Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибосома - это многокомпонентная макромолекулярная клеточная машина, осуществляющая процесс биосинтеза белка в клетке. Изучение структурно-функциональной топографии рибосом важно не только для понимания молекулярных механизмов биосинтеза белка, но и для разработки подходов к регуляции этого процесса. К настоящему времени пространственная структура рибосом прокариот детально изучена с помощью рентгеноструктурного анализа (см., например, (Brodersen et al., 2002; Selmer et al., 2006)), в то же время структура рибосом эукариот, особенно высших, остаётся намного менее исследованной. По-видимому, это связано с тем, что многие из методов, успешно применяемых для изучения бактериальных рибосом, пока что не могут быть использованы для исследования структуры рибосом эукариот. Это касается прежде всего метода рентгеноструктурного анализа (РСА), поскольку кристаллы эукариотических рибосом, пригодные для РСА, пока не получены, а также методов, основанных на реконструкции рибосомных субчастиц из белков и рРНК, так как до сих пор не найдено подходов к сборке функционально-активных субчастиц рибосом эукариот из рРНК и белков in vitro.
Один из наиболее доступных на сегодняшний день подходов к изучению РНК-белковых взаимодействий в рибосомных субчастицах эукариот основан на использовании рекомбинантных рибосомных белков и фрагментов РНК, отвечающих за эти взаимодействия. Такие фрагменты могут быть получены в системе транскрипции in vitro. Аналогичный подход был успешно использован ранее для изучения взаимодействия различных прокариотических рибосомных белков с РНК-транскриптами, соответствующими фрагментам 16S рРНК, содержащим участки связывания этих белков (см., например, (Dragon and Brakier-Gingras, 1993; Gregory et al., 1988; Рассохин и соавт., 2001)).
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение диссоциации 40 S субчастиц рибосом человека в градиенте концентрации моновалентных катионов для выявления так называемых сердцевинных рибосомных белков, которые наиболее прочно удерживаются на 18S рРНК, и исследование связывания некоторых из них, в частности белков S5 и S16, с 18S рРНК с помощью вышеуказанного подхода. Рибосомный белок (гр от англ. ribosomal protein) S5 - гомолог rpS7 прокариот, a rpS16 -гомолог rpS9 (Wool et al., 1996), участки связывания rpS7 и rpS9 на 16S рРНК известны. В качестве модельной РНК выбран фрагмент главного 3'-концевого домена 18S рРНК человека (нуклеотиды 1203-1236/1521-1698) (фрагмент 3Dm), гомологичный району 16S рРНК, содержащему участки связывания rpS7 и rpS9.
Основными задачами являлись:
— определение порядка диссоциации рибосомных белков из 40S субчастиц при
увеличении концентрации LiCl (0.3-1.5 М) в присутствии 4 мМ MgCb и 0.5 М КС1 и
идентификация белков, наиболее сильно удерживающихся на 18S рРНК;
— характеризация связывания rpS5 и rpS16 человека с фрагментом 3Dm и определение
нуклеотидных остатков этого фрагмента, изменяющих свою доступность зондам в
присутствии этих белков;
— определение взаимного влияния rpS16 и rpS5 на связывание каждого из них с
фрагментом 3Dm;
— сопоставление полученных результатов по связыванию rpS5 и rpS16 с фрагментом 3Dm с рентгеноструктурными данными о контактах rpS7 и rpS9 с 16S рРНК в 30S субчастице.
Научная новизна и практическая ценность. В настоящей работе впервые установлен порядок диссоциации белков из малой субчастицы рибосомы человека при возрастающей концентрации моновалентных катионов и изучено связывание двух сердцевинных рибосомных белков -S5hS16c фрагментом 18S рРНК, соответствующим району 16S рРНК, содержащему участки связывания гомологичных рибосомных белков бактерий - S7 и S9 соответственно. Выявлены отличия в порядке диссоциации рибосомных белков из 30S и 40S субчастиц под действием моновалентных катионов, и в характере связывания белков S5 и S16 и их прокариотических гомологов с соответствующей рРНК. С помощью футпринтинга впервые получено представление об участках связывания рибосомных белков S5 и S16 человека на 18S рРНК. Полученная в настоящей работе информация имеет важное значение для понимания молекулярных основ РНК-белковых взаимодействий в малых субчастицах рибосом млекопитающих, а накопление такого рода информации служит первым шагом в их реконструкции in vitro.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном рабочем совещании "Biosphere Origin and Evolution" (Новосибирск, 2005), международной конференции "Физико-химическая биология", посвященной 80-летию академика Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2006), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), III российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 2007) и II международном молодёжном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения-2007» (Санкт-Петербург, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.
Структура работы. Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста, состоит из введения, трёх глав, выводов, списка литературы и содержит 5 таблиц и 45 рисунков.
