Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Состав и структура хроматина. 7
1.2. Негистоновые белки хроматина 9
1.3. Основные белки хроматина - гистоны 10
1.4. Антигенные свойства белков в составе хроматина 19
1.5. Антигенная специфичность гистонов 22
1.6. Заключение 25
2. Материал и методы исследования
2.1. Характеристика материала 27
2.2. Выделение и фракционирование хроматина 28
2.1.1. Выделение хроматина
2.2.1. Фракционирование хроматина ультрацентрифугированием 29
2.2.2. Выделение дезоксирибонуклеопротеида (ДНП) 29
2.2.3. Выделение суммарного гистона 30
2.3. Фракционирование гистонов
2.3.1. Фракционирование гистонов последовательным экстрагированием 30
2.3.2. Ионообменная хроматография гистонов на КМ-целлюлозе 31
2.3.3. Гель-фильтрация гистонов на биогеле Р-60 32
2.4. Иммунохимические методы
2.4.1. Получение иммунных сывороток.. 35
2.4.2. Двойная иммунодиффузия в геле 35
2.5. Электрофоретические методы
2.5.1. ДЦС-электрофорез белков хроматина 3?
2.5.2. Электрофорез белков хроматина в НААГе в присутствии цетавлона 38
2.5.3. Электрофорез гистонов в ПААГе 39
2.5.4. Двумерный электрофорез гистонов в ПААГе.. 41
2.5.5. Идентификация гистонов на электрофореграммах 43
2.6. Заключение 47
3. Результаты исследования
3.1. Антигенные свойства хроматина бобовых 49
3.2. Антигенные свойства гистонов и негистоновых белков в составе хроматина бобовых 56
3.3. Антигенные свойства и специфичность очищенных фракций гистонов бобовых 73
3.4. Сравнительный иммунохимический анализ гистонов бобовых и злаков 80
3.5. Гетерогенность гистонов бобовых и злаков (по данным электрофоре тиче ского анализа) 83
4. Обсуждение результатов
4.1. Антигенные свойства и гетерогенность гистонов бобовых 103
4.2. Специфичность антигенных детерминант белков хроматина бобовых 114
Выводы 119
Практические рекомендации 120
Литература 121
- Основные белки хроматина - гистоны
- Идентификация гистонов на электрофореграммах
- Антигенные свойства гистонов и негистоновых белков в составе хроматина бобовых
- Антигенные свойства и гетерогенность гистонов бобовых
Введение к работе
Специфичность биологических полимеров составляет молекулярную основу специфичности организмов и является источником разнообразия органического мира /В.Г.Конарев, 1973а/. Специфичность, заключенная в аминокислотной последовательности белков, реализуется во вторичной и третичной структурах полипептида, а также в процессе избирательного взаимодействия молекул белка между собой и с другими компонентами клетки. Перспективным подходом для изучения специфичности белков является использование иммунохимических методов, которые позволяют исследовать не только первичную, но и высшие структуры антигенов, не нарушая их наивной конформации.
Белки клеточного ядра взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и принимают непосредственное участие в структурной организации и функционировании генетического аппарата клетки. Исследование специфичности этих белков как в очищенном состоянии, так и в составе нативного комплекса хроматина имеет.важное значение для понимания механизмов активации генома клетки.
Высокая антигенная активность и специфичность нуклеопротвинового комплекса и гистонов была выявлена впервые при изучении филогении культурных растений в лаборатории белка и нуклеиновых кислот ВИР /Гаврилюк И.ЇЇ. и др., 1966; Сидорова В.В., 1970; Ямалеева А.А., 1972; Сидорова В.В., 1975/. В настоящее время исследования белков хроматина широко проводятся не только на растениях, но и на животных. Показано, что специфичность белков особенно четко проявляется в составе нативного хроматина и утрачивается в результате его фракционирования /Уманский СР., 1976/. Исследована антигенная специфичность отдельных компонентов хроматина: негистоновых белков и индивидуальных фракций гистонов /Bustin M.J976/. Электрофоретический анализ гистонов животных выявил их сложный субфракционный состав. У растений эти вопросы освещены недостаточно полно.В этой связи целью настоящей работы явилось изучение антигенных свойств и гетерогенности белков хроматина растений разных таксономических групп. Перед нами были поставлены следующие задачи:
- изучить характер проявления антигенных свойств гистонов в составе хроматина и при его фракционировании;
- провести сравнительный иммунохимический анализ гистонов и негистоновых белков у бобовых и злаков;
- методами электрофореза изучить компонентный состав гистонов HI, Н2А. и Н2В у бобовых и злаков.
Научная новизна исследования состоит в следующем. Путем сравнительного иммунохимического анализа белков хроматина представителей семейства бобовых установлено, что они формируют антигенные детерминанты, которые представляют несколько уровней специфичности. Показано, что антигенные детерминанты специфичные для отдельных триб в семействе ГаЪасеае принадлежат главным образом негистоновым белкам.
Впервые для проведения сравнительного иммунохимического анализа у растений были использованы иммунные сыворотки к очищенным фракциям гистонов бобовых и злаков. Установлено, что антигенная специфичность гистонов в хроматине выше, чем в свободном состоянии. Специфичность очищенных фракций HI, Н2А. и Н2В проявляется при сравнении классов однодольных и двудольных растений, а в составе хроматина - при сравнении классов однодольных и двудольных,порядков двудольных, молодых и древних семейств в порядке Fabaies , а также отдельных триб в семействе Fabaceae.
Методом двумерного электрофореза в присутствии неионного детергента Тритона Х-100 исследована гетерогенность гистонов. Впервые у растений обнаружена специфичность гистонов Н2А и Н2В по составу электрофоретических компонентов.Субфракционный состав гистонов Н2А. и Н2В отличается у классов однодольных и двудольных растений, гистона НЕ - у триб бобовых.
На защиту выносятся следующие положения:
Белки хроматина бобовых формируют антигенные детерминанты, проявляющие специфичность на разных таксономических уровнях. Среди них выделено четыре типа детерминант. К первому типу относятся детерминанты, общие для белков бобовых и злаков. Ко второму типу -детерминанты, характерные для белков порядка Fabaies. К третьему - детерминанты, специфичные для белков группы филогенетически молодых триб семейства Fabaoeae - Vioieae t Trifoleae, Cioereae. И, наконец, к четвертому типу - антигенные детерминанты, характерные для белков отдельных триб. Первые два типа детерминант связаны преимущественно с гистонами, последние главным образом с негистоновыми белками.
Антигенная специфичность активнее проявляется у гистонов, связанных с ДНК в составе ДНП и хроматина. Причем, во фракциях гистонов бобовых присутствуют как общие, так и специфичные антигенные детерминанты. Последние наиболее характерны для фракции Щ,
Методом двумерного электрофореза в присутствии неионного детергента Тритона Х-100 четко выявляется гетерогенность гистонов HI, Н2А. и Н2В. Специфичность по составу электрофоретических компонентов гистона ЕЕ проявляется при сравнении триб бобовых, для фракций Н2А. и Н2В - при сравнении бобовых со злаками.
Работа выполнена в лаборатории белка и нуклеиновых кислот Всесоюзного научно-исследовательского института растениеводства им.Н.И.Вавилова под руководством академика ВАСШШ, доктора биологических наук, профессора В.Г.Конарева.
Основные белки хроматина - гистоны
У всех эукариотов гистоны представлены пятью основными классами. Наиболее изучены эти белки, выделенные из тимуса теленка: их физико-химические свойства и электрофоретический спектр используют в качестве стандарта, с которым сравнивают гистоны других видов. Общая характеристика гистонов тимуса теленка из работы К.Босгона и Э.Самнера (Бостон К., Самнер Э., 1981) приведена в таблице I.3.I.
Одной из характерных черт гистонов является их эволюционная консервативность. Однако, темпы эволюции отдельных фракций существенно различаются (Петров Н.Б. и др., 1979; Elgin s.c.R., Weintraub н. , 1975). Важно отметить также, что посттрансляционные модификации гистонов могут значительно увеличивать их вариабельность ( Be Lange R.J. , Smith E.L. , 1975). В связи с этим гистоны являются более изменчивыми белками, чем предпола Гистон H4. При электрофорезе гистон Н4 инвариантен у широкого крута объектов, включая растения и животных ( Elgin s.c.R., Weintraub н. , 1975). Высокая консервативность этой фракции показана также при изучении первичной структуры у позвоночных ( De Lange R.J. et al. , 1969; Sautiere P. et al . , 1971; Dixon G.H, et al, 1975) и беспозвоночных ЖИВОТНЫХ ( Woutersy-rou D. et al, , 1976), а также растений ( De Lange R.J. et al., 1969; De Lange R.J. et al. , 1973). Так, H4 фракция морского ежа И Теленка ОТЛИЧаЮТСЯ ОДНОЙ аМИНОКИСЛОТОЙ ( Woutersyrou D. et al. , 1976), а гороха и теленка - двумя ( De Lange R.J.et ад., 1969). Аминокислотные замены в гистоне Н4 консервативны и на кон-формацию молекулы в растворе, как показало изучение вторичной Структуры, НЄ ВЛИЯЮТ ( Pezolet М. et al., 1980). При анализе первичной структуры в работах указанных выше авторов отмечалось, что гистон Н4 гомогенен. Однако, в культуре клеток человека обнаружены множественные формы м-РНК этой фракции, из которых в цитоплазме транслируется лишь один тип м-РНК (Lichter А.С. et al., 1980). Гетерогенность Н4 обусловлена, главным образом, пострансля-ционными модификациями молекулы. Теоретически возможно существование 240 молекулярных типов этой фракции ( De Lange R.J. , Smith E.L. f 1975). При исследовании мест посттрансляционных модифшсаций оказалось, однако, что они происходят в определенных участках на и -конце молекулы, который, кшс полагают, взаимодействует с ДНК ( Crane-Robinson С. et al. , 1981). Так, в гистоне Н4 разного происхождения ацетилируются остатки лизина в позициях 5, 8, 12 и 16 ( De Lange R.J. et al. , 1968; De Lange R.J, et al. , 1969; Gandido E.P.M. , Dixon G.H. , 1971; Thwaits B.H. et al., 1976; Cohen B.U. et al. , 1981). Фосфатные группы могут присоединяться к остаткам гистидина в 18 и 75 позициях, а также серина в 47 ( Sung м. , Dixon G.H. , 1970; Smith E.L. et al. , 1973; De Lange R.J. , Smith E.L. , 1975; Martinage A. et al . , 1981). Метилирование H4 происходит по остатку лизина в 20 позиции ( De Lange R.J. et al., 1969; De Lange R.J., Smith E.L., 1975). Таким образом, число молекулярных типов гистона Н4, возникающих в результате посттрансляционных модификаций, ограничено и, по всей вероятности, не обеспечивает специфическую регуляцию генной активности в ядре. Гистон НЗ. Гистон НЗ, как и Н4, инвариантен при электрофорезе у позвоночных и беспозвоночных животных, а различия между животными и растениями выявляются лишь при проведении статистического анализа ( Panyim S. et al.,1970; Uadeau P. et al., 1974). Первичная структура гистона НЗ почти не изменилась в ходе эволюции позвоночных животных. К примеру, у карпа и теленка она идентична, исключая замену серина на нистеин в 96 позиции ( Hooper J.A. et al. , 1973; Brandt Y/.F. , von Holt C, 1972). Всего 3% аминокислотных остатков отличается при сравнении НЗ из тимуса теленка и проростков гороха ( De Lange R.J. et al. , 1972; De Lange R.J. et al. , 1973; Pathy L. et al. ,1973). По данным некоторых авторов эти замены не отражаются на вторичной Структуре МОЛеКуЛЫ ( Pezolet М. et al., 1980 ). Гистон НЗ у животных и растений гетерогенен. Одной из причин гетерогенности являются посттрансляционные модификации. Они происходят, как и в гистоне Н4, в определенных участках полипептидной цепи на и-конце молекулы ( De Lange R.J. , Smith E.L., 1975; Joshihida o. , Iwai K. , 1981). У млекопитающих гистон НЗ ацетилируется в 14 и 23 позициях ( Ruiz -Carillo А. , А11-frey V.G. , 1973; De Lange R.J. , Smith E.L. , 1975), a фосфорилированию подвергается серии в 10 и 28 позициях ( Sung м., Dixon G.H. , 1970; Marzluff W.F. Jr. , Mc Carty K.S. , 1972; Martinage A. et al . , 1981). У большинства изученных видов, в том числе и растений, метилируются остатки лизина в 9 и 27 позициях , а в некоторых тканях позвоночных - лизин в 36 позиции (De Lange R.J., Smith E.L., 1975; Yoshihida 0.,Iwai K., 1981). Гетерогенность гистона НЗ обусловлена также вариациями первичной структуры, что приводит к существованию нескольких типов молекул с единичными аминокислотными заменами. Микрогетероген-носгь гистона НЗ наблюдается на С-конце молекулы в позициях 89, 90 и 96. Она выявлена у ряда позвоночных и беспозвоночных животных (Yoshihida 0. , Iwai К. , 1981). Два молекулярных типа этой фракции присутствуют в проростках гороха: 6($ молекул гистона НЗ содержит в 96 позиции аланин, 4$ - серии ( Pathy L. et al., 1973).
Идентификация гистонов на электрофореграммах
Антигенная структура хроматина формируется в результате взаимодействия его основных компонентов: ДНК, гистонов и негистоновых белков. ДНК в составе этого надмолекулярного комплекса не является активным антигеном. Поэтому при иммунохимическом анализе хроматина мы оцениваем, в первую очередь, антигенные свойства его белковых компонентов.
Белки хроматина эволюционируют с разной скоростью. Это приводит к тому, что они могут проявлять специфичность на разных таксономических уровнях. Так, серологический анализ показал, что в составе ДНИ белки не различаются у родов и видов в пределах триб бобовых. В то же время при сравнении ДНИ разных триб выявляются как общие, так и специфичные антигенные детерминанты (Сидорова В.В., 1970).
В задачу нашего исследования входило изучение специфичности белков в составе хроматина бобовых. Для этого анализировали хроматин молодых и древних триб в семействе Fabaoeae , а также относящегося к порядку Fabaies древнего семейства Caesaipi-niaoeae. Кроме бобовых исследовались представители других порядков однодольных и двудольных растений. Хроматин проявляли сыворотками на эухроматин, гетерохроматин и ДНП гороха Pisum Sallys который в нашем исследовании представлял молодую трибу бобовых vioieae. Специфичность иммунохимической реакции оценивали, главным образом, по наличию "шпор", формирующихся с гетероло-гичными антигенами, а дополнительной характеристикой служила интенсивность преципитата.
Чтобы выяснить таксономический уровень, на котором антитела к эухроматину и гетерохроматину гороха реагируют с хроматином других систематических групп растений, реакцию проводили с хроматином однодольных, пшеницы Tritioum . aestivum и ржи Seoale eereale (порядок Graminaies ) и двудольных растений, гречихи Fagopyrum esoulentum (порядок Polygonales ) и гледичии Gieditschia sp. (порядок Fabales ). Оказалось, что с хроматином злаков и гречишных преципитат не формировался. А с хроматином гледичии, которая представляет древнее семейство бобоцветных Caesalpiniaoeae , образовалась одна линия преципитации (рис.3.1.1). Она свидетельствует о присутствии в хроматине гороха и гледичии идентичных антигенных детерминант. Отсутствие же реакции с однодольными и другим порядком двудольных указывает на то, что антигенная структура хроматина у них значительно отличается от таковой у гороха. Таким образом, антитела к эухро-матину и гетерохроматину гороха реагируют только с хроматином представителей порядка ГаЪа1ез.
Для сравнения антигенных свойств хроматина молодых и древних триб в семействе Fabaoeae проявляли хроматин гороха Pisum sativum (триба Vioieae ), клевера Trifolium pratense (триба Trifolieae ), фасоли Phaseolus vulgaris (триба Phaseoleae ), люпина Lupinus luteus (триба Genisteae ) Спектры преципитации представлены на рисунке 3.I.I. Иммунохимическая реакция хроматина бобовых с сыворотками на эухроматин и гетерохроматин неодинакова. Ее интенсивность убывает в следующем порядке: хроматин гороха, клевера, фасоли, люпина. Наибольшее число линий преципитации наблюдается в гомологичной реакции с хроматином гороха. При этом образование "шпор" со всеми гетерологичными антигенами свидетельствует о присутствии у гороха антигенных детерминант, которые не выявляются у представителей других триб. Причем, в гетерологичной реакции с хроматином клевера формируется меньше "шпор", чем с хроматином фасоли и люпина. Следовательно, наибольшее сходство по антигенным свойствам хроматина проявляют трибы Vicieae и Trifolieae. У них обнаружены общие антигенные детерминанты, которые не выявляются в хроматине представителей триб Phaseoleae и Genisteae.
Хроматин фасоли и люпина, взаимодействуя с антителами к эу хроматину, формирует преципитат, который сливается с одной из линий в спектре преципитации хроматина гороха. В то же время при сравнении фасоли и люпина между собой протекает реакция неполной идентичности и ее интенсивность с хроматином фасоли выше. Очевидно, антигенная структура хроматина триб Phaseoleae и Genlsteae, с одной стороны, проявляет сходство с хроматином трибы Vicieae, а, с другой стороны, отличается между собой.
На основании полученных результатов мы приходим к заключению, что в ходе эволюции семейства Fabaoeae сохраняются некоторые признаки структурной организации хроматина. Это заключение можно распространить также на весь порядок Fabaies , поскольку, как отмечалось в начале главы, хроматин гледичии, представляющий древнее семейство бобоцветных Caesaipiniaoeae , взаимодействует с антителами к эухроматину гороха. При этом следует отметить, что интенсивность реакции хроматина гледичии ниже, чем у люпина и фасоли, которые относятся к древним трибам бобовых Phaseoleae и Genisteae . Следовательно, внутри семейства Fabaoeae сходство антигенной структуры хроматина выше, чем при сравнении разных семейств в порядке Fabaies.
По данным современной систематики, трибы Vicieae и Trifo-lieae составляют наиболее молодую ветвь филогенетического древа бобовых. К ним примыкает триба Cicereae , которая недавно выделена из трибы виковых в ранг самостоятельной трибы (Kupioha F., 1978). Чтобы выяснить, насколько эволюция близких таксонов отражается на антигенных свойствах хроматина, мы анализировали хроматин представителей этих триб. На рисунке 3.1.2 представлены спектры преципитации хроматина гороха, клевера и нута Cioer axietinum, полученные с сыворотками на эухроматин и гетерохроматин. Интенсивность реакции у гороха выше, чем у клевера и нута. Слияние некоторых линий преципитации свидетельствует о присутствии в хроматине исследуемых триб общих антигенных детерминант. В то же время, у гороха обнаружены антигенные детерминанты, которые отсутствуют в хроматине клевера и нута. Так, с хроматином клевера формируется одна "шпора", а с хроматином нута - две. Это указывает на то, что антигенная структура хроматина у гороха и клевера более похожа, чем у гороха и нута. Таким образом, антигенная структура хроматина представителей молодых триб бобовых отличается между собой. Следовательно, в процессе дифференциации молодых триб антигенные свойства хроматина изменяются.
Антигенные свойства гистонов и негистоновых белков в составе хроматина бобовых
На электрофореграммах обнаружены пять компонентов, располагающихся по всей длине геля (рис.3.2.5.Б). При сопоставлении компонентного состава полученного спектра с электро-фореграммами гистонов и у -глобулинов выявленные компоненты идентифицировали следующим образом: верхний является у-глобулином, а остальные последовательно принадлежат гистонам Ш, Н2А и Н2В, НЗ, Н4. Следует отметить при этом, что гистон НІ присутствует на электрофореграмме в виде одной зоны слабой интенсивности. Очевидно, часть компонентов Щ в хроматине фасоли не связывается с антителами к эухроматину гороха и является специфичной. Аналогичные результаты получены с люпином и гледичией. Таким образом, антитела к гистонам, которые содержатся в сыворотке к эухроматину гороха, взаимодействуют с гистонами в хроматине представителей древних триб бобовых Phaseoleae и Genisteae , а также в хроматине представителя древнего семейства бобоцветных Caesai-piniaoeae . На этом основании можно заключить, что гистоны, за исключением отдельных компонентов HI, формируют в составе хроматина антигенные детерминанты общие для всего порядка Fataies.
Для изучения антигенных свойств негистоновых белков хроматин диссоциировали в растворе 2 М NaCI и подвергали ультрацентрифугированию. В результате ультрацентрифугирования содержание ДНК возрастает ко дну центрифужной пробирки, количество же белков при этом уменьшается. Наиболее контрастные различия по содержанию белков и нуклеиновых кислот имеют крайние фракции: верхняя содержит белки, нижняя - ДНК с недиссоциирующими белками. Спектры оптического поглощения этих фракций из хроматина гороха представлены на рисунке 3.2.6. Белковый состав верхней и нижней фракций, выделенных при ультрацентрифугировании хроматина, исследовали методом SDS - электрофореза (рис.3.2.7). Видно, что в наших опытах в растворе 2 М NaCI вместе с гистонами диссоциировали негистоновые белки.
Фракция HI диссоциирует полностью, тогда как некоторая часть гисто-нов Н2А, Н2В, НЗ, Н4 остается связанной с ДНК. Поскольку негисто-новые белки относительно слабо выявляются во фракции хроматина, содержащей ДНК и оседающей при ультрацентрифугирования, можно полагать, что основная их масса переходит в раствор 2 М NaCi.
Для того, чтобы исследовать влияние фракционирования на антигенную структуру хроматина, проводили иммунохимический анализ нефракционированного хроматина и фракций, выделенных при ультрацентрифугировании. Спектры преципитации, полученные с сыворотками к эухроматину, гетерохроматину, ДНП, суммарному гистону и фракции HI, представлены на рисунке 3.2.8. Антитела к гистону НІ не реагируют с фракцией хроматина, оседающей при ультрацентрифугировании, а сыворотка к суммарному гистону формирует с ней преципитат слабой интенсивности. Это подтверждает результаты SDS- электрофореза: гистон HI диссоциирует полностью, а остальные фракции частично соосаждаются с ДНК. Чтобы установить, изменяются ли антигенные свойства гистонов после осаждения ДНК, анализировали спектры преципитации, полученные в реакции нефракционированного хроматина и диссоциирующих в 2М NaCi белков с сыворотками к суммарному гистону и фракции HI (рис.3.2.8.Б и В). Осаждение ДНК не изменяет антигенные свойства HI, поскольку антитела к гистону HI формируют с этими фракциями хроматина сливающиеся преципитаты примерно. одинаковой интенсивности. Вместе с тем, в спектрах преципитации, полученных с сывороткой к суммарному гистону, падает интенсивность одной из линий преципитации. Это, по всей вероятноети,свидетельствует об изменении в результате фракционирования антигенных свойств других фракций гистонов.
На рисунке 3.2.8 видно также,что после экстрации белков интенсивность реакции хроматина с сыворотками к эухроматину,гетерохроматину и ДНП резко снижается.С этими сыворотками образуется преципитат, который почти не отходит от лунки с антигеном. Формирование преци- питата с этой фракцией хроматина объясняется, на наш взгляд, неполной диссоциацией гистонов. В то же время, белки хроматина, диссоциирующие в растворе 2 М NaCI, реагируют с антителами к эухрома-тину, гетерохроматину и ДНИ почти с такой же интенсивностью как и нефракционированный хроматин. Это означает, что антигенные детерминанты хроматина формируются белками, которые находятся в этой фракции. Помимо белков, в создании антигенной структуры хроматина у бобовых участвует ДНК, так как одна линия преципитации исчезает после ее осаждения. Следовательно, антигенная структура хроматина частично разрушается при его фракционировании. Учитывая результаты анализа фракций хроматина с антителами к гистонам, можно заключить, что ДНК участвует в формировании некоторых антигенных детерминант негистоновых белков.
Антигенные свойства и специфичность негистоновых белков у бобовых исследовали после их экстракции вместе с гистонами в растворе 2 М NaCI. Для этого использовали сыворотку к еухроматину, которая, как отмечалось в начале главы, содержит антитела преимущественно к негистоновым белкам. Параллельно проводили имму-нохимический анализ с сыворотками к суммарному гистону и очищенным фракциям. На рисунке 3.2.9 представлены спектры преципитации белков, экстрагированных из хроматина гороха, фасоли и люпина. Сыворотка к эухроматину горох;а формирует "шпоры" с гетерологичными антигенами, тогда как антитела к гистонам с белками этих растений дают реакцию идентичности. Это приводит к заключению, что негисто-новые белки проявляют специфичность на уровне триб в пределах семейства Fabaceae
Антигенные свойства и гетерогенность гистонов бобовых
Результаты изучения антигенных свойств гистонов бобовых показали, что они стимулируют образование антител как в свободном состоянии, так и в составе хроматина и ДНП. Это совладает с данными других авторов (Сидорова В.В., 1970; Сидорова В.В., 1973; Сидорова В.В., 1975; Сидорова В.В., Грушин А.А., 1979). При этом свободные гистоны, как и связанные с ДНК, активно взаимодействуют с антителами к очищенным фракциям гистона.
Проведенный сравнительный анализ свидетельствует, что антигенная специфичность гистонов, связанных с ДНК в составе ДНП и хроматина, выше, чем у гистонов в свободном состоянии. Так, антитела к очищенным фракциям гистонов гороха взаимодействуют с гис-тонами злаков: в нашей работе выявлена иммунохимическая идентичность гистона НЗ и частичная идентичность фракций НІ, Н2А и Н2В. В то же время антитела к гистонам, связанным с ДНК в составе эухроматина, гетерохроматина и ДНП гороха, реагируют только с гис-тонами в хроматине представителей порядка бобоцветных. Результаты иммунохимического анализа этих белков внутри порядка Fabaies также указывают на более высокую антигенную специфичность гистонов, связанных с ДНК. Сравнительный анализ гистонов и хроматина, проведенный с антителами к очищенным фракциям гистонов позволяет обнаружить у них преимущественно общие для всего порядка антигенные детерминанты. Антитела же к гистонам, которые содержатся в сыворотке к эухроматину, выявляют специфичность гистонов более четко. Судя по интенсивности проявления в гетерологичных реакциях с хроматином фасоли, люпина и гледичии, антигенные свойства гистонов отличаются при сравнении молодых и древних триб в семействе Fabaoeae, а также при сравнении относящихся к порядке Fabaes молодого семейства Fabaoeae И древнего Caesalpinia-оеае. Это отличие обусловлено, по всей вероятности, отдельными компонентами гистона HI,поскольку антитела к гистонам молодой трибы vioieae слабо взаимодействуют с этой фракцией в хроматине древних бобовых.
Методика выделения хроматина исключает воздействие на гисто-ны денатурирующих агентов и не приводит к диссоциации белковых комплексов хроматина (Miohalakis N.et al., 1976; Roark Б.Е. et al., 1976). Поэтому вероятнее всего, что в иммунохимической реакции хроматина участвуют не отдельные фракции гистона, а продукты их ассоциации между собой и с ДНК. Это предположение косвенно подтверждается при электрофоретической идентификации белков, участвующих в реакции хроматина фасоли, люпина и гледичии с антителами к эухроматину гороха: все фракции гистонов выявлены в составе одной линии преципитации.
Существуют данные, что при взаимодействии аргинин-богатых гистонов НЗ и Н4 их антигенные свойства изменяются. Причем, полагают, что в комплексе НЗ-Н4 происходит формирование новых антигенных детерминант ЭТИХ ГИСТОНОВ (Miohalakis N. et al.,1976;
Feldman L., Stollar B.D., 1977; Silver L.M. et al., 1978 ). Однако нельзя исключить, что изменение интенсивности иммунохимической реакции, которое обнаружили эти авторы, отражает не формирование новых, а изменение конформации существующих у отдельных фракций детерминант. Так, по данным Фелдмана и Столлара, фиксация комплемента при обработке комплекса гистонов НЗ-Н4 кислотой падает незначительно, С 90 ДО 1Ъ% ( Feldman Ъ., Stollar B.D., 1977). Даже если допустить, что в комплексе НЗ-Н4 формируются новые антигенные детерминанты, маловероятно, что антигенная специфичность гистонов при этом усиливается. Антигенная структигенная структура комплекса НЗ-Н4, по-видимому, ташке консервативна в ходе эволюции, как и первичная структура составляющих этот комплекс фракций. Показано, например, что антитела к комплексу НЗ-Н4 тимуса теленка взаимодействуют с хроматином некоторых тканей крысы, представителя другого отряда млекопитающих (Музу-ров И.В., 1981).
Относительно антигенной специфичности комплекса гистонов Н2А-Н2В сведения в литературе практически отсутствуют. Известно, однако, что антигенные свойства фракций Н2А. и Н2В изменяются при взаимодействии между собой. Причем, по данным некоторых авторов, антитела к комплексу Н2А.-Н2В не реагируют с хроматином в отличии от антител к очищенным фракциям ( Miohalakis N. et al., 1976). В работах ке других исследователей отмечается, что в сыворотках к хроматину содержатся антитела, которые направлены против антигенных детерминант характерных именно для комплекса Н2А.-Н2В, но не для очищенных фракций (ОДузуров И.В., 1981). По-видимому, в зависимости от структурного состояния хроматина может изменяться доступность антигенных детерминант характерных для очищенных фракций гистонов и их комплексов.
Проведенный анализ с сыворотками к очищенным фракциям показал, что в составе препарата нефракционированного гистона и в составе хроматина у гистонов выявляются идентичные антигенные детерминанты. Возможно, на полученных результатах отражается то, что реакции проводились с антителами к гистонам, экстрагированным растворами неорганических кислот. Так, по данным литературы, антитела к гистону НЕ, экстрагированному солевым раствором, реагируют активнее с гистоном НЕ, полученным при аналогичной экстракции, чем с гистоном ЕЕ, экстрагированным соляной кислотой. Фиксация комплемента падает при этом с 80 до 40 . В то же время, антитела к экстрагированному кислотой гистону Ж реагируют с этими препаратами гистонов с одинаковой интенсивностью (Федорова Н.А., 1979; Miohalakis N. et al., 1976). Аналогичные результаты были получены при изучении комплекса НЗ-Н4 и составляющих этот комплекс фракций ( Feldman L. , Stoliar B.D., 1977). В сыворотках к эухроматину и гетерохроматину содержатся антитела к гис-тонам, не подвергавшимся денатурирующим воздействиям. Однако, и в реакциях с этими сыворотками антигенные свойства очищенных гистонов и гистонов в составе хроматина в наших опытах не различались. Поэтому мы полагаем, что обнаруженная более высокая антигенная специфичность гистонов в хроматине лишь отчасти объясняется формированием в его составе гистон-гистоновых комплексов. Для усиления антигенной специфичности гистонов в хроматине существенное значение имеет, по всей вероятности, взаимодействие с ДНК. Полагают, что взаимодействие с ДЕК способствует сохранению нативной конформации гистонов и увеличивает их антигенную активность (Конарев В.Г., 19736). Это согласуется с данными иммунохимического анализа белков хроматина после осаждения ДНК. Причем, полученные результаты указывают на то, что ДНК влияет, в первую очередь, на антигенные свойства гистонов, участвующих в формировании нуклеосом, тогда как антигенные свойства HI после ее осаждения практически не изменялись. Представленные сведения хорошо укладываются в существующие представления о функциональной роли гистонов в хроматине (Бостон К., Самнер Э., 1981) и согласуются с данными о степени доступности антигенных детерминант отдельных фракций в составе этого надмолекулярного комплекса (Федорова Н.А., 1979; Goldblatt D., Bustin М., 1975).
