Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ГИСТОНЫ И НЕГИСТОНОВЫЕ ВЕНКИ: ИХ РОЛЬ В СТРУКТУР НОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ХРОМАТИНА (обзор литературы) 14
1.1. Гистоны: влияние на конформационные и функциональные свойства хроматина 15
1.2. Негистоновые белки хроматина: влияние на активность генома 40
1.3. О некоторых механизмах регуляции гистонами и негис-тоновыми белками структурных и функциональных свойств генетического аппарата 56
Глава 2. ПЛАН СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 70
Глава 3. ВОЗРАСТ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ГЙСТОНОВ И НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ ЭДЕР КЛЕТОК ПЕЧЕНИ БЕЛЫХ КРЫС 93
3.1. Белок-белковые и белок-нулеиновые соотношения в ядрах клеток печени интактных крыс в постнатальном онтогенезе 95
3.2. Влияние гормональных факторов на белок-белковые и белок-нуклеиновые соотношения в ядрах клеток печени крыс разного возраста 103
3.2.1. Белок-нуклеиновые соотношения в ядрах клеток печени крыс разного возраста при индукции гидрокортизоном 104
3.2.2. Влияние тироксина на белок-белковые и белок-нуклеиновые соотношения в ядрах клеток печени крыс разного возраста 112
3.3. Влияние периодического сдерживающего рост питания на белок-нуклеиновые соотношения в ядрах клеток печени крыс разного возраста 119
Заключение 127
Глава 4. ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГИСТОНОВ И НЕГИСТОНОВЫХ ВЕНКОВ В ЯДРАХ И ХРОМАТИНЕ ПЕЧЕНИ КРЫС В ПОСТМГАЛЪНОМ ОНТО ГЕНЕЗЕ 132
4.1. Гетерогенность гистонов ядер и хроматинового комплекса клеток печени крыс разного возраста 133
4.2. Влияние различных факторов на гетерогенность гистонов и гистон-гистоновые соотношения в ядрах клеток печени крыс разного возраста 153
4.3. Исследование негистоновых белков хроматинового комплекса клеток печени крыс в постнатальном онтогенезе 167
Заключение 184
Глава 5. МЕТАБОЛИЗМ ГИСТОНОВ И НЕГИСТОНОВЫХ БЕЛКОВ ЯДЕР И ХРОМАТИНА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ КРЫС В ПОСТНАТМЬНОМ ОНТО ГЕНЕЗЕ 189
5.1. Биосинтез глобулиновых белков ядер клеток печени крыс разного возраста 190
5.2. Возрастные особенности метаболизма кислых белков ядер и хроматина печени крыс 194
5.3. Метаболизм гистоновых белков ядер и хроматина клеток печени крыс в постнатальном онтогенезе 198
Заключение 205
Глава 6. КАЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ (МОДИФИКАЦИИ) ГИСТОНОВ И НЕГИСТОНОВЫХ ВЕНКОВ В ПРОЦЕССЕ ПОСТНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ ЖИВОТНЫХ 222
6.1. Содержание тимоловых групп в пистонахяцер клеток печени крыс разного возраста 224
6.2. Метилирование хромосомалышх белков ядер клеток печени у животных разного возраста 228
6.3. Ацетилирование гистонов и негистоновых белков ядер клеток печени крыс в постнатальном онтогенезе 236
6.4. Изучение фосфорилирования ядерных белков и некоторых факторов его регуляции в процессе постнатального развития животных 252
Заключение 265
Глава 7. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ГЕНОМА И МЕХАНИЗМОВ ЕЕ РЕГУЛЯЦИЙ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ПОСТНАТАЛЬНОГО ОНТОГЕНЕЗА ЖИВОТНЫХ 274
7.1. Возрастные особенности транскрипционной активности ядер клеток печени интактных крыс и крыс с задержанным ростом 275
Заключение 302
Глава 8. ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ 305
ВЫВОДЫ 333
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 337
- Гистоны: влияние на конформационные и функциональные свойства хроматина
- ПЛАН СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
- Белок-белковые и белок-нулеиновые соотношения в ядрах клеток печени интактных крыс в постнатальном онтогенезе
- Гетерогенность гистонов ядер и хроматинового комплекса клеток печени крыс разного возраста
- Биосинтез глобулиновых белков ядер клеток печени крыс разного возраста
Введение к работе
Для выяснения основополагающих механизмов функционирования организма эукариотов первостепенное значение имеет исследование процессов жизнедеятельности клеток на молекулярном уровне.
Из постановления ЦК КПСС и Совета Министров СССР от 19 апреля 1974 года "О мерах по ускорению развития молекулярной биологии и молекулярной генетики и использовании их достижений в народном хозяйстве", а также решений ХХУІ съезда КПСС вытекает необходимость интенсивного развития молекулярной биологии, ее ведущая роль в успешном развитии как теоретических, фундаментальных проблем современной биологической науки на ее цитобиологическом уровне, так и применение результатов этих исследований в прикладном аспекте.
Весьма важное значение имеют молекулярно-биологические подходы к разработке проблем возрастной биологии и геронтологии.
В настоящее время кардинальным вопросом возрастной биохимии и геронтологии, привлекающим внимание многих исследователей, является выяснение характера возрастных изменений в генетическом аппарате клетки и лежащих в их основе процессов.
Впервые ведущее значение для процессов старения организма изменений генетического аппарата клетки было постулировано В.Н.Никитиным (174, 75] при анализе цитобиохимических аспектов онтогенеза высших животных. На этой основе им была переработана
Использованные сокращения: ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота; РНК - рибонуклеиновая кислота; иРНК - информационная РНК; рРНК - рибосомальная РНК; ГО - гистоны общие; ВГ - внутринуклео-сомные гистоны; НРБ - негистоновые белки; АТФ - аденозинтрифоефор-ная кислота; цАМФ - циклический аденозин ЗІ5*-монофосфат; цІМФ -циклический гуанозин 3,'5'-монофосфат; ПААГ-полиакриламидный гель. выдвинутая А.В.Нагорным L 68, 69] теория затухающего обновления цитоплазмы как причина старения.
Основополагающая роль изменений в геноме клеток, как одна из важнейших предпосылок старения, впоследствии была подчеркнута в ряде других теорий старения, выдвинутых Спдллардом [5623 , Сайнексом С 525] , Стрелером С 557 ] , Комфортом L 53 ] , Куртисом С224 ] , Фролькисом В.В. CII83 , Бердышевым Г.Д. LI4D , Виленчи-ком М.М.[283и другими геронтологами.
Теоретические предпосылки в этой области, в основном, можно свести к двум концепциям: а/ повреждение надмолекулярных комплексов, образующих генетический аппарат клетки, вследствие воздействия на них как экзогенных, так и эндогенных факторов; б/ изменение регуляции функций генома, отражающее заложенную в нем программу индивидуального развития, охватывающую не только период формирования организма, но и его старение. Обе эти концепции не следует считать взаимоисключающими. Выяснение "удельного веса" каждой из них в биохимизме онтогенеза позволит полноценнее подойти к поискам путей управления возрастным развитием организма. Работы в этом направлении имеют не только теоретическое, но и практическое значение.
Следует отметить, что фронт исследований молекулярных основ функционирования клеток и, в частности, их генетического аппарата, очень неравномерен для отдельных этапов онтогенетического развития высших животных. В этом отношении подробнее изучен период пренатального онтогенеза животных и ранние этапы их постната-льного развития [71, 72] . Однако выяснение фундаментальных закономерностей онтогенетического развития животных, выбор эффективных путей и способов целенаправленного воздействия на ход возрастного развития, на процессы старения и долголетия невозможны - 7 -без тщательного исследования всех периодов онтогенеза, в том числе и постнатального.
Существуют разные экспериментальные подходы к изучению возрастных изменений генома, их причин и механизмов регуляции. Одним из наиболее перспективных направлений является исследование состояния основных видов белков, принимающих участие в структурной организации и регуляции функциональной активности генетического аппарата клеток.
Согласно современным представлениям С.30, 114, 255] , струк-турно-конформационные свойства генетического аппарата клеток и его функционирование в большой мере зависят от входящих в состав этого аппарата белковых компонентов - гистонов и КГБ, от количественных сдвигов и модификаций молекул этих белков. Поэтому всестороннее изучение возрастной динамики изменений гистонов и НЕБ на разных этапах постнатального онтогенеза животных может дать важную информацию о возрастных особенностях регуляции этими белками структурной организации и функциональной активности клеточного генома.
В связи с этим, основной целью нашей работы было исследование в процессе постнатального развития животных главных белковых компонентов хроматинового комплекса - гистонов и КГБ, их количественных изменений в ядре и хроматине клеток печени, химических модификаций и метаболизма, а также изучение на фоне этих изменений возрастных особенностей функционирования клеточного генома и некоторых из тех механизмов, посредством которых осуществляется, согласно современным представлениям, регуляция активности генетического аппарата этими белками.
Конкретные задачи наших исследований сводились к следующему: ІЇ. Изучить соотношения между гистонами и НГБ, а также между - 8 -этими белками и нуклеиновыми кислотами в ядрах клеток печени на разных этапах постнатального онтогенеза животных, при различных эндокринных сдвигах в их организме и в условиях периодического сдерживающего рост питания /диета Мак Кея/, являющегося эффективным методом значительного продления жизни лабораторных животных.
2/. Исследовать влияние различных факторов /эндокринные сдвиги в организме, экспериментальное сдерживание роста животных с помощью диеты Мак Кея/ на гетерогенность гистонов и НГБ, выделенных из цельных ядер клеток печени и непосредственно из хроматинового комплекса, а также из различных по степени транскрипционной активности фракций последнего /активный и низкоактивный хроматин/ на разных этапах постнатального онтогенеза животных.
3/. Изучить возрастные особенности соотносительного метаболизма гистонов и КГБ в ядрах клеток печени и в изолированном хроматине.
4/. Выяснить возрастные особенности модификаций гистонов и НГБ - их ацетилирование, метилирование и фосфорилирование.
5/. Провести исследование активности генома у животных разного возраста и проанализировать вероятную роль количественных изменений и модификаций гистонов и НГБ в регуляции транскрипции ДНК и структурной организации хроматинового комплекса в постната-льном онтогенезе животных и в условиях периодического сдерживающего рост питания.
Таким образом, ставится задача получить на разных этапах постнатального развития животных информацию о структурно-метаболических особенностях гистонов и негистоновых белков и их роли в структурной организации и функциональной активности клеточного генома при старении животных.
В результате экспериментального решения поставленных в работе задач установлено, что в постнатальном онтогенезе белых крыс основные белковые компоненты хроматинового комплекса клеток печени - гистоны и НГБ - претерпевают специфические для каждого этапа возрастного развития животных изменения в содержании, метаболизме и ковалентных модификациях. На основании данных о возрастной специфике этих изменений, а также данных о синтезе РНК ядрами и хроматином клеток печени животных разного возраста выдвигается предположение о повышении в постнатальном онтогенезе структуризации хроматинового комплекса клеток печени, являющейся одним из факторов торможения активности генома при старении животных.
Установлено постоянство числа фракций гистонов в ядрах и хроматине клеток печени на протяжении постнатального развития животных и уменьшение гетерогенности хромосомальных НГБ в старости. Показано увеличение соотношения гистоны/ДНК и понижение соотношения гистоны/НГБ в ядрах клеток печени, приуроченное к периоду завершения полового созревания животных, к концу которого происходит резкое падение матричной активности ядер и хроматина.
Найдено, что во фракции -...=.. активного хроматина возрастные различия в содержании отдельных фракций гистонов, в том числе и HI, выражены менее четко, чем в низкоактивном. Обнаруженный нами факт увеличения содержания богатых лизином гистонов HI в низкоактивном хроматине во второй половине постнатального онтогенеза животных свидетельствует о повышении возможности образования более компактной структуры хроматина при старении .организма. С этим согласуется и более высокое содержание низкоактивного хроматина в печени животных в поздние периоды их постнатального развития.
Установлены количественные различия в содержании отдельных фракций гистонов в ядрах и хроматине: относительное содержание - 10 -одной из субфракций гистонов Н2А в ядрах с возрастом животных увеличивается, а в хроматине, наоборот, понижается; содержание гистонов Н2В в ядрах клеток печени нарастает у старых животных, а в хроматине оно стабильно на протяжении всего постнатального развития. Эти данные свидетельствуют о наличии в клетках печени вне-хромосомного пула гистоновых белков.
Показано, что при изменении в организме условияй регуляции синтеза белков /введение тироксина и использование периодического сдерживающего рост питания/ фракция низкоактивного хроматина, обычно обедненная НГБ, значительно обогащается ими у животных всех возрастных групп, за исключением старых. Повышение содержания НГБ в низкоактивном хроматине клеток печени под воздействием тироксина и диеты Мак Кея может рассматриваться как свидетельство декомпактизации хроматина в этих условиях.
Выявлено разнообразие возрастных изменений модификаций /фосфорилирование , ацетилирование, метилирование/ гистонов и НГБ и установлено, что они происходят на протяжении всего постнатального развития животных. При старении понижается интенсивность апеллирования суммарных гистонов ядер клеток печени. Установлено, что во все периоды постнатального развития наиболее интенсивно фосфорилируются богатые лизином гистоны НІ по сравнению с другими фракциями гистонов и НГБ. При старении фосфорилирование глобулино-вых белков ядер повышается, а гистонов HI, наоборот, значительно падает. Возрастная динамика метилирования суммарных гистонов и НГБ сходна: при старении животных метилирование этих белков заметно усиливается, причем, для гистонов это происходит, в основном, за счет богатых аргинином гистонов НЗ, тогда как гистоны НІ на всем протяжении постнатального развития животных не включают метальную метку.
Принимая во внимание тот факт, что ацетилирование и фосфори- - II - лирование уменьшает положительный заряд гистонов и ослабляет их связь с ДНК, а при метилировании гистоновых белков прочность их связывания с ДНК усиливается, установленная нами возрастная специфика модификаций гистонов /понижение с возрастом животных фос-форилирования богатых лизином гистонов HI и ацетилирования суммарных гистонов, увеличение метилирования большинства фракций гистонов/ свидетельствует об усилении в постнатальном онтогенезе животных прочности связи между этими белками и ДНК. Это может быть одним из факторов, приводящих к повышению структуризации хромати-яового комплекса клеток печени и понижению его активности при старении животных.
Предпринятое нами исследование процесса обновления разных видов ядерных белков позволило получить новые данные об особенностях их метаболизма в ядрах и хроматине клеток печени животных разного возраста. Установлено, что гистоны и, особенно, НГБ обладают более высокой скоростью обновления в составе хроматинового комплекса, нежели в цельных ядрах у животных всех возрастных групп. Среди гистоновых белков выделена субфракция богатых лизином гистонов Н1а, уровень обновления которой превышает таковой других фракций гистонов и НГБ ядер и хроматина на всех этапах постнатального развития животных.
Установлено, что наиболее значительно матричная активность ядерного генома клеток печени понижается в период между 1-3 месяцами, постнатального развития животных и в дальнейшем этот низкий уровень сохраняется без существенных изменений до глубокой старости.
Выявлены структурно-функциональные изменения генома при сдерживающем рост питании, которые позволили внести ясность в некоторые механизмы воздействия данного фактора на продолжительность жизни лабораторных животных. Ряд установленных нами фактов /резкое торможение синтеза иРНК ядрами клеток печени и исчезновение его возрастных особенностей, характерных для интактных животных, относительно высокий уровень синтеза рРНК во все периоды онтогенеза, резкое падение содержания гистонов НІ в обеих фракциях хроматина, уменьшение относительного содержания ДНК и гистонов в ядрах; клеток печени взрослых животных с задержанным ростом/ показывают заметное сдерживание темпов старения животных диетой Мак Кея.
Таким образом, вся совокупность полученных в работе данных показывает, что происходящие в постнатальном онтогенезе изменения в содержании гистонов и НІБ, в уровне их модификации могут быть важным звеном в регуляции структурной организации и функциональной активности клеточного генома при старении животных. Констатируется, что одним из факторов, способствующих торможению синтеза РНК в печени при старении животных может быть усиление в процес- се возрастного развития структуризации хроматинвого комплекса, обусловленное увеличением относительно ДНК и НГБ гистоновых белков, понижением уровня фосфорилирования богатых лизином гистонов HI и ацетилирования суммарных гистоновых белков, а также нарастанием в постнатальном онтогенезе животных метилирования большинства фракций гистонов и НГБ.
Результаты проведенных исследований имеют важное значение для разработки фундаментальных проблем возрастного развития высших животных: молекулярных механизмов- регуляции функциональной активности генетического аппарата клеток на разных этапах онтогенеза и воздействия на его активность гормональных и алиментарных факторов.
Полученные данные являются экспериментальным подтверждением - ІЗ - представлений о ведущей роли генетического аппарата клетки в старении организма, впервые постулированных в Харьковской школе он-тофизиологов и онтобиохимиков С 743 и являющихся в настоящее время основной предпосылкой многих теорий и гипотез возрастного развития животных.
Кроме решения актуальных вопросов, связанных с теоретическими проблемами молекулярной биологии и биохимии возрастного развития, результаты данной работы имеют существенное значение и для практической геронтологии - они способствуют пониманию ряда основополагающих механизмов, обеспечивающих в конечном итоге значительное увеличение продолжительности жизни лабораторных животных, достигаемое с помощью периодического сдерживающего рост питания. Знание этих механизмов может сыграть важную роль для целенаправленного воздействия на продолжительность жизни высших животных и найти свой выход в геронтологическую практику.
Отдельные положения диссертационной работы отражены в руководстве "ОСНОВЫ ГерОНТОЛОГИИ" /"МеДИЦИНа", М. , 1969/ И п//алс/е/<*/г &d{/
Гистоны: влияние на конформационные и функциональные свойства хроматина
Прошло более 80 лет со времени выделения Косселем [356,357) этих белков из эритроцитов гусей, однако интенсивное изучение их начато сравнительно недавно. Сильным импульсом для всестороннего изучения гистоновых белков послужило постулирование Стедман и Стедман [547-549] вероятной роли этих белков в проявлении генетической функции ДНК.
Согласно общепринятой в настоящее время классификации (табл. I) гистоновые белки на основании анализа их аминокислотного состава разделены на три главные группы: а) очень богатые лизином гистоны; б) обогащенные лизином гистоны и в) обогащенные аргинином гистоны. К первой группе этих белков относятся фракции гистонов HI, а также уникальный лизинбогатый гистон из ядер эритроцитов - гистон Н5. Следует также отметить гистон Н6 из семенников форели [290,317] и, вероятно, специфические для семенников млекопитающих гистоны T Fl и T F2fe [519] , которые по ряду показателей занимают промежуточное положение между гистонами HI и Н2А.
Ко второй группе гистонов относятся умеренно обогащенные лизином гистоны Н2А, Н2В. Третья группа гистоновых белков представлена обогащенными аргинином фракциями гистонов НЗ и Н4.
В настоящее время накоплен обширный экспериментальный материал о первичной структуре всех основных пяти фракций гистоновых белков, об особенностях распределения остатков отдельных аминокислот в полипептидной цепи этих белков и характерном для гисто-новых фракций содержании той или иной из аминокислот. Эти данные подробным образом изложены в ряде обзорных работ [Ш 48,49,4,87, 88] , поэтому на них мы подробно останавливаться не будем, а затронем лишь их в том или ином из аспектов при обсуждении полученных нами результатов экспериментов в соответствующих разделах нашей работы.
Существенный интерес представляет вопрос о становлении набора (спектра) гистоновых белков на разных этапах возрастного развития организма эукариот, начиная от слияния половых клеток и до его конечных периодов постнатального онтогенеза. Это обусловлено в первую очередь той важной ролью гистонов, которую они играют в структурной организации хроматинового комплекса клетки и в проявлении его функциональных свойств. С таких позиций изучение этого вопроса в период эмбриогенеза, когда процессы дифференцирования клеток и тканей в организме достигают своего апогея и в процессе постнатального онтогенеза, когда окончательно реализуется генетическая программа развития организма высших животных, представляет чрезвычайный интерес.
План собственных исследований. материал и методы
Исходя из поставленных задач, настоящая работа охватывает широкий круг подлежащих экспериментальному изучению вопросов.
Нами проведены следующие основные серии экспериментальных исследований: на разных этапах постнатаяьного развития животных изучены белок-белковые и белок-нуклеиновые соотношения в ядрах клеток печени, определена гетерогенность (спектр) гистонов и НГБ, изучен их метаболизм и различные химические модификации, проведено исследование активности клеточного генома у животных разного возраста, исследована динамика транспорта в организме радиоактивной метки, степень ее разведения кровью и пулом свободных аминокислот у всех использованных в работе возрастных групп жиютных. Кроме этого, при решении ряда вопросов проводились дополнительные серии экспериментов, способствующие более глубокому пониманию и интерпретации результатов основных серий исследований. Например, при изучении количественного содержания в ядрах ДНК на разных этапах постнатального онтогенеза определялась активность ДНКаз, при изучении фосфорилирования гистонов и НГБ определено содержание циклических АМФ и цІМФ, наряду с изучением активности генетического аппарата в условиях Crt- с-оъа f определялась активность РНКаз и т.п.
Обоснование необходимости проведения тех или иных исследований и конкретизация поставленных для решения вопросов даны в соответствующих разделах основных серий экспериментов.
I. Исследование белок-белковых и белок нуклеиновых соотношений. Решение вопроса о гистон-гистоновых и гистон-ДНК соотношениях в ядрах клеток имеет принципиаяьное значение в плане проводимыхами исследований в двух аспектах: во-первых, необходимо установить стабильно или нет соотношение гистоны-ДНК на разных этапах юстнатального онтогенеза животных и, во-вторых, этот вопрос представляет и общетеоретический интерес, так как проведение запланированных в этом разделе экспериментов способствовало бы углублению яапшх представлений о вероятности количественных сдвигов внутри-нуклеосомных гистонов (а значит и о характере состояния нуклеосом) и линкерного гистона НІ в постнатальном онтогенезе животных.
Для выполнения этих исследований нами избрана печень животных разного возраста как в условиях нормы, так и при моделировании различного функционального состояния их организма. Различное функциональное состояние в организме животных разного возраста достигалось нами несколькими путями: при помощи воздействия периодического недостаточного по калорийности питания, вызывающего значительное сдерживание роста подопытных животных и пролонгирующее в конечном итоге их жизнь, а также путем гормональных сдвигов (введение гидрокортизона и тироксина). Как частный вопрос при изучении содержания ДНК в ядрах на разных этапах постнатаяьного онтогенеза животных нами проведена серия исследований активности ферментов катаболизма ДНК - нейтральной и щелочной ДНКаз.
2. Изучение гетерогенности гистонов и негистоновых белков.
В данной серии исследований основной задачей ставится выяснение вопроса о характере изменений гетерогенности гистонов и НГБ в процессе постнатаяьного развития животных. Необходимо было получить информацию о том, меняется ли у животных разного возраста фракционный состав этих белков и как эти изменения детерминируются функциональным состоянием организма подопытных животных. Были исследованы гистоны и НГБ интактных животных, животных с задер -жанным ростом, а также у животных с моделированными эндокринными сдвигами в организме (адреналэктомия, влияние тестостеронпропио-ната).
Важным (и совершенно не исследованным) является также вопрос об идентичности спектра гистонов цельных ядер и хроматинового комплекса. Для его решения мы изучали гистоны, экстрагированные из тотальных ядер, их хроматинового комплекса, а также различных по функциональной активности фрагментов последнего.
Белок-белковые и белок-нулеиновые соотношения в ядрах клеток печени интактных крыс в постнатальном онтогенезе
В данном разделе представлены результаты изучения в ядрах клеток печени интактных крыс разного возраста содержания суммарных и негистоновых белков, общих гистонов и их фракций. Относительно фракций гистоновых белков следует отметить, что нами биохимическим путем определзно содержание двух групп гистонов. Первую группу составили фракции гистонов, входящие в состав внутреннего белкового скелета нуклеосом (гистоны Н2А, Н2В, НЗ и Н4). В данной главе мы их называем внутринуклеосомные гистоны (ВТ). Во вторую группу выделенных из ядер гистонов входили гистоны HI, скомплексированные, как известно, преимущественно с межнуклеосом-ными участками ДНК. Фракционный состав этих двух групп гистонов представлен на рис. 2.
Изучение белкового состава ядер клеток печени интактных крыс разного возраста в условиях угнетения протеолиза [247 J белков и с соблюдением : условий, препятствующих потере гистонов, показало (см. табл. 2) значительное нарастание в постнатальном онтогенезе количества общего белка, негистоновых белков и гистонов при их расчете на I ядро. Наиболее заметно это повышение виражено в период между І-І2 мес. постнатального развития для всех классов анализируемых белков; у наиболее старых (24 мес.) живот -ных темп нарастания содержания большинства исследованных белков в ядрах несколько замедляется, однако по абсолютному содержанию их уровень у этих животных значительно выше, чем у неполовозрелых. Исключение лишь составляют лизинбогатые гистоны НІ, содержание которых после максимального значения у 3- и 12-мео. животных к старости понижается до уровня неполовозрелых.
Следует отметить, что аналогичное по величине значение для соотношения общие гистоны/ДНК в ядрах клеток печени крыс было впоследствии получено и другими исследователями [246, 207, 208] .
Как видно из приведенных напій данных, подавляющая масса белка в суммарном препарате гистонов принадлежит фракциям внутри-нуклеосомных гистонов, на долю гистонов НІ приходится в зависи -мости от возраста животных от 12% до 20%. Это совпадает с данными других авторов [104,167,580] .
Обусловленное возрастом обогащение белками ядер клеток печени становится понятным в результате анализа данных о возрастной перестройке клеток печени крыс. Согласно этим данным [417, 269,143,18,19,243,1] , подавляющая масса клеток печени в процессе постнатального развития животных претерпевает процесс поли-плоидизации, являющейся одной из причин значительного увеличения массы и объема клеточных ядер вследствии накопления в них белков и нуклеиновых кислот. Показано также [277,430] , что в полиплоидных ядрах заметно усиливается обмен предшественников нзгклеиновых кислот и белков. Относительно гистоновых белков необходимо отметить, что они, в основном, синтезируются синхронно с ДНК [123, 142,171,475] , хотя и не в строгом количественном соотношении. Поэтому их накопление в ядрах клеток печени в процессе возрастного развития животных становится понятным на фоне резкого увеличения содержания ДНК в ядрах клеток печени, вызванного полиплоида -зацией.
Значительный интерес представляет изучение количественных соотношений белков и нуклеиновых кислот в ядрах клеток печени животных на разных этапах их постнатального развития.
Гетерогенность гистонов ядер и хроматинового комплекса клеток печени крыс разного возраста
а) Гистоны тотальных ядер. Прежде всего, нами были поставлены эксперименты по выяснению влияния различных условий на степень электрофоретического разделения суммарных препаратов гисто-новых белков на отдельные, входящие в их состав, фракции. Основная цель этих экспериментов - выбор наиболее эффективного метода для электрофоретического разделения гистонов в полиакриламидном геле.
На рис. 5 видно, что степень гетерогенности гистонов и их электрофоретическая подвижность в большой степени определяются условиями электрофореза, причем во всех вариантах опытов гетерогенность и электрофоретическая подвижность субфракций суммарного гистона изменяются независимо от возраста животных в одинаковой мере. Так, при электрофорезе в 11% ПААГ (рН 2,3, электродный буфер с 0,9 н. CHgCOOH), проведенном с учетом модификаций, применяемых некоторыми исследователями [452 3 » установлено (рис. 5,г), что после 5-часового разделения основная масса гистонов локализуется в 10-12 интенсивно окрашенных зонах у всех изученных возрастных групп животных. Следует отметить, что в этих условиях электрофореза наиболее подвижные зоны локализуются в геле очень близко друг от друга, что существенно затрудняет дальнейшую ден-ситометрическую обработку этих электрофореграмм.
Более четкое разделение быстродвижущихся субфракций гистонов в 11% ПААГ было получено при электрофорезе в глициновом буфере, рН 4, на протяжении 3 часов 45 глин. (рис. 5,д). В этих условиях на электрофореграммах четко прокрашиваются 5 субфракций гистонов, обладающих значительной подвижностью. На их долю приходится около 10% наносимого на гель белка. Остальная часть белка на электрофореграммах локализуется в 3 зонах, характеризующихся средней электрофоретической подвижностью, и в 7 зонах, обладающих медленной подвижностью. Эти электрофореграммы удобны для ден-ситометрического анализа и последующего расчета гистон/гистоно -вых соотношений. Учитывая эти факторы, во всех дальнейших исследованиях гистонов мы применяли эту модификацию электрофореза гистонов в ПААГ.
Следует отметить, что на электрофореграммах гистонов.кроме основных интенсивно окрашенных зонвыявляются и слабо окрашен -ные зоны. Являются ли они истинными субфракциями ГИС-хОНОВ или же образуются в процессе выделения этих белков и электрофорети-ческого анализа, решить трудно.
Биосинтез глобулиновых белков ядер клеток печени крыс разного возраста
Фракция белков, экстрагированная из изолированных ядер клеток печени животных разного возраста с помощью 0,14 М раствора /а согласно классификации, предложенной И.Б. Збарским и Г.П. Георгиевым C38J , названа "глобулиновыми белками". По своему химическому составу она очень гетерогенна, т.к. содержит ряд ключевых ферментов белкового и нуклеинового обмена - различные нуклеазы и протеази, ДНК- и РНК - полимеразы и др. С38,20,21,31, 39 X
Следует отметить, что несмотря на отсутствие значительных методических трудностей в получении этой фракции ядерных белков, она практически не изучена в возрастном плане, а получение такой информации представляет известный интерес, принимая во внимание, что в ее состав входят ряд важнейших белков, в значительной степени определяющих функциональную активность клетки.
В данном разделе нашей работы приведены полученные нами данные о возрастных особенностях метаболизма глобулиновой фракции ядерных белков печени крыс разного возраста.
Как видно из приведенных в табл. 16 данных, включение меченых предшественников в белки этой фракции претерпевает заметную временную динамику и различается по своей интенсивности у животных разного возраста.
Сравнивая удельную радиоактивность глобулиновых белков у животных I, 3 и 24 мес. возраста, необходимо отметить, что наиболее высока она у старых /24 мес/ животных на всех изученных временных интервалах измерения метки после ее введения. Этот факт мы более подробно обсудили в заключении к данной главе.
Общим для всех возрастных групп животных является время достижения максимальной удельной радиоактивности глобулиновых белков -оно равняется 2 часам. Вместе с тем, более быстро внедрение меченых предшественников происходит в белки неполовозрелых и молодых животных.
Значительный интерес представляет определение временной динамики выведения радиоактивной метки из глобулиновых белков у животных разного возраста относительно максимума удельной радиоактивности. Эти данные в известной мере свидетельствуют о скорости обновления молекул глобулиновых белков на разных этапах постнатального развития животных. Как показали расчеты /табл. 16/, процент оставшейся радиоактивности /за 100$ принята максимальная удельная радиоактивность глобулиновых белков на 2 часе после введения меченых предшественников у животных всех возрастных групп/ на 6 часе после введения метки существенно не различается у всех сравниваемых возрастных групп животных.
