Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРУКТУРА ХРОМАТИНА ТРАНСКРИБИРУЕМЫХ ГЕНОВ 8
1. Электронная микроскопия 9
2. Повышенная чувствительность транскрибируемого хроматина к нуклеазам . 12
3. Гиперчувствительности к нуклеазам отдельных районов хроматина 17
4. Использование микрококковой нуклеазы для анализа нуклеосомной организации хроматина... 23
5. Заключение 29
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 33
1. Культура клеток и эмбрионы дрозофилы 33
2. Выделение ядер из культуры клеток и эмбрионов дрозофилы 33
3. Гидролиз ядер нуклеазами и электрофорез фрагментов ДНК 35
4. Ковалентное связывание гистонов с ДНК 36
5. Двумерный электрофорез сшитых ДНК-гистоновых комплексов 37
6. Приготовление ДБМ-бумаги и электроперенос фрагментов ДНК на ДБМ-бумагу 38
7. Перенос ДНК на нитроцеллкшозные фильтры 39
8. Выделение плазмидной ДНК 39
9. Расщепление ДНК рестриктазами 40
10. Введение 32Р-метки в ДНК 40
11. Гибридизация ДНК, фиксированной на ДБМ-бумаге или нитроцеллкшозных фильтрах, с клонированными пробами 41
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Исследованные области генома 43
2. Краткая характеристика метода гибридизации с "белковыми тенями" 47
3. Содержание гистонов в транскрибируемой области гена бтш-70 и бтш-22. 50
4. Содержание гистонов в 5»-концевой области гена бтш-70 57
5. Содержание гистонов в 3'-концевой области гена бтш-70 60
6. Изменения в структуре хроматина, выявляемые при гидролизе его микрококковой нуклеазой и ДНКазой I. 61
7. Структурные переходы в хроматине 66
ВЫВОДЫ 70
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 71
Электронная микроскопия
В многочисленных работах по электронной микроскопии транскрипционно активного хроматина была использована методика, разработанная Миллером и сотрудниками, которая позволяла идентифицировать транскрибируемые гены по появлению цепей растущей РНК ( Miller eta 1,1969).
Было показано, что интенсивно транскрибируемые рибосомальные гены ооцитов земноводных ( Scheer,l978, Franke et al., 1978, Scheer, 1980), эмбрионов онколелтуса ( Foe ,1978), , тетрахимены ( Borkhardt and Hielson, 1981), И физарума ( Scheer et al., 1981) на электронных микрофотографиях представлены в виде развернутой "гладкой фибриллы"и не содержат нуклеосом, которые присутствуют в остальном хроматине. В некоторых случаях было обнаружено, что такая структура рибосомального хроматина сохраняется после того, как транскрипция прекратилась и образуется из его компактной формы, содержащей нуклеосомы, на стадиях, предшествующих транскрипции ( Scheer, 1978,Foe, 1978). Вопрос о нуклеосомной организации в нетранскрибируемых спейсерах между транскрибируемыми рибосомальными генами менее ясен. По результатам некоторых
Исследований ОНИ СВОбОДНЫ ОТ нуклеосом ( Scheer, 1978, Franke et aі.,1980), другие авторы утверждают, что хроматин в спейсерах между транскрибируемыми рибосомальными генами представлен компактной структурой ( Pruitt and Grainger, 1981).
Для умеренно активных нерибосомальных генов, таких как гены в кольцах Балъбиани слюнных желез Chironomus tentans было показано присутствие нуклеосом в транскрибируемом хроматине, но плотность их расположения на единицу длины хроматиновой нити была существенно НИЖЄ, ЧЄМ В НеаКТИВНОМ Хроматине ( Lamb and Daneholt, 1979). Дальнейшее изучение транскрипции этих генов в присутствии ингибитора транскрипции ДЕВ (5,6 дихлоро-1-ji-Д-рибофуранозилбен-зимидазола) показало ( Andersson et ai.,1982), что на стадии активной транскрипции хроматин представлен тонкой фибриллой диаметром 5 нм, что соответствует частично развернутым нуклеосомам. Когда же уровень транскрипции снижается под действием ингибитора, между молекулами РНК полимеразы можно видеть нить диаметром 10 нм, представляющую собой плотно сидящие нуклеосомы. После того, как синтез РНК завершится и на хроматине не останется молекул РНК полимеразы, эта нить укладывается в 25 нм фибриллу и далее в структуры более высокого порядка, которые неактивны в транскрипции.
Культура клеток и эмбрионы дрозофилы
Клетки дрозофилы, сублиния Ксо ( Echalier, 1970; Schneider, 1978) культивируемая на среде Эшалье (Echalier, 1970) без сыворотки, были получены из лаборатории М.-Л.Пардью. Клетки дрозофилы, сублиния 67J25D (Какпаков и др.; 1969), были любезно предоставлены В.А.Гвоздевым. Клетки росли на среде С-45 (СССР) в присутствии 10$ телячьей эмбриональной сыворотки. Клетки культивировали в чашках при t = 26С в С02-инкубатере фирмы " Hew Brunswick Scientific " ДО плотности 6-8-10 клеток/мл (что соответствовало логарифмической фазе роста клеток).
При тепловом шоке чашки с клетками помещали в воздушный термостат с t = 36С на 50 мин.
Клетки после теплового шока и контрольные клетки быстро охлаждали до +4С и собирали центрифугированием при 750 є в течение 5 мин. 6-18-часовые эмбрионы Drosophila melanogaster, Oregon получали в препаративных количествах по методу Элгин и Миллера. ( Elgin and Miller, 1978). Для проведения теплового шока эмбрионы инкубировали при 35С в растворе для дрозофилы Рингерта . (7 гїїаСІ, 0,55 г КСІ, 0,21 г СаСІ2 віл Н20) в течение 20 мин. при перемешивании (Miller and Elgin, 1981). Затем эмбрионы дехорионизировали ( Elgin and Miller, 1978) и хранили при -70С.
Ядра из эмбрионов и культуры клеток выделяли, как описано в работе By и соавторов ( Wu et а і., 1979 а).Все процедуры прово -Задались при t =0 + 4С.
Клетки культуры суспендировали в буфере А-0,25Мсахароза (буфер А содержит 60 мМ KCI, 15 MMNaCI, 0,15 мМ спермина, 0,5 мМ спермидина, 15 мМ трис-HCI, рВ 7,4, 0,1 мМ ФМСФ, I мМ ЭДТА), ли-зировали, добавляя NP -40 до 0,4$ и встряхивая на миксере ВП в течение 15 сек. Затем клетки инкубировали при + 4С 2 мин. и снова встряхивали на миксере ВП 15 сек. Ядра осаждали центрифугированием 10 мин. при 5000 об/мин (4400g ), суспендировали в буфере А -0,25 М сахароза без ЭДТА и наслаивали на 1,8 М сахарозу в буфере А без ЭДТА. После-центрифугирования в течение 15 мин. при 18000s (ротор sw-27, 13500 об/мин.), ядра суспендировали в 30 мМ какодилате рН 7,0, определяли их концентрацию и чистоту. Полнота лизиса клеток и чистота препарата ядер контролировалась при использовании фазово-контрастного микроскопа.
Дехорионизированные эмбрионы разрушали в гомогенизаторе Да-унса в буфере А-ІМ сахароза с 0,5 мМ дитиотреитолом, затем гомогенат фильтровали через I слой "Нитекса" и I слой "Мираклоса". При перемешивании добавляли в гомогенат ФМСФ(до 0,5 мМи диизо-пропилфторфосфат(до 0,5 MMJ, растворенные в диметилсульфоксиде, После 20 мин. инкубации с ингибиторами, центрифугировали гомогенат при 400є в течение 10 мин. (1600 об/мин) для удаления неразрушенных клеток и дебриса. Затем к супернатанту добавляли Тритон Х-100 до 0,1$, еще раз тщательно гомогенизировали в плотном Даунсе и ядра осаждали центрифугированием 10 мин при 4400g (5000 об/мин). Осадок ядер суспендировали в буфере A-IM сахароза без ЭДТА и наслаивали на ступенчатый градиент буфера А-1,5 М сахароза - буфера А-1,8 М сахароза без ЭДТА. После центрифугиро-.. вания при 19600 g в течение 30 мин.(ротор sw -27, 14000 об/мин., супернатант удаляли?и осадок ядер суспендировали в 30 мМ какодилате натрия рН 7,0.
Исследованные области генома
Гены белков теплового шока представляют собой удобную систему для изучения структурных изменений, происходящих в хроматине при транскрипции. При повышении температуры с 25С до 37 в эмбрионах дрозофилы, в выделенных тканях, в культуре клеток происходит ингибирование транскрипции большинства генов и быстрая активация нескольких новых генов, кодирующих белки теплового шока. К таким же изменениям могут приводить не только повышение температуры, но и другие неблагоприятные воздействия, например, анаэробные условия, присутствие ионов тяжелых металлов, респираторных ЯДОВ И др. ( Ashburner and Bonner, 1979).
Белки теплового шока найдены не только у дрозофилы ( Schie-singer et al., 1982; Welch et al., 1982) функциональная роль их пока не выяснена.
В недавних работах ( Sirotkin and Davidson , 1982J Zimmerman et al., 1983) было показано, что некоторые из белков теплового шока появляются в организме дрозофилы на определенных стадиях развития при нормальных условиях. Однако, механизм регуляции при этом отличается от индуцированного тепловым шоком синхронного включения этих генов.
У дрозофилы при тепловом шоке образуется семь различных белков с молекулярными весами 22000, 23000, 26000, 27000, 68000, 70000 и 84000. Гены, кодирующие эти белки, проклонированы, для них определена нуклеотидная последовательность структурной части и регуляторных областей.
В нашей работе мы исследовали содержание гистонов в неактивных и активированных генах, продуцирующих белки теплового шока с молекулярными весами 70 (бтш-70) и 22 (бтш-22), а также в не транскрибируемых областях генома дрозофилы.
Ген бтш-70 представлен в гаплоидном геноме пятью копиями, две из них расположены в локусе 87А и имеют противоположную ориентацию, остальные три в покусе 87С и ориентированы в одну сторону ( Holmgren et a 1., 1979; Ish-Horowitcz et al., 1979). Уникальный ген бтш-22 находится в локусе 67В, где вместе с ним расположены также гены белков теплового шока с молекулярным весом 23000, 26000, 28000 ( Corces et al.,1980)
На рис. IA показаны участки гена бтш-70 из локуса 87А, которые были использованы в нашей работе.
Плазмида 229,1 (Holmgren et al., 1979) содержит структурную часть гена длиной в 900 п.н. ( Hsp 70). Эта область между рестриктными сайтами Ваш ЕЕ- Sal I имеется во всех пяти генах бтш-70.
Участки, прилегающие к структурной части гена, переклонированы нами ИЗ плазмиды 123 ( Goldschmidt-Clermont , 1980), которая содержит гены бтш-70 из локуса 87А с делецией 5 области одного из генов (левого на рис.ІА). При рестрикции этой плазмиды по сайтам Bam HI, Sal I и Pat в плазмиде pBR 322 по сайтуBamHl и Sail были переклонированы участки длиной 600 и 900 п.н. из 5 -концевой (субклон 123,3) и 3 прилежащей (субклон 123,6) областей. При сотрудничестве с С.АЛувпило (ИБХ им.М.М.Шемякина АН СССР) в плазмиду pUE-222 по сайту sal I был переклонирован фрагмент длиной 177 п.н., вырезанный из плазмиды 123,3 по сайтам Xho I, Sal I. Этот фрагмент (5 Hsp70), присутствующий только в генах локуса 87А, располагается на расстоянии 16 п.н. от начала транскрипции ( Ingolia et al., 1980, Karen at al.,I98I) внутри участка, гиперчувствительного к ДЖазе I ( Wuri980) и содержащего регуляторные последовательности ( Pelham, 1982).
