Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Активные формы кислорода и их роль в биосистемах . 12
1.2. Антиоксидантная система 17
1.2.1. Супероксиддисмутаза 18
1.2.2. Катал аза 20
1.2.3. Пероксидазы 21
1.2.4. Низкомолекулярные антиоксиданты ...23
1.3. Активные формы кислорода и злокачественный рост 25
1.4. Окислительный стресс и апоптоз 34
1.5. Белки семейства Вс1-2 39
1.6. Класс антрациклинов. Механизм прооксидантного действия в проявлении противоопухолевой активности 44
1.6.1. Образование свободных радикалов 44
1.6.2. Комплексы антрациклинов с металлами 53
1.6.3. Образование свободных радикалов антрациклинов и их противоопухолевая активность 56
1.7. Ферменты, участвующие в активации доксорубицина 63
1.7.1. НАДН-дегидрогеназа 63
1.7.2. НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктаза 1 64
1.7.3. Ксантиноксидаза 68
Глава 2. Материалы и методы исследования 71
2.1. Культура клеток. Условия культивирования 71
2.2. Схема разрушения клеток 71
2.3. Оценка цитотоксичности 71
2.4. Оценка уровня образования перекиси водорода (Н2О2) 72
2.5. Оценка уровня образования супероксид-анион-радикала (О21) 72
2.6. Измерение хемилюминесценции 72
2.7. ЭПР-спектроскопия 73
2.8. Определение активности Си,гп-супероксиддисмутазы 73
2.9. Определение активности Мп-супероксиддисмутазы 74
2.10. Определение активности каталазы 74
2.11. Определение активности глутатионпероксидазы 75
2.12. Определение активности глутатион-З-трансферазы 75
2.13. Определение активности глутатионредуктазы 75
2.14. Определение активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 76
2.15. Определение активности ксантиноксидазы 76
2.16. Определение активности НАДН-дегидрогеназы 76
2.17. Определение концентрации белка 77
2.18. Определение содержания восстановленного глутатиона 77
2.19. Определение содержания малонового диальдегида . 77
2.20. Оценка внутриклеточного уровня экспрессии Вс1-2
с помощью метода Western blot 78
2.21. Оценка уровня экспрессии генов bcl-2 и Ьах с помощью RT-PCR 78
2.22. Методы статистического анализа 80
Глава 3. Результаты исследования 81
3.1. Изменение уровня АФК и активности АФК-продуцирующих ферментов в процессе развития лекарственной резистентности опухолевых клеток к доксорубицину 82
3.2. Исследование свободных радикалов и парамагнитных центров негемового железа в чувствительных и резистентных к доксорубицину клетках К562 95
3.2.1. Оценка уровня свободных радикалов 95
3.2.2. Парамагнитные комплексы негемового железа 97
3.3. Изменение активности антиоксидантних и Г5Н-зависимых ферментов, уровня экспрессии генов bcl-2 и Ьах при формировании лекарственной устойчивости клеток К562 к доксорубицину 103
3.4. Оценка корреляционных связей в процессе развития резистентности к DOX в клетках К562 107
Глава 4. Заключение... 121
Выводы 133
Список литературы 134
- Активные формы кислорода и их роль в биосистемах
- Оценка уровня экспрессии генов bcl-2 и Ьах с помощью RT-PCR
- Изменение уровня АФК и активности АФК-продуцирующих ферментов в процессе развития лекарственной резистентности опухолевых клеток к доксорубицину
- Парамагнитные комплексы негемового железа
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее значительных ограничений эффективности химиотерапии опухолей является развитие резистентности опухолевых клеток одновременно к целому ряду химиотера-певтических препаратов с разным типом структуры и механизмом действия, получившее название множественной лекарственной резистентности-сти (МЛР) [Biedler J.L., Riehm Н., 1970]. Различают врожденный и приобретенный типы МЛР, обладающие природно приобретенным и свойственным всей клеточной популяции, либо возникающим в результате длительной экспозиции, естественной селекции и адаптивных изменений к действию химиотерапевтического препарата характером резистентности [Pastan I., Gottesman М.М., 1987; Ford J.М., Hait W.N., 1990]. В настоящее время установлено существование нескольких различных механизмов, участвующих в формировании МЛР, включая повышенную экспрессию ряда трансмембранных транспортеров (Р-гп, MRP, LRP, BCRP), повышение уровня системы детоксикации, в значительной степени связанной с ростом экспрессии глутатион-8-трансфераз, снижение экспрессии и активности топоизомеразы II, изменение экспрессии генов, контролирующих апоптоз, что связано с отменой генетически программированной гибели клеток [Hayes J.D. etal., 1990; Доненко Ф.В. и др., 1991; Cole S.P. et ah, 1992; Кор-ninB.P. etal., 1992; Gottesman M., Pastan I., 1993; СапринА.Н. и др., 1996; Dive С, 1997; O'Connor P.M. et al., 1997; Владимирская Е.Б. и др., 1998; ГринчукТ.М. и др., 1998; Ставровская А.А., 2000; Сергеев П.В. и др., 2002; Богуш Т.А. и др., 2003; Штиль А.А., 2003].
Вместе с тем, свободнорадикальные механизмы развития МЛР остаются малоизученными [Doroshow J.H., 1986; Sinha В.К. et al., 1986; Peli-cano H. et al., 2003], хотя хорошо известно, что действие химиотерапевти-ческих агентов, обладающих прооксидантным эффектом, как правило, связано с развитием резистентности в опухолевых клетках [Halliwell В., Gut-teridge J.M., 1989]. Особый интерес этот вопрос приобретает и в связи с тем, что согласно свободнорадикальной теории химического канцерогенеза образование свободнорадикальных интермедиатов канцерогенов является фактором как инициации, так и промоции злокачественной трансформации клеток, процессов инвазии и метастазирования посредством влияния на активацию онкогенов и нестабильность генома [Эмануэль Н.М., 1982; Salim A.S., 1993; Wiseman Н. et al., 1996; На Н.С. et al., 2000]. Кроме того, активные формы кислорода (АФК) оказывают влияние на уровень транскрипции целого ряда факторов, принимающих участие в процессе формирования МЛУ, в том числе белков семейства Вс1-2, контролирующих развитие программируемой клеточной гибели [Reed J.С, 1995, 1997]. Поэтому исследование взаимосвязи формирования лекарственной резистентности, состояния клеточного редокс-статуса и уровня свободнорадикальных процессов несомненно имеет актуальное значение.
Цель исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли свободнорадикальных процессов в формировании лекарственной резистентности клеток эритролейкемии человека К562 к противоопухолевому препарату доксорубицину.
Задачи исследования:
оценить уровень образования АФК и характер его изменения в процессе роста степени резистентности;
исследовать изменение состояния ряда ключевых флавопротеинов, участвующих в метаболической активации доксорубицина, в процессе развития резистентности;
оценить уровни свободных радикалов и негемового железа при формировании лекарственной резистентности опухолевых клеток;
исследовать роль антиоксидантных и ГБН-зависимых ферментов, изменение экспрессии генов bcl-2 и Ьах в процессе развития резистентности к доксорубицину;
оценить характер редокс-зависимых корреляционных связей, образующихся при формировании резистентности.
Научная новизна работы.
1. Впервые установлено, что развитие резистентности клеток эритролей
кемии человека К562 к противоопухолевому препарату доксорубицину,
обладающему прооксидантным действием, связано с изменением кле
точного редокс-статуса, что характеризуется высокой корреляционной
связью роста степени резистентности со следующими факторами:
уровнем снижения внутриклеточной продукции АФК (Of, Н2О2);
ростом активности антиоксидантных (Си,/п-супероксиддисмутазы, Мп-супероксиддисмутазы) и глутатион-зависимых (глутатионпероксидазы, глутатион-8-трансферазы, глутатионредуктазы) ферментов;
ростом внутриклеточного содержания глутатиона;
снижением АФК-продуцирующей активности ксантиноксидазы.
-
Впервые показано, что развитие резистентности к доксорубицину в клетках К562 сопровождается скоординированным изменением и последующим снижением активности НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1, обладающих разным типом метаболической активациидоксорубицина.
-
Впервые обнаружено, что формирование резистентности клеток К562 к доксорубицину связано с супрессией свободнорадикальных процессов и внутриклеточного пула свободного и связанного негемового железа.
-
Впервые показано, что развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину может происходить при одновременной активации транскрипции гена bcl-2 и росте внутриклеточного уровня белка Вс1-2 и, напротив, супрессии транскрипции гена Ьах.
Практическая значимость.
Полученные данные вносят существенный вклад в развитие представлений о редокс-зависимом типе механизма формирования лекарствен-
ной резистентности опухолевых клеток гемопоэтического ряда. Установленный характер изменения соотношения АФК-продуцирующих и катализирующих ферментных систем и ключевых транскрипционных факторов Вс1-2 семейства в ходе развития резистентности опухолевых клеток может быть рекомендован в качестве прогностического фактора для разработки определенных схем комбинированной терапии, позволяющей усиливать направленный цитотоксический противоопухолевый эффект путем оптимизации сочетания доз базового прооксидантного противоопухолевого препарата со временем введения и типом препаратов, корректирующих состояние антиоксидантной и детоксицирующей систем. Положения, выносимые на защиту:
-
Формирование резистентности клеток эритролейкемии человека К562 к противоопухолевому препарату доксорубицину приводит к снижению внутриклеточного уровня АФК, характеризующееся обратной сильной корреляционной связью с ростом степени резистентности.
-
Снижение и скоординированное изменение активности флавопротеинов (ксантиноксидазы, НАДН-дегидрогеназы, НАД(Ф)Н-хиноноксидоредук-тазы 1), вносящих значительный вклад в метаболическую активацию доксорубицина, в значительной степени определяют супрессию образования АФК в процессе развития резистентности клеток К562.
-
Развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину связано с подавлением свободнорадикальных процессов и снижением внутриклеточного уровня свободного и связанного негемового железа.
-
Рост активности антиоксидантных (Cu,Zn- супероксиддисмутазы, Мп-супероксиддисмутазы) и rSH-зависимых (глутатионпероксидазы, глута-тион-в-трансферазы, глутатионредуктазы) ферментов, а также внутриклеточного содержания TSH в процессе развития резистентности клеток К562 образует дополнительный блок, препятствующий образованию АФК.
-
Усиление процессов детоксикации, связанных с ростом содержания TSH и активностей TSH-зависимых ферментов, образует обратную сильную корреляционную связь со снижением процессов перекисного окисления липидов в процессе развития резистентности клеток К562.
-
Развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину может сопровождаться супрессией транскрипции гена Ьах и, напротив, активацией экспрессии гена bcl-2.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на следующих конференциях: Национальной научно-практической конференции с международным участием "Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека" (Смоленск, 2001); VI Международной конференции "Биоантиоксидант" (Москва, 2002); Международном симпозиуме "Reactive oxygen and nitrogen species: diagnostic, preventive and therapeutic values" (Санкт-Петербург, 2002); XIth Meeting of the Society for Free Radical Research International (Париж, Франция, 2002); III Симпозиуме "Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей" (Москва,
2002); Международной конференции "Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health" (Смоленск, 2003); Научно-практической конференции "Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины" (Москва, 2003); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); 38th Annual Meeting of the European Society for Clinical Investigation (Utrecht, the Netherlands, 2004); IV Симпозиуме "Биологические основы терапии онкологических заболеваний" (Москва, 2004).
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 12 печатных работах.
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 165 страницах, и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 41 отечественных и 280 зарубежных источников. Диссертация содержит 26 рисунков и 6 таблиц.
Активные формы кислорода и их роль в биосистемах
Биохимические процессы, протекающие в аэробных организмах, сопряжены с образованием целого ряда активных интермедиатов кислорода, таких
как супероксидный анион-радикал (02:), гидроксильный ( ОН), алкоксильный (RO ) и пероксильный (ROO ) радикалы, перекись водорода (Н2О2Х синглетный кислород ( Ог), гипохл орная кислота (НОСІ), окись азота (N0 ), перокси нитрит (0N00"), получивших название «активные формы кислорода» (АФК). Это высокореакционные, преимущественно свободнорадикальные соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода, АФК обладают широким дуалистическим спектром действия. С одной стороны, некоторые из них принимают участие в процессах сигнальной трансдукции и в регуляции ряда важных факторов жизнедеятельности. С другой стороны, в силу своей высокой химической активности, АФК обладают ярко выраженным гено- и цитотоксическим действием и поэтому представляют серьезную опасность для организма.
Обычным путем метаболизма молекулярного кислорода является его полное восстановление до воды с акцептированием четырех электронов. Особенности электронной структуры молекулы кислорода предполагают ее поэтапное одноэлектронное восстановление, при котором возникают промежуточные свободнорадикальные состояния кислорода, в частности, супероксидный анион-радикал:
Главным источником генерации АФК в клетках является электронный транспорт в митохондриях и микросомах. [130, 152, 154]. В нормальных физиологических условиях восстановительная конверсия кислорода в воду по средством оксидазного процесса требует последовательного переноса электронов, которое сопряжено с образованием свободных радикалов. Наиболее высокий уровень образования супероксида в митохондриях наблюдается тогда, когда переносчики электронов дыхательной цепи, сопряжены с внутренней мембраной митохондрий, находятся в восстановленном состоянии и когда уровень АФК низок [301, 317]. Полагают, что местом генерации 02 является комплекс «уби хинон-цитохром Ь». Стационарная концентрация (1 внутри митохондрий оце нивается в 8х10 "М [144]. Большая часть образующегося супероксида превращается с участием митохондриальной супероксиддисмутазы (СОД) в перекись водорода, а некоторая часть Н2С 2 может диффундировать из митохондрий в цитозоль. Микросомальные и ядерные мембраны также содержат электрон-транспортные системы, включающие в себя цитохромы Р-450 и Ь5, а также соответствующие им НАДФН- и НАДН-зависимые редуктазы, и служит еще одним источником образования (1 в клетках [294, 317]. Одним из источников образования О21 является НАДФН-оксидаза (КФ 1.6.99.6). Это ферментативный комплекс, специализированный на восстановление молекулярного кислорода с образованием Ог\ Генерация 0{ при активации НАДФН-оксидазы фагоцитов играет важную роль в реализации их бактерицидного, цитотоксического и иммунорегуляторного действия [19]. Еще одной важной ферментативной системой образования 0 является ксантиноксидаза (КФ 1.2.3.22), которая в нормальных клетках находится преимущественно в ксантиндегидрогеназной форме и может обратимо или не обратимо переходить в оксидазную форму в результате соответственно окисления дисульфидных связей или ограниченного протеолиза [241]. Основная физиологическая функция фермента - участие в катаболизме пуринов; при этом ксан-тиндегидрогеназная форма фермента в качестве акцептора электронов использует НАД+, оксидазная же - молекулярный кислород. Характеризуя химические свойства супероксида, можно отметить, что он является плохим окислителем и хорошим восстановителем, обладает умерен 14 ной реакционной способностью и может оказывать генотоксическое действие. Время жизни в биологических субстратах около 10"6с [31]. Супероксид известен и изучен лучше других АФК не только потому, что он является первым свободнорадикальным интермедиатом последовательного одноэлектронного восстановления кислорода, приводящего к образованию воды, но и потому, что служит предшественником образования других АФК, включая, ОН и Н202. Изменения рН среды существенно влияет на поведение Ог1. При кислых рН он спонтанно превращается в Н202. При нейтральных и щелочных рН его дисмутация катализируется СОД [130, 156]: Константа скорости спонтанной дисмутации 02 ( 2х105 M V1) примерно на 4 порядка ниже, чем при дисмутации, катализируемой СОД (1,6x109 IVT c"1). Этот путь является главным источником образования перекиси водорода в клетках. На основании этого, можно сказать, что основные источники образования 02 (указанные выше) одновременно служат источниками Н202 [10]. Устойчивость клеток к действию Н202 определяется наличием глутати-онпероксидазнои и каталазной ферментативных систем [299], первая из которых эффективно работает при малых концентрациях перекиси, вторая - при высоких [114]. Каталаза разлагает Н202 с образованием молекулярного кислорода:
Оценка уровня экспрессии генов bcl-2 и Ьах с помощью RT-PCR
Как следует из приведенного выше обзора литературы, в процессы формирования клеточной резистентности вовлечен целый ряд факторов (Р-гп, MRP, топоизомераза IIa, TST Р1-1 и др.). Принимая во внимание тот факт, что ряд лекарственных препаратов способен оказывать прооксидантное действие, его вклад в развитие лекарственной резистентности активно исследуется во многих лабораториях. Нами исследована роль окислительного стресса, вызываемые им изменения клеточного редокс-статуса и связанных с ним систем регуляции, в процессе формирования лекарственной резистентности линии клеток К562 эритролейкемии человека к действию противоопухолевого антибиотика из класса антрациклинов - доксорубицина (DOX), широко используемого в терапии онкологических заболеваний, в том числе в случае острых лейкозов, цитотоксический эффект которого наряду с эффектом интеркаляции ДНК связан с характерной особенностью образовывать в ходе метаболизма свободнора-дикальные интермедиа с сопутствующей продукцией АФК (02% Н2С 2, "ОН).
Направление исследования было связано с оценкой клеточного редокс-статуса в клетках с различной степенью резистентности к DOX, что включало определение уровня образования АФК, а также соотношение уровня активностей ферментов, участвующих в метаболизме DOX и связанных с продукцией АФК (НАДН-дегидрогеназа, ксантиноксидаза, НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктаза 1) и антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза) наряду с FSH-зависимыми ферментами (ГПО, TST), связанных с катаболизмом АФК и деток-сикацией продуктов перекисного окисления липидов, белков, ДНК. В зависимости от состояния клеточного редокс-статуса в процессе развития лекарственной резистентности оценен уровень экспрессии генов семейства bcl-2 - bcl-2 и Ьах, играющих значительную роль в развитии и контроле механизмов апоптоза. 3.1, Изменение уровня ЛФК и активности АФК-продуцирующих ферментов в процессе развития лекарственной резистентности опухолевых клеток к доксорубицину.
В ходе развития резистентности к DOX клеток эритролейкимии человека К562 были получены 3 степени резистентности с 1С5о равной 1,9, 3,7 и 4,7 м кг/мл DOX, соответствующие сублиниям клеток, обозначенных как К562ЛЮХь K562/DOX2, K562/DOX3 соответственно (таблица 2).
Кривые выживаемости линий клеток К562 чувствительных и с разной степенью резистентности к DOX, полученные с использованием МТТ-теста, приведены на рис. 2.
Уровень АФК в чувствительных K562/S и резистентных K562/DOX клетках оценен с помощью флуоресцентного метода по уровню флуоресценции ДХФ, образующегося из ДХФ-ДА в результате последовательного деацетили-рования и окисления Н202, что широко используется для детекции внутриклеточного уровня Н2О2 [260, 161]. В ходе анализа полученных сублиний клеток показано, что развитие резистентности приводит к супрессии внутриклеточного уровня образования Н202 (рис. 3), который достоверно снижается по мере повышения степени резистентности.
Аналогичное изменение установлено и для внутриклеточного уровня 02: (рис. 4), для детекции которого использован метод определения флуоресценции этидия, флуоресценция которого наблюдается при его образовании в результате окисления дигидроэтидия супероксид анионом и последующей интеркаляции этидия в ДНК [64]. Окисление дигидроэтидия супероксид анионом происходит с высокой скоростью и носит избирательный характер, так как другие оксидан-ты, такие как Н2О2, НОСІ или ONOO", не вызывают его окисления [70]. Существенная супрессия генерации уровня супероксид аниона установлена для всех трех сублиний резистентных клеток с максимально выраженным снижением его уровня для резистентных клеток К562/ООХз Изменение в генерации АФК резистентными клетками было показано также с помощью хемилюминесценции. Анализ хемилюминесценции чувствительных и резистентных клеток (сублиния клеток K562/DOXj) с использованием люминесцентного зонда люминола позволил выявить отсутствие эффекта активации хемилюминесценции при действии опсонизированного зимозана (рис. 5, А) и обнаружить активацию чувствительных клеток в присутствии ФМА (рис. 6, А), что, вероятно, в определенной степени может объясняться специфичностью действия ФМА на систему генерации Оз1 [318]. В то же время способность клеток К562 вырабатывать ингибиторы для зимозан-зависимой активации продукции АФК, но которые не действуют на ФМА-зависимую активацию [49], может объяснять отсутствие активирующего действия зимозана на хемилюминесценцию этих клеток. Как видно из кинетических кривых хемилюминесценции, внесение ФМА в среду культивирования вызывало существенное повышение интенсивности хемилюминесценции клеток K562/S с последующей не мгновенной релаксацией (рис. 6). Напротив, присутствие ФМА не вызывало активации хемилюминесценции резистентных клеток K562/DOX3 (рис. 7), также как и действие зимозана (рис. 5, Б).
Изменение уровня АФК и активности АФК-продуцирующих ферментов в процессе развития лекарственной резистентности опухолевых клеток к доксорубицину
Развитие резистентности клеток К562 к доксорубицину приводит к существенному изменению содержания негемового железа. Для сравнительной оценки содержания свободного негемовог железа в обоих типах клеток использовалась ловушка железа - нитрозоглутатион (GS-NO). Взаимодействуя в клетках со свободным негемовым железом, он образует динитрозильные парамагнитные комплексы, дающие сигнал ЭПР eg- фактором 2,03 (сигнал 2,03), по интенсивности которого можно судить о содержании свободного негемового железа в клетках [168]. Клетки отмывали в PBS и инкубировали с 20 mM GS-NO в течение 5 мин., затем замораживали в жидком азоте (-196С). Измерение спектров ЭПР проводилось при этой же температуре. Было установлено существенное (в 1,4 раза) снижение интенсивности сигнала с g-фактором 2,03 в резистентных клетках К562ЛХ)Хз по сравнению с чувствительными (рис. 13).
Значительный интерес представляло исследование в чувствительных и резистентных клетках негемового железа другого рода - в высокоспиновом со-стоянии (S = 5/2), в окисленной форме (Fe ), дающее сигнал ЭПР с g = 4,3 [20]. Основной вклад в сигнал ЭПР с g-фактором 4,3 вносят парамагнитные центры ферритина - основное «депо» железа в клетке. Молекула ферритина содержит -4500 атомов железа в окисленной форме (Fe3+), преимущественно в виде комплекса (FeO-OH)is(FeO-OPOjH2). Белковая часть ферритина - апоферритин - со 98 стоит из 24 идентичных субъединиц с молекулярной массой 18500. В основном, накопленное ферритином железо используется для синтеза гемоглобина, цито-хромов и других соединений. Железо в ферритине, находясь в окисленном (Fe +) состоянии, представлено в виде смеси высокоспиновых форм S = 5/2, S = 3/2. Высвобождаясь из ферритина под действием ряда факторов железо выходит в среду в восстановленной форме Fe2+, но затем снова окисляется до исход-ного состояния Fe ив слабых комплексах, например, с цитратом, фосфатом дает сигнал ЭПР eg- фактором 4,3, оставаясь в окисленном состоянии Fe3+ [20].
Сразу после окончания культивирования клеток K562/S и K562/DOX3 сигнал ЭПР eg- фактором 4,3 не регистрировался (t = -196С) даже при использовании очень большого количества клеток (рис. 14).
Используя метод «искусственного старения» клеток (хранения клеток в течение 3 дней без нормального дыхания, при t = +8С), нами зарегистрировано появление парамагнитных центров, дающих сигнал ЭПР с g = 4,3 (рис. 15). Из рис. 15 видно, что сигнал ЭПР eg- фактором 4,3 в клетках K562/S в 1,6 раза больше такового в клетках К562Л)ОХз. В силу того, что сигнал ЭПР с g фактором 4,3 является суперпозицией сигналов ЭПР нескольких типов парамагнитных центров, появление интенсивного сигнала (g 4,3) может отражать процессы перераспределения трехвалентного парамагнитного (S = 5/2) железа в системе его депонирования (ферритин) и транспорта, а также в системе белков, утилизирующих железо. В пользу значительного вклада ферритина в интенсивность сигнала ЭПР с g = 4,3 могут быть данные о снижении практически в 2 раза уровня ферритина в K562/DOX клетках [212].
Полученные данные могут быть интерпретированы следующим образом. Обработка чувствительных и резистентных клеток GS-NO показала, что в последних имеется меньше доступного железа (рис. 13). При этом, методом «искусственного» старения, мы обнаруживаем, что сигнал ЭПР с g = 4,3 возрастает, как в резистентных, так и в чувствительных клетках. Это может свидетельствовать о том, что происходит окисление Fe2+, связанного с транспортными структурами, и превращение его в Fe3+. Железо (Fe2+), связанное с белками-переносчиками, имеет ограниченную недоступность для GS-NO и появления сигнала с g = 2,03. Вторым возможным объяснением мог бы быть5 тот факт, что снижение уровня железа (Fe и Fe ) в транспортирующих системах обусловлено снижением уровня самого ферритина [212]. В то же время депонированное железо в ферритине при развитии резистентности, возможно, может приводить к перераспределению двух форм железа Fe3+ (S = 5/2) и Fe2+ (S = 3/2) в сторону увеличения диамагнитного Fe (S = 3/2).
Известно, что ионы железа являются катализаторами ряда процессов (реакция Фентон), приводящих к окислительному стрессу и повреждению клеток. В данном случае, снижая уровень лабильного железа раковые клетки используют как один из механизмов своей защиты и выработки резистентности к про-оксидантному действию DOX. Такой вывод согласуется с данными об активации при действии DOX перекисного окисления липидов и ДНК путем образо 1 J вания комплексов DOX - Fe [116, 143], благодаря способности DOX образовывать такой комплекс при взаимодействии с ферритином [101] и восстанавливать Fe3+ до Fe2+ [285], что приводит к образованию высоко реакционноспособ-ных радикалов ОН. В тоже время использование хелаторов железа предотвращает цитотоксическое действие DOX [110]. Поэтому полученные нами данные можно интерпретировать как развитие системы снижения свободного (лабильного) и связанного железа в клетках в ходе развития резистентности клеток К562 к DOX, что составляет часть адаптивного процесса, развивающегося в ответ на прооксидантное действие DOX и приводящего к снижению риска развития Fe - зависимых деструктивных процессов в клетках.
Анализ состояния антиоксидантной системы клеток К562 позволил установить, что развитие резистентности к DOX приводит к изменению уровня активности основных антиоксидантных ферментов - СОД и каталазы (таблица 4).
Как видно из таблицы 4, активность каталазы в ходе повышения степени резистентности изменяется нелинейно, возрастая в клетках K562/DOX] и затем снижаясь до контрольного уровня в клетках К562ЛХ)Хз. Напротив, активность Си п-СОД постепенно возрастает, достигая в клетках К562ЛХ)Хз максимального уровня, превышая более чем в 2 раза, активность чувствительных к DOX клеток. Еще более выраженный, чем для Си,7п-СОД, рост активности наблюдался для Мп-СОД (более чем в 4 раза) (рис. 16). Существенным вкладом в развитие антиоксидантного ответа на DOX можно считать повышение содержания TSH и активностей TSH-зависимых ферментов (ГПО, TST, ГР), уровень которых в процессе роста резистентности существенно повышался (таблица 5). Рост уровня TSH обеспечивает рост его реализации и как ловушки свободнорадикальных продуктов, и как субстрата для ГПО и TST. В свою очередь повышение активности ГР в ходе развития резистентности свидетельствует об усилении процесса восстановления TSH из его окисленной формы TSSr.
В отличие от каталазы активность ГПО, специфичность которой к Н2Ог выше [19], в процессе повышения степени резистентности значительно возрастает. Ещё более высокий рост активности ГПО отмечен по отношению к другому субстрату - гидроперекиси кумола, что говорит о развитии высокой защиты против действия перекисного окисления. Дополнительным фактором, блокирующим развитие окислительного стресса, можно рассматривать рост в рези стентных клетках активности TST, изоформы которой ц и р класса, экспресси-рующиеся в клетках К562, избирательно активны: ц, - по отношению к 4-гидроксинонаналям, р - к гидроксипропеналям ДНК [66, 292]. Высокая активность этих изоформ по отношению к 1-хлор-2,4-динитробензолу позволяет оценивать рост суммарной активности изоформ TST в К562 клетках.
Парамагнитные комплексы негемового железа
В результате проведенного нами исследования установлено, что при развитии резистентности клеток К562 к DOX происходит существенное снижение продукции АФК, как Ог\ так и Н2О2.
Характер снижения продукции АФК имеет вид прямой сильной корреляционной связи со степенью развития резистентности, клеток К562 к DOX что обусловлено изменением как каталитической активности флавопротеинов, участвующих в продукции АФК, и их соотношением с одной стороны, так и ростом уровня антиоксидантной системы - с другой.
Действительно, оценка изменения активностей НАДН-дегидрогеназы, ксантиноксидазы, катализирующих одноэлектронное восстановление, и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1, осуществляющей двухэлектронное восстановление хинона в структуре DOX позволила установить нелинейный характер изменения НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хинонооксидоредуктазы 1 и выраженный характер снижения активности ксантиноксидазы в процессе развития резистентности. При этом резистентные клетки К562ЛХ)Хз демонстрировали значительное снижение активности всех трех ферментов, тогда начало развития резистентности к DOX сопровождалось существенным расхождением в изменении их активности; значительное снижение активности ксантиноксидазы наблюдается при одновременном росте и затем резким снижением активностей НАДН-дегидрогеназы и НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1. Ксантиноксидаза обладает смешанным (одно- и двухэлектронным) типом восстановления хинона, на что влияют соотношение ксантина и НАДН в качестве субстратов, и тип акцептора электрона [232]. Установлено, что ксантиноксидаза может использовать в качестве акцептора электронов антрациюшны, при этом процесс восстановления более эффективен в случае электронного донора - НАДН, чем при использовании ксантина. Напротив, в случае если акцептором электронов является кислород, то наиболее эффективным донором электронов является ксантин [243]. Восстановление антрациклинов ксантиноксидазой носит одноэлектрон-ный характер и приводит к образованию семихиноиных свободных радикалов, что определяет существенный вклад ксантиноксидазы во внутриклеточную продукцию АФК, образующихся за счет редокс-цикла семихинона наряду с образованием CV при катаболизме пуриновых оснований до мочевой кислоты. Наблюдаемое в процессе формирования резистентности к DOX снижение активности ксантиноксидазы, очевидно, следует рассматривать как значительный вклад в развитие клеточной устойчивости, что в большой степени связано со снижением риска развития окислительного стресса и является проявлением адаптационных процессов к цитотоксическому действию DOX.
Наряду с ксантиноксидазой одноэлектронное восстановление DOX, сопровождающееся образованием свободных радикалов, связанных с генерацией АФК (CV, Н2О2, ОН) и с превращением в агликон в результате дегликозилиро-вания по С7-углероднму атому, катализирует митохондриальная НАДН-дегидрогеназа [107]. Вклад НАДН-дегидрогеназы в развитии окислительного стресса, вызываемого DOX, представляется значительным, так как DOX преимущественно аккумулируется в митохондриях, где его концентрация может на два порядка превышать концентрацию в культуральной среде [265], что может быть существенной причиной, вызывающей деполяризацию митохондриальной мембраны, падение трансмембранного потенциала с последующим развитием апоптоза под действием АФК [186]. В этой связи развитие супрессии НАДН-дегидрогеназы является значительным фактором в процессе формирования резистентности к DOX,
Полученные нами результаты подтверждаются данными Wong et al. [312], установили, что резистентность к DOX клеток чешуевидной саркомы человека А431 связана со снижением экспрессии субъединицы 3 НАДН-дегидрогеназы, что сопровождается подавлением образования АФК и развитием апоптоза при действии DOX.
Следует отметить, что изменение активности НАДН-дегидрогеназы в процессе повышения степени резистентности носит нелинейный характер: первоначальный рост сменяется значительным снижением активности фермента, что скоординированно с изменением активности НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктазы 1. Разнонаправленность в изменении активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 при формировании резистентности к DOX установлена в ряде работ [48, 271]. Кроме того, показано, что при действии DOX наблюдается повышение активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в клетках ЕМТ6 опухоли грудной железы мыши, в тоже время при действии на нормальные клетки костного мозга мыши такой эффект отсутствует, что демонстрирует способность DOX избирательно индуцировать НАД(Ф)Н-хиноноксидо-редуктазу 1 в опухолевых клетках [63]. Регуляция уровня экспрессии НАДФН-хиноноксидоредуктазы 1, связываемая также широким рядом соединений, в том числе полициклическими ароматическими углеводородами, азокрасителями, фенольными антиоксидантами, зависит от типа регуляции двух регуляторных участков в 5 фланкирующей области гена - соответственно ARE (EpRE) и XRE (AhRE), которые регулируются транскрипционными факторами, в том числе АР-1, Nrfl, Nrf2, Maf, Jun, Raf, а также МАР-киназами [259]. Противоопухолевый антибиотик митомицин С, метаболическая активация которого включает одно- и двухэлектронное восстановление и редокс-цикл с образованием сво-боднорадикальных продуктов и АФК, также вызывает индукцию НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 с участием транскрипционных факторов АР-1 и NF-кВ [314]. Отсутствие линейной взаимосвязи между активностью НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 и чувствительностью к хинонам у многих линей клеток [314] может объясняться своеобразием развития регуляторного ответа на цитотоксическое действие хинона, зависящее от силы и времени воздействия, и включаться в скоординированный эффект изменения экспрессии генов, определяющих уровень системы детоксикации и антиоксидантного ответа. Поэтому нелинейное изменение активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в ходе развития резистентности к DOX, по-видимому, может быть проявлением по 125 добного скоординированного механизма регуляции в развитии клеточной устойчивости. Следует отметить тот факт, что DOX является субстратом для НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в цитозоле печени крыс [282], в то же время для очищенного из печени крыс Вастар фермента DOX не может служить субстратом [305]. Также двойственная оценка ферментативной активности НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в отношении DOX является определенным препятствием в полной оценке вклада НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в биологический эффект, оказываемый DOX, В любом случае следует, несомненно, отметить вклад НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазы 1 в развитие антиоксидантного уровня защиты клетки в процессе формирования резистентности к DOX. При этом аптиоксидантныи эффект, который могла бы оказывать НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктаза 1 за счет снижения уровня DOX и его высо-кореакционноспособных интермедиатов, а также генерации в результате их ре-докс-цикла АФК, посредством способности дигидрохинонов образовывать неактивные глюкуронаты и конъюгаты с глутатионом, которые легко элиминируются из клеток, можно считать весьма условным, хотя такие метаболиты установлены для DOX [281, 289]. Более существенным следует, по-видимому, считать антиоксидантный эффект, который может оказываться НАД(Ф)Н-хиноноксидоредуктазой 1 благодаря восстановлению эндогенных хинонов, в частности убихонона (коэнзима Q) в убихинол, что повышает защиту клеточных мембран от окислительного стресса [68], наряду с восстановлением ос-токоферолхинона, образующегося вследствие пероксидации а-токоферола в а-токоферолгидрохинона [276].
