Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1. Общие представления о секреции белков 10
1.1. Транслокационный аппарате, coli 13
1.1.1. SecA - транслокационная АТРазаЕ coli 13
1.1.2. Транслоказа SecYEGDFYajC 15
1.2. Модель Sec-зависимого секреторного пути 19
2. Молекулярные шапероны и их роль в секреции белков.. 22
2.1. Общее представление о шаперонах 22
2.2. Неспецифические шапероны Е. coli 26
2.2.1. Белки DnaK/J, GrpE 26
2.2.2. Белки GroEL/ES 28
2.2.3. SRP 31
2.3. Экспорт-специфический шаперон SecB 33
2.3.1. Кристаллическая структура SecB 33
2.3.2. Взаимодействие SecB с пребелками 36
2.3.3. Взаимодействие шаперона SecB с транслокационной ATPasonSecA 39
2.3.4. Взаимодействие комплекса пребелок-SecB-SecA и белков транслокационного канала 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1.Материалы 44
2.1.1. Бактериальные штаммы 44
2.1.2. Плазмиды 44
2.1.3. Среды и растворы 44
2.1.4. Реактивы 46
2.2.Методы 47
2.2.1.Условия культивирования 47
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК 47
2.2.3. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация48
2.2.4. Определение активности щелочной фосфатазы 49
2.2.5. Анализ спектра изоформ щелочной фосфатазы 49
2.2.6. Субклеточное фракционирование 50
2.2.7. Определение скорости превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo 50
2.2.8. Электрофорез белков 51
2.2.9. Иммуноблотинг 51
2.2.10. Иммунопреципитация 52
2.2.11. Определение концентрации белка 52
3. Результаты исследования 53
Секреция щелочной фосфатазы зависит от присутствия в клетках белка SecB 53
3.1.1. Зависимость секреции щелочной фосфатазы от SecB определяется температурой культивирования 54
3.1.2. Влияние SecB на секрецию зависит от источника углерода для роста клеток 57
3.1.3. Секреция щелочной фосфатазы, но не синтез и посттрансляционная модификация зависит от присутствия SecB 58
Секреция щелочной фосфатазы зависит от активности SecA и эта зависимость определяется наличием в клетке SecB 62
Белки SecB и SecA взаимодействуют с экспорт-инициирующим доменом зрелой части щелочной фосфатазы 65
3.3.1. Влияние SecB и SecA на секрецию щелочной фосфатазы определяется первичной структурой экспорт-инициирующего домена 66
3.3.2. Содержание белков SecB и SecA в клетках Е. coli не зависит от уровня секреции щелочной фосфтазы, определяемого первичной структурой экспорт-инициирующего домена 70
3.3.3. Содержание цитоплазматических факторов секреции в иммунопреципитате предшественника щелочной фосфатазы зависит от первичной структуры его экспорт-инициирующего домена 72
3.4. N-концевая область сигнального пептида не участвует во взаимодействии с белками SecB и SecA, но делит с ними функцию таргетинга преРпоАк мембране 73
3.4.1. Смена заряда N-концевой области сигнального пептида снижает секрецию щелочной фосфатазы в зависимости от содержания в клетках белка SecB 74
3.4.2. Влияние смены заряда N-концевой области сигнального пептида на секрецию щелочной фосфатазы зависит от активности белка SecA 78
3.4.3. Смена заряда N-концевой области сигнального пептида увеличивает зависимость секреции от SecB и SecA, и не влияет на их содержание в иммунопреципитате PhoA 79
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 82
Выводы 90
Литература 91
- Транслокационный аппарате, coli
- Бактериальные штаммы
- Зависимость секреции щелочной фосфатазы от SecB определяется температурой культивирования
- Содержание цитоплазматических факторов секреции в иммунопреципитате предшественника щелочной фосфатазы зависит от первичной структуры его экспорт-инициирующего домена
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Многие белки, синтезируемые в цитоплазме бактерий, для осуществления своих функций должны транслоцироваться через цитоплазматическую мембрану, чтобы занять определенное место в клеточной оболочке бактериальной клетки или выделиться в окружающую среду. Этот процесс, называемый секрецией, лежит в основе биогенеза этих белков и надмолекулярных клеточных структур, взаимодействия клетки с окружающей средой. Знание принципов межмолекулярных взаимодействий между указанными компонентами и секретируемым белком необходимо для понимания молекулярного механизма секреции, без чего, в свою очередь, невозможно решить многие проблемы клеточной биологии и биотехнологии. Сказанное определяет актуальность исследования секреции белков и его различных этапов.
Состояние проблемы.
Информация о транслокации белка из цитоплазмы в специфические клеточные компартменты, находящаяся в структуре самого белка, реализуется с помощью секреторного аппарата. В настоящее время биохимически и генетически наиболее полно охарактеризован секреторный аппарат Escherichia coli. В него входят цитоплазматические и мембранные Sec белки (Fekkes, Driessen, 1999), а также фосфолипиды (van Voorst F., de Kruijff В. 2000). К цитоплазматическим белкам относятся экспорт-специфический шаперон SecB (Kumamoto, Beckwith, 1985), а также неспецифические шапероны GroEL/ES (Kusukawa et al, 1989; Altman et al., 1991), DnaK/J и GrpE (Altman et al, 1991; Wild et al, 1992; Wild et al, 1996). Существует и другой фактор таргетинга, который является гомологом эукариотической сигнал узнающей частицы (SRP), он помогает транслокации преимущественно мембранных белков (De Gier et al, 1997). Шапероны участвуют в транслокации предшественников белков (пребелков) за счет стабилизации развернутой конформации их вновь синтезированных
7 полипептидных цепей (Hendrick, Hartl, 1993), компетентной для транслокации через мембраны. Кроме того, экспорт-специфический шаперон SecB направляет пребелок к мембраносвязанному транслокационному каналу за счет своего специфического взаимодействия с ее компонентом - белком SecA (Fekkes et al., 1997). Мембраносвязанный транслокационный канал состоит из периферического белка SecA - транслокационной АТРазы (Oliver, Beckwith, 1982), и комплекса интегральных мембранных белков SecY, SecD, SecE, SecF, SecG, и YajC, которые формируют собственно транслокационньтй канал (транслокон) (Fekkes, Driessen, 1999). SecA играет центральную роль в транслокации белков. Во-первых, SecA функционирует в качестве рецептора для комплекса SecB-пребелок (De Cook, Randall, 1998), направляя его к транслокону. Во-вторых, он является молекулярным мотором, непосредственно участвующим в транслокации путем связывания пребелка и входа вместе с ним в транслокационный канал (Economou, Wickner, 1994). Повторяющиеся циклы входа SecA в мембрану и выхода из нее за счет конформационных изменений белка (Van der Does et al., 1998) регулируются связыванием и гидролизом ATP. В настоящее время модель SecB-зависимого направления пребелков к мембранному транслокону (SecA-SecYEG) подробно описана, а новые данные по структурной организации SecB позволяют понять некоторые принципы межмолекулярных взаимодействий между указанными компонентами секреторной машины и секретируемыми белками (Driessen et al., 2001). Но, несмотря на то, что SecB является основным экспорт-специфическим шапероном, не выяснено полностью, в секреции каких белков он принимает участие, какие факторы определяют взаимодействие его с секретируемыми белками. В частности, до сих пор нет единого мнения о влиянии его на секрецию щелочной фосфатазы. Не выяснены полностью и требуют решения молекулярные основы взаимодействия компонентов секреторного аппарата и секретируемых белков. Это касается и специфичности участков взаимодействия SecB и SecA с предшественниками секретируемых белков при инициации секреции.
8 Неизвестно, взаимодействуют ли эти белки с экспорт-инициирующим доменом зрелого белка, важным для секреции, вносит ли сигнальный пептид и, в частности, его положительно заряженная N-концевая область какой-то вклад в это взаимодействие.
Цель данной работы - выяснить механизм вовлечения в секрецию белка, на примере щелочной фосфатазы Escherichia coli, цитоплазматических компонентов секреторного аппарата - экспорт-специфического шаперона SecB и транслокационной АТРазы SecA.
В задачи исследования входило: оценить влияние белков SecB и SecA на секрецию щелочной фосфатазы; выявить, определяется ли влияние этих белков на секрецию первичной структурой щелочной фосфатазы, и взаимодействуют ли белки SecB и SecA с экспорт-инициирующим доменом ее зрелой полипептидной цепи; установить вклад положительно заряженной N-концевой области сигнального пептида предшественника щелочной фосфатазы в его взаимодействие с белками SecB и SecA и в направление пребелка к мембране.
Научная новизна работы
В данной работе впервые установлена зависимость секреции щелочной фосфатазы (PhoA) от цитоплазматического шаперона - белка SecB. В наибольшей степени эта зависимость проявляется при 30 С, что подтверждает гипотезу о том, что потребность в SecB для секреции белка определяется скоростью его сворачивания.
Впервые показано, что влияние белков SecB и SecA на секрецию щелочной фосфатазы зависит от структуры N-концевой области зрелой полипептидной цепи белка - экспорт-инициирующего домена. Выявлено, что SecB и SecA взаимодействуют с щелочной фосфатазой вблизи участка отщепления сигнального пептида. С использованием метода
9 коиммунопреципитации показано, что мутация в этой области, существенно подавляющая секрецию, нарушает взаимодействие пребелка с цитоплазматическими компонентами секреторной системы SecB и SecA, что может быть причиной такого подавления.
Показано, что положительно заряженный участок сигнального пептида не вовлекается в прямое взаимодействие пребелка с SecB и SecA. Смена заряда сигнального пептида, однако, существенно увеличивает зависимость секреции от этих белков, впервые свидетельствуя, во-первых, о вкладе этой области в функционирование сигнального пептида в качестве внутримолекулярного шаперона, а также в функцию таргетинга белка к мембране, которую сигнальный пептид разделяет с белками SecB и SecA.
Научно-практическое значение работы
Полученные в работе новые данные о секреции щелочной фосфатазы расширяют представление о механизме посттрансляционной транслокации белка и роли цитоплазматического шаперона SecB и транслокационной АТРазы SecA в этом процессе, о принципах взаимодействия топогенных последовательностей секретируемого белка с секреторным аппаратом клетки. Данная работа является фундаментальным исследованием, однако, полученные результаты могут иметь и практическое значение для повышения вывода из цитоплазмы ценных рекомбинантных белков при их повышенном синтезе.
Транслокационный аппарате, coli
Белок SecA - наиболее важный компонент Sec секреторного аппарата. Он распознает секретируемые пребелки в цитоплазме (Akita et al., 1990), способствует их вхождению в мембранный транслокационный комплекс (Duong, Wickner, 1997а; Duong, Wickner, 1997b) и осуществляет транслокацию пребелка через мембрану (Geller, 1991).
SecA представляет собой большой конформационно сложный белок (рис. 1). Он функционирует в виде димера с молекулярной массой мономера 102кДа (Driessen, 1993). SecA состоит из двух основных доменов: N-концевого домена, молекулярной массой 68 кДа и С-концевого домена, молекулярной массой 34 кДа (Price et al, 1996). Более консервативный N-концевой домен формирует АТРазный кор, который гомологичен АТРазному кору RNA-хеликаз и содержит два нуклеотид-связывающих участка (NBS, nucleotide binding site): - нуклеотид-связывающий участок высокого сродства к нуклеотидам (NBS1) в N-концевой области и нуклеотид-связывающий сайт низкого сродства к нуклеотидам (NBS2) в С-концевой области. NBS1 содержит две Walker последовательности (Walker А и Walker В). Менее консервативный С-концевой домен способствует димеризации мономера SecA. N- и С-концевой домены взаимодействуют друг с другом (Matsuyama et al., 1990). Для этого взаимодействия важен участок IRA1 (intramolecular regulator of ATPase), находящийся в С-концевом домене.
Он необходим для сопряжения гидролиза АТР с транслокацией белка (Karamanou et al, 1999). Кроме того, С-концевой домен взаимодействует с SecB (den Blaauwen et al., 1997; Fekkes et al, 1998), анионными фосфолипидами (Breukink et al 1995) и компонентом мембранного транслокона SecY (Snyders et ah, 1997). Область SecA, локализованная между двумя нуклеотид-связывающими участками, вовлечена во взаимодействие с секретируемыми белками (Kimura et al, 1991).
SecA претерпевает существенные нуклеотид индуцированные конформационные изменения в ходе транслокации. Связывание ADP в NBS1 увеличивает взаимодействие между N- и С-концевыми доменами, и молекула приобретает более компактную конформацию. В противоположность этому, связывание АТР в NBS1 приводит к расплавленной конформации SecA со слабым взаимодействием между N- и С-концевыми доменами. В этих условиях аминокислотные остатки, которые располагались внутри молекулы, становятся локализованными на поверхности молекулы. Это означает, что энергия, освобождающаяся в ходе гидролиза АТР в NBS1, используется для смены термодинамически невыгодной конформации, подобно освобождению пружины, и эта конформационная энергия освобождается при обмене связанного ADP на АТР и осуществляет транслокацию пребелка (Matsuyama etal., 1990).
Связывание ADP в NBS2 влечет за собой более существенные конформационные изменения, чем связывание АТР в NBS1, и приводит к формированию высоко компактной структуры SecA. Кроме того, увеличивается размер поверхности мономера, участвующего в образовании димера, и взаимодействие между субъединицами становится плотнее. NBS2 локализован либо на поверхности субъединицы SecA в области, которая вовлечена в димеризацию, либо рядом с ней. Связывание нуклеотидов в NBS2 может таким образом влиять на пространственное положение двух С-концевых доменов димера SecA, который, встраивается в мембрану во время цикла транслокации (Matsuyama et al., 1990).
Мембранный компонент транслокационного аппарата состоит из шести интегральных белков цитоплазматической мембраны: пяти Sec белков -SecY, SecE, SecG, SecD и SecF, и белка YajC, входящего в состав secD оперона. Белки SecY и SecE являются основными компонентами транслоказы. Только их присутствие в протеолипосомах достаточно для связывания и встраивания SecA, его активации как АТРазы и, в определенной степени, для транслокации предшественника белка внутрь протеолипосомы (Duong, Wickner, 1997а).
Бактериальные штаммы
Минеральная среда (Torriani, 1966) для изучения секреции щелочной фосфатазы (г/л): NaCl 4,68; КС1 1,49; NH4CI 1,07; трис-основание 6; источник углерода 5, MgS04x 7 Н20 0,205; СаС12, 0,044; Na2S04, 0,099; FeCl3, 5,6 х 10"4; пептон 0,7; тиамин 0,01; К2НР04 1 мМ, рН 7,8. В качестве источника углерода использовали глюкозу, мальтозу, глицерин.
Среда для получения трансформантов (Sambrook, 1989).: LB (г/л): бактотриптон 10, дрожжевой экстракт 5, NaCl 10, рН 7,5. 2YT (г/л): бактотриптон 16, дрожжевой экстракт 10, NaCl 5, рН 7,5. Для получения агаризованных сред добавляли агар до 1,5%.
Буферы и растворы для выделения ДНК плазмид (Sambrook et al, 1989): Раствор I: 50 мМ глюкоза, 25 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА. Раствор II: 0,2 М NaOH, 1% ДДС-Na. Раствор III: З М ацетат калия, рН 4,8. Буфер ТЕ: 10 мМ трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА. ТВЕ буфер для электрофореза ДНК: 0,089 М трис-ОН, 0,089 М борная кислота, 0,2 мМ ЭДТА.
Растворы для получения компетентных клеток: Раствор 1: 50 мМ СаС12, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Раствор 2: 75 мМ СаС12, 15% (V/V) глицерин, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0.
Растворы для иммунологических реакций: TBS буфер: 20 мМ трис-НСІ, 220 мМ NaCl, рН 7,5. TBS буфер: 20 мМ трис-НСІ, 220 мМ NaCl; 0,1% tween 20, рН 7,5. Блокирующий раствор: 0,05% казеин в TBS.
Буфер для электропереноса белков: 25 мМ трис-НСІ, 200 мМ глицин, 20% метанол, 0,2%о SDS.
Проявитель (г/л): Na2SC 3 72, метол 2,2, Na2CCb 48, гидрохинон 8,8, КВг 4, бензотриазол 0,1. Закрепитель (г/л): NH4CI 50, Na2S203 х 5Н20 250.
Буферы для электрофореза белков: Буфер для разделяющего геля: 1,125 М трис-НСІ, рН 8,8. Буфер для концентрирующего геля: 0,625 М трис-НСІ, рН 6,8. Электродный буфер: 250 мМ трис-НСІ, 190 мМ глицин, 0,1% ДДС-Na, рН 8,4 Раствор для определения ферментативной активности щелочной фосфатазы:
Раствор субстрата: / нитрофенилфосфат 0,2%, 100 мМ трис-НСІ, 10 мМ MgCI2,pH8,5. Растворы для сферопластирования: Стабилизирующий буфер: 0,45 М сахароза, 50 мМ трис-HCl, рН 8,0. Лизирующий буфер: 0,01 М трис-НСІ, 0,01 М MgCl2, рН 8,0. Солюбилизирующий буфер: 0,01 М трис-НСІ , 0,01 М MgCl2, 2% (V/V) тритон-ХЮО, 4 мМ ФМСФ, рН 8,0.
Растворы для иммуноприципитации: Буфер А: 2% (v/v) тритон-ХЮО, 50 мМ трис-НСІ, 0,15 М NaCl, ОД мМ ЭДТА, 1мМ ДТТ,рН8,0.
В работе были использованы следующие ферменты и реактивы: акриламид, бисакриламид, тритон Х-100, ЭДТА, Х-Р, ДТТ, ФМСФ, ДДС-Na, бромистый этидий, казеин, лизоцим и сахароза фирмы "Serva" (Германия), а-нафтилфосфат, /?-нитрофенилфосфат фирмы "Sigma" (США), агароза фирмы "Bio-Rad" (США), бактотриптон фирмы, дрожжевой экстракт, агар фирмы "Difco" (США), пансорбин фирмы "Calbiochem" (США), краситель прочный красный (Fast Red TR) фирмы "Chemapol" (Чехословакия), хемилюминисцентный субстрат для детекции HRP фирмы "Amersham", L-[ S] метионин ИВЭ (г. Обнинск). Афинно очищенные кроличьи антитела к щелочной фосфатазе, белкам SecB и SecA Е. coli любезно предоставлены М.В. Богдановым. Все остальные реактивы были отечественного производства марки "хч" или "осч".
Клетки Е. coli культивировали до середины логарифмической фазы на минеральной среде (Torriani, 1966). Для индукции синтеза щелочной фосфатазы под контролем pho промотора клетки на логарифмической стадии роста осаждали центрифугированием, дважды отмывали раствором 0,14 М NaCl при 4С и ресуспендировали в той же среде, но не содержащей ортофосфат и пептон. Синтез щелочной фосфатазы под контролем промотора PBAD индуцировали добавлением 0,5 % арабинозы. Во всех случаях клетки культивировали после индукции в течение 1 ч при интенсивной аэрации. Для ингибирования активности белка SecA в среду роста добавляли 2мМ азид натрия. Для остановки биосинтетических процессов использовали мертиолят в конечной концентрации 0,02%. Для поддержания плазмид pSAP-1, pSAP-2, pSAP-3, pSAP-10, pSAP-12, pSAP-13 и pSAP-14 использовали ампициллин (100 мкг/мл), фагмиды рРНОАІЗ - хлорамфеникол (25 мкг/мл). Для клеток штамма СК1953 в среду добавляли канамицин (50 мкг/мл).
Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook et al.,1989), с некоторыми модификациями. 100 мл среды 2х YT инокулировали колонией Е. coli, несущей плазмиду, и инкубировали на роторной качалке при 37 С 16-20 ч. Клетки осаждали центрифугированием (J2-21, JA-20, 4С, 4000 g, 5 мин). Полученный осадок ресуспендировали в 3,5 мл раствора I. Для лизиса клеток к осадку добавляли 8 мл раствора II, плавно перемешивали до полного просветления и инкубировали при 4 С 10 мин. К лизату добавляли 6 мл раствора Ш, встряхивали и охлаждали во льду в течение 15 мин. Лизат центрифугировали (JA-20, 18000 g, 2С, 20 мин). К полученному супернатанту приливали 10,5 мл изопропанола, инкубировали при комнатной температуре 5 мин и центрифугировали (JA-20, 15000 g, 10 С, мин). Осадок промывали 2 мл 75% этилового спирта, подсушивали и растворяли в 900 мкл ТЕ. Раствор переносили в мини-пробирки. Осаждение РНК и хромосомной ДНК проводили путем добавления 50 мкл 1 М СаСІг (до 50 мМ) и последующим центрифугированием в течение 1 мин (Eppendorf, 14000 об/мин).
Зависимость секреции щелочной фосфатазы от SecB определяется температурой культивирования
Единичную колонию засевали в 5 мл 2xYT, и выращивали в течение ночи с качанием 12-14 ч при 37С. Ночную культуру разбавляли в 100 раз в 50 мл 2xYT и выращивали при интенсивной аэрации в колбе Эрленмейера при 37С до А59о = 0,4. Дальнейшие процедуры проводили при 0С. Культуру охлаждали в течение 10 мин и центрифугировали 10 мин при 3000 g. Клетки ресуспендировали в 30 мл раствора 1 и оставляли во льду на 30 мин. Затем осаждали и осадок мягко ресуспендировали в 3 мл раствора 2. Компетентные клетки фасовали в мини-пробирки и хранили при -70 С. Компетентные клетки, полученные данным способом, обеспечивали воспроизводимый уровень трансформации, который составлял 1x10 - 1x10 бактериальных клонов на 1 мкг ДНК, в течение 2-3 месяцев хранения.
Для трансформации к 200 мкл размороженных компетентных клеток добавляли 5-20 мкл раствора трансформируемой ДНК, перемешивали и инкубировали в ледяной бане 30-60 мин. После этого проводили тепловой шок в течение 90 с при 42 С и охлаждали в ледяной бане 10 мин. Далее к клеткам добавляли 0,8 мл среды 2xYT, перемешивали и инкубировали при 37С в течение 60 мин. Клетки высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей селективный антибиотик, и инкубировали при 37 С до появления единичных клонов.
Активность щелочной фосфатазы определяли по скорости гидролиза р нитрофенилфосфата (Torriani, 1960), принимая за единицу ферментативной активности (Е) количество фермента, гидролизующего 1 мкМ субстрата за 1 мин при 37С. Активность фермента в пробе рассчитывали по формуле: ОПшхК мЕ1 мл = — txV 5гДе
К=172,4 - коэффициент пересчета в нмолях / -нитрофенола, по калибровочной кривой по / -нитрофенолу; ОГЦоо - оптическая плотность реакционной смеси при 400 нм; V - объем пробы в мл; t - время инкубации с уО-нитрофенилфосфатом, мин. К 0,5 мл культуры клеток приливали 0,5 мл раствора субстрата. Смесь инкубировали при температуре 37С в течение 5-20 мин до развития желтой окраски. Реакцию останавливали добавлением 2 мл раствора 0,4 М NaOH. Образовавшийся осадок удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 10 минут.
Удельную активность щелочной фосфатазы выражали как отношение активности мЕ в 1 мл на количество белка.
Изоформы щелочной фосфатазы выявляли во фракциях периплазмы по активности фермента непосредственно в 7,5% полиакриламидном геле после электрофореза в неденатурирующих условиях (Davis, 1964) путем обработки гелей а-нафтилфосфатом и красителем быстрым красным (Fast Red Dye) (Лойданд/?., 1982).
Получение субклеточных фракций проводили по методу Миуры и Мицусимы (Miura, Mizushima, 1968). Клетки осаждали центрифугированием (MLW К-24, 5000 g) промывали дважды 0,14 М NaCl, осадок клеток суспендировали в стабилизирующем буфере и обрабатывали лизоцимом. За ходом лизиса следили по образованию осмотически лабильных клеток (сферопластов) по падению оптической плотности суспензии клеток в воде. (Пробы отбирали по 0,2 мл и добавляли в 2 мл воды и стабилизирующего буфера). После падения оптической плотности в воде на 90 % или менее (для получения качественной периплазмы) сферопласты осаждали при 16 000 g в течение 30-60 минут. Полученная надосадочная жидкость представляет собой периплазму. Сферопласты лизировали с помощью осмотического шока. Для этого их суспендировали в 0,5 мл стабилизирующего буфера и затем суспензию разбавляли лизирущим буфером 1:20. Осмотический шок проводили с помощью гомогенизатора. Для экстракции белков цитоплазматической мембраны использовали метод селективной солюбилизации из лизата сферопластов и мембран (Scnaitman, 1971). К лизату добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 2 %. Обломки мембран удаляли центрифугированием при 6000 g в течение 15 мин.
Динамику превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo анализировали с помощью импульсного мечения белков [35S] метионином (Michaelis сі аі, 1986). К 200 мкл культуры Е. cull через 10 мин после индукции щелочной фосфатазы при 30С, в условиях голодания по фосфору или в присутствии арабинозы, добавляли 20 мкл раствора [ S] метионина до конечной концентрации 50 мкКи/мл. Через 60 с включение [ S] метионина останавливали добавлением немеченой аминокислоты (70 мкл 0,2 % раствора метионина в минеральной среде) до конечной концентрации 0,05 %. Через определенные промежутки времени, после прекращения включения метки, отбирали аликвоты культуры (70 мкл). Белки осаждали 10% ТХУ, иммунопреципитировали кроличьими антителами против денатурированной щелочной фосфатазы Е. coli и разделяли с помощью электрофореза с последующей радиоавтографией на фосфоримиджере "Bio-Rad" (США). Относительное количество предшественника и зрелой формы фермента рассчитывали по площади пиков (с учетом разницы количества метионинов в предшественнике и зрелой форме щелочной фосфатазы) с помощью программы OptiQuant.
Содержание цитоплазматических факторов секреции в иммунопреципитате предшественника щелочной фосфатазы зависит от первичной структуры его экспорт-инициирующего домена
Для оценки секреции щелочной фосфатазы использовали два подхода. Один заключается в анализе активности щелочной фосфатазы в культуре клеток-продуцентов (Boyd et al., 1987), так как щелочная фосфатаза становится активной только после транслокации через мембрану в периплазму, где происходит формирование активной макромолекулы фермента за счет образования дисульфидных связей и димеризации субъединиц (Kamitani et al., 1992). Второй включает оценку динамики превращения радиоактивно меченого предшественника в зрелую форму, которое происходит в результате отщепления сигнального пептида (процессинг) также после транслокации белка (Michaelis et al., 1983).
В данной части работы участие белка SecB в секреции щелочной фосфатазы было изучено при разных температурах индукции фермента: 23С, 30С, 37С и 42С. Изучали секрецию белка, кодируемого как хромосомным геном phoA, так и этим же геном, клонированным в плазмиде, в зависимости от содержания в клетках белка SecB.
Из таблицы 1 видно, что секреция щелочной фосфатазы, о которой судили по активности фермента, зависит как от содержания SecB в клетках, так и от температуры культивирования. Так при экспрессии гена щелочной фосфатазы, клонированного в плазмиде, в клетках, содержащих SecB, активность щелочной фосфатазы снижается в 45 раз и в 17 раз при температурах 42С и 23С соответственно, а при экспрессии хромосомного гена щелочной фосфатазы - в 5 раз и 4 раза при температурах 42 С и 23 С соответственно. Активность щелочной фосфатазы в клетках, содержащих SecB, примерно одинакова при температурах 37С и 30С как в случае экспрессии хромосомного гена щелочной фосфатазы, так и в случае экспрессии гена щелочной фосфатазы, клонированного в плазмиде.
Примечание. В таблице представлены средние результаты семи опытов. Стандартное отклонение не превышало 10%.
В таблице 2 представлена SecB-зависимость секреции щелочной фосфатазы, которая представляет собой отношение удельных активностей щелочной фосфатазы в клетках, содержащих и не содержащих SecB. При температурах 37С и 30С активность щелочной фосфатазы выше в клетках, содержащих SecB, при экспрессии как хромосомного (в 1,3 и 1,9 раза соответственно), так и гена, клонированного в плазмиде (в 1,2 и 2,8 раза соответственно). При температуре 23 С несколько выше в присутствии SecB при экспрессии хромосомного гена (1,1) и при экспрессии гена, клонированного в плазмиде (1,2). При температуре 42 С в условиях экспрессии гена, клонированного в плазмиде, активность щелочной фосфатазы была выше в клетках, не содержащих SecB (0,6), а в условиях экспрессии хромосомного гена одинакова в обоих штаммах (1,0).
Таким образом, можно заключить, что секреция щелочной фосфатазы, о которой судили по активности фермента, зависит от наличия белка SecB в клетках, причем она выше в клетках, содержащих SecB практически при всех температурах (за исключением температуры 42 С) и независимо от уровня экспрессии гена. Можно предположить, что секреция щелочной фосфатазы в клетках Е. coli является SecB-зависимой. Эта зависимость наиболее высока при температуре 30С как при экспрессии хромосомного, так и гена, клонированного в плазмиде (1,9 и 2,8). По-видимому, при этой температуре скорость сворачивания белка является наиболее благоприятной для взаимодействия с SecB.
Ранее было показано, что синтез SecB подвергается катаболитной репрессии и количество белка SecB в клетках Е. coli увеличивается при росте культуры на глицерине в качестве источника углерода по сравнению с клетками, растущими на глюкозе (Seoh, Tai, 1997). Нами было проведено изучение секреции в зависимости от используемого источника углерода (глюкоза, мальтоза, глицерин) в клетках Е. coli, содержащих и не содержащих SecB.
Из таблицы 3 видно, что секреция щелочной фосфатазы зависит от присутствия SecB при выращивании клеток на любых источниках углерода. Она почти одинакова в клетках, выращенных в присутствии глюкозы и мальтозы (SecB-зависимость 1,8 и 1,6 соответственно) и существенно выше в присутствии глицерина (SecB-зависимость 2,8). В дальнейшем, для изучения зависимости секреции щелочной фосфатазы от содержания в клетке SecB клетки культивировали на глицерине и при температуре 30С.
В этой части работы проведено более подробное изучение секреции щелочной фосфатазы в клетках, выращенных в оптимальных условиях для проявления зависимости секреции от содержания в них SecB. Секреция щелочной фосфатазы была изучена с помощью двух подходов. Кроме того, было изучено влияние SecB на синтез и посттрансляционную модификацию щелочной фосфатазы.
