сделать вывод о том, что они должны секретироваться, задерживаться внутри клетки, или ассоциировать с мембраной клетки при помощи дополнительных белков. В первых работах было показано, что четырехдоменная изоформа FCRLA экспрессия было Очевидно, влияние доменного состава и длины сигнального пептида на локализаци FCRL внутри клетки. Ранее было обнаружено, что FCRLA имеет несколько изоформ, отличающихся доменным составом (Mechetina, 2002). Поскольку, эксп изоформ FCRLA в различных клетках не была исследована, необходимо выяснить, какие изоформы наиболее эффективно экспрессируются. Очевидно, наибольшее внимание должно быть уделено изоформе, экспрессия которой максимальна в естественных условиях. Таким образом, возникла необходимость охарактеризовать изоформы FCRLA, их экспрессию, а также определить внутриклеточную компартментализацию наиболее представленных изоформ FCRLA.
Для поиска транскриптов гена FCRLA нами было выполнено клонирование кДНК этого гена с использованием праймеров (Табл. 2 раздела Материалы и методы), комплементарных различным участкам нетранслируемой области (обратные праймеры) и двум первым экзонам (прямые праймеры). При помощи праймеров-дискриминаторов и секвенирования нами были обнаружены транскрипты для ранее не известных изоформ FCRLA, отличающихся, кроме доменного состава, длиной сигнального пептида. Как упоминалось в обзоре литературы, сигнальный пептид FCRLA кодируется двумя экзонами (Рис. 7), причём эта особенность является консервативной для всех млекопитающих, кроме грызунов. Нами были обнаружены изоформы FCRLA, содержащие как оба экзона сигнального пептида (далее называемые LP – long peptide), так и только один первый экзон с пропуском второго
Изоформы FCRLA (вверху) доменная и экзон-интронная (внизу) структура FCRLA. Овалами изображены ИГ-подобные домены, треугольником - муцин-подобный домен.
Экспрессия изоформ FCRLA в органах человека (А) и в клеточных линиях (Б). Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в 1% агарозном геле. В качестве калибровочного гена использовался актин. Положительным контролем (К+) на рисунке Б выступали соответствующие рекомбинантные плазмиды. Условные обозначения: Ми – миндалина, С – селезенка. (SP – short peptide). В комбинации с различным доменным составом, два варианта продук разной интенсивности, соответствующие разным изоформам FCRLA. (Рис. 9А) Поэтому была изучена экспрессия изоформ FCRLA, в имеющихся клеточных лимфом. Для этого был проведён ОТ-ПЦР с прямыми праймерами, дискриминирующими короткий или длинный сигнальные пептиды, и с универсальным обратным праймером, комплементарным 3 -нетранслируемой FCRLA. В клеточных линиях Raji, IM-9, BJAB, BL-2 и CBMI-Ral-STO и селезенки человека, да т сигнал линиях В-праймерами, комбинации с различным доменн м составом, два варианта приводят к образованию семи различных изоформ FCRLA (Рис. 8). Из всех обнаруженных вариантов только четырехдоменный и двухдоменный без первых двух доменов содержали оба типа сигнальных пептидов: короткий однодоэкзонный и длинный, кодированный двумя экзонами. Остальные найденные нами варианты транскриптов FCRLA содержат сигнальный пептид, кодированный только одним, первым, экзоном (Рис. 8). Было обнаружено, что продукты ОТ-ПЦР с кДНК из миндалины области В из в которых В клеточных линиях Raji, I -9, BJ B, была обнаружена экспрессия четырехдоменной изоформы с коротким сигнальным пептидом и слабые экспрессия двух- трех и однодоменной изоформы с SP (Рис. 9Б). В клетках IM-9 и Bjab, кроме того, была обнаружена экспрессия двухдоменной изоформы FCRLA с длинным сигнальным пептидом. Четырехдоменная изоформа с длинным сигнальным пептидом в B-клеточных линиях не обнаруживается. качестве технического отрицательного контроля были использованы кДНК линий эритроидного (K562) и Т-клеточного (MOLT-4) происхождения, транскрипты FCRLA не детектируются. Таким образом, четырехдоменная изоформа FCRLA является основной как в тканях, так и в клеточных линиях, а двухдоменные изоформы экспрессируется на невысоком уровне. Возможно, экспрессия этой изоформы характерна для определённой стадии В-клеточной активации/дифференцировки, поэтому сигналы ОТ-ПЦР на кДНК из органов человека сильнее, чем сигналы полученные на материале из клеточных линий — последние не могут моделировать всё многообразие В-лимфоцитов от наивных клеток до центроцитов (см. обзор литературы).
. Иммуноблот лизатов клеточных линий и супернатантов кондиционированных сред. Окрашен моноклональными антителами против FCRLA клон Мб 16. Обозначения: Лиз - лизат клеток; Суп - супернатант кондиционированной среды; IM-9 - клеточная линия; 2d LSP - 293 Т клетки, трансфицированные LSP FCRLA2d; 2d SSP - 293 Т клетки, трансфицированные SSP FCRLA2d. Видно отсутствие FCRLA в супернатанте SSP FCRLA2d. этого гена. В свойств двух- и распространенных в количественном
Как уже упоминалось ранее, в первых исследованиях было показано, что четырехдоменная изоформа FCRLA с коротким сигнальным пептидом является внутриклеточным белком (Mechetina, 2002). Этот факт не отрицал вероятность того, что короткие изоформы FCRLA могут иметь другие свойства. Чтобы проверить
Учитывая разнообразие изоформ FCRLA, и значительные различия в их аминокислотной последовательности, логичным является предположение о том, что функции изоформ FCRLA могут отличаться также как и их аминокислотные последовательности. В иммуногенетике известны примеры белков, разные изоформы которых обладают различной функциональной активностью. Изоформы могут отличаться по своим регуляторным свойствам (XBP-1, Yoshida, 2006), по способности к секреции (IL-15, Tagaya, 1997), по локализации в клетке (CCL27, Baird, 1999) могут иметь разные лиганды (Paxillin, Mazaki, 1997) и активировать различные сигнальные каскады (APM, Neumeier, 2006).
Определение молекулярной массы FCRLA-содержащего комплекса
Определение молекулярной массы FCRLA-содержащего комплекса. дальнейшей функциональной характеризации FCRLA. Для определения молекулярной массы комплекса с участием FCRLA нами был Для определения молекулярной массы комплекса с выбран метод нативного синего электрофореза (НС Принцип НС ПААГ в целом схож с принципом ДС Г, однако позво елостн ПААГ очищенных митохондрий или хлоропластов. Опубликована только одна Метод НС ПААГ в большинстве случаев применяют для анализа лизатов убликована только одна работа, авторам которой удалось успешно применить НС ПААГ для лизатов целых клеток, после предварительного диализа (Camacho-Carvajal, 2004) В процессе нашей работы метод НС ПААГ:І:::шІ-ковых комплексов и,з разделять белковые комплексы в соответствии с их молекулярной массой Иммуноблот двумерного электрофореза, окрашеный антителами против FCRLA. Первое измерение - BN-PAGE в градиентном геле 3-12%, второе измерение - SDS-PAGE в 10% акриламидном геле. Вертикальными линиями отмечены маркеры молекулярного веса, использованные в BN-PAGE. Видно непрерывное распределение FCRLA-содержащих комплексов. использовании для лизиса клеток высоких концентраций -додецилмальтозида. При использовании различных концентраций дигитонина разрешение электрофореза резко снижалось, а Тriton X-100, в качестве лизирующего агента, вообще не позволял разделить микросомальные комплексы. N-концевой домен FCRLA содержит, как минимум, один неспаренный цистеина, мы проводили лизис в слабовосстанавливающих условиях, остаток цистеина, мы проводили лизис в слабовосстанавлива их условиях, чтобы избежать спонтанного образования дисульфидных связей между FCRLA и другими молекулами в процессе лизиса. В силу технических особенностей метода, после НС ПААГ мы проводили ДСН ПААГ во втором измерении, так как это позволяло сконцентрировать материал с широких полос НС ПААГ для детекции вестерн-блотом. наблюдается для в состав Результаты двумерного электрофореза представлены на Рис. 20. Характер расположения сигнала непрерывен в области от нескольких МДа до 140 кДа, с максимумом в области 170 кДа. Аналогичная картина непрерывного распределения сигнала после двумерного (НС/ДСН ПААГ) электрофореза наблюдае шаперонов типа BiP, а также транспортных адаптерных молекул, входящих гетерогенных комплексов, таких как импортин- или BAP29/31 (Camacho-Carvajal, 2004). Полученный результат может свидетельствовать о взаимодействии FCRLA с различными белками. 3.1.8 Взаимодействие FCRLA с иммуноглобулинами. Поскольку, среди всего FCRL семейства, второй и третий домены FCRLA имеют наиболее высокий уровень гомологии с доменами классических Fc-рецепторов, можно предположить, что FCRLA имеет способность к взаимодействию с против Ig (Рис. 21 ), а -цепь Ig , в сво очередь, обнару ивается в эл атах с сорбента с анти-FCRLA антителами (Рис. 21Б).
Таким образом, некоторая часть молекул FCRLA взаимодейтсвует с -цепью IgM в эндоплазматическом ретикулуме. То, что сорбентом против IgM извлекается небольшое количество FCRLA, можно объяснить значительным избытком IgM в ЭР, по сравнению с FCRLA. Вследствие в М 5 6 7 8 9 10 FCRLA4d / 44 29 FCRLA2d И - Рис. 21. Взаимодействие FCRLA с иммуноглобулинами. (А, Б) (Г). FCRLA не задерживался на сорбентах с IgM и IgG. избытка, даже при взаимодейств молекул IgM остается свободной, иммунопреципитация лизатов клеток миндалины: антителами против IgM человека (1), антителами против FCRLA (3) или с-myc (1, 4 выступал как отрицательный контроль). Видна реципрокная копреципитация FCRLA и -цепи IgM. (В) и (Г) - сорбенты с иммобилизованными IgG человека (дорожки 6 и 9), IgM человека (7 и 8) и антителами против FCRLA (выступал как положительны контроль, дорожки 5 и 10) инкубировали с супернатантом кондиционированной среды от трансфектантов LSP FCRLA2d (В) или лизатом трансфектантов FCRLA4d на сорбентах с IgM и Ig избытка, даже при взаимодействии всех молекул FCRLA с IgM, большая часть и, при аффинном извлечении из лизата, не несет FCRLA. какого взаимодейст иммуноглобулины сорбенте, а лизат клеток с FCRLA инкубировался с сорбентом в различных условиях (Рис. 21Г). Кроме того, мы не обнаружили взаимодействия секретируемой двухдоменной изоформы FCRLA с иммуноглобул Таким образом, выявленное нами взаимодействие FCRLA с Нам не удалось зафиксировать никакого взаимодействия между FCRLA и IgM, равно как и IgG, в случае если иммуноглобулины были иммобилизованы на х и секретируемой двухдоменной изоформы FCRLA с иммуноглобулинами (Рис. 21В). Таким образом, выявленное нами взаимодействие FCRL с -цепью, вероятно, носит характер транзитного и является весьма требовательным к биохимическому происходит в узком (Rath, 2013), окислительно-восстановительном окружении (Park, участии вспомогательных низкомолекулярных лигандов (Santamaria-Kisiel, 2006). окружению. Известны случаи, когда взаимодействие белков диапазоне pH (Rath, 2013), окислительно-восстановительном окружении (Park, 2011), или при
Поискбелков,взаимодействующихсFCRLA. Общепринятым подходом для поиска лигандов белка является афф хроматография в нативных условиях (Cunnea, 2003; Anelli, 2003). При антитела к исследуемому белку задерживают его вместе утративши является аффинная этом сследуемому белку задер ива т своего взаимодействия с белком в щадящих условиях. Используя иммобилизованными первыми с лигандами, не для поискасилигандовоОЗ; к исследуемому белку задерживают его о-видимому, эпитоп распознавания FCRL моноклональными антителами в значительной степени экранирован другими молекулами FCRLA-содержащего комплекса. FCRLA различные схемы иммунопреципитации с иммобилизованнми первми антителам, или с использованием биотинилированныхпервых антител и сорбентов со стрептавидином, мы пришли к выводу что FCRLA извлекается из экстрактов не более чем на 10%. По-видимому эпитоп распознавания молекулами FCRL -содер а его комплекса.
