Содержание к диссертации
Введение
I. Организация и функционирование убиквитин-протеасомной системы (УПС) 7
1.1. 26S протеасома 7
1.1.1. Иммунопротеасома 11
1.1.2. Разнообразие регуляторних комплексов протеасом 11
1.1.3. Внутриклеточная локализация протеасом 12
1.1.4. Сборка протеасом 13
1.2. Система убиквитинирования белков 14
1.2.1. Убиквитин и ферменты системы убиквитинирования 15
1.2.2. Деубиквитинирование 16
1.2.3. Механизмы распознавания белковых субстратов 17
1.2.3.1. N-концевой аминокислотный остаток: N-концевое правило деградации 17
1.2.3.2. Сигнальные последовательности 18
1.2.3.3. Роль фосфорилирования в узнавании белков системой убиквитинирования 19
1.2.3.4. Деградация белков с нарушенной третичной структурой 19
1.2.3.5. Маскирование сигналов протеолиза 20
1.2.3.6. Узнавание субстратов in trans 20
1.3. Протеолитические функции УПС 21
1.3.1. Полное расщепление белковых субстратов 21
1.3.1.1. Регуляция активности белков 21
1.3.1.2. Система деградации белков эндоплазматического ретикулума 22
1.3.1.3. Деградация новосинтезированных полипептидных цепей 23
1.3.1.4. Образование антигенных олигопептидов 23
1.3.2. Процессинг полипептидов путем ограниченного протеолиза 24
1.4. Не протеолитические функции компонентов убиквитин-протеасомной системы 25
1.4.1. Везикулярный транспорт 26
1.4.2. Гистоновый код 26
1.4.3. Репарация ДНК 28
1.4.4. Регуляция активности транскрипционных факторов путем моноубиквитинирования 29
1.4.5. Привлечение протеасомных субъединиц к активно транскрибируемым генам 31
II. Регуляция экспрессии протеасомных генов у эукариот 33
2.1. Система регуляции транскрипции протеасомных генов у Saccharomyces cerevisiae 33
2.1.1. РАСЕ 33
2.1.2 Выяснение роли Rpn4p и его характеристика 35
2.1.3. Механизмы деградации Rpn4p 37
2.1.4, Модель регуляции протеасомных генов по принципу отрицательной обратной связи 38
2.2. РАСЕ и гомологи Rpn4p у дрожжей подкласса Hemiascomyctes 39
2.3. Регуляция транскрипции протеасомных генов у высших эукариот 40
III. Структура эукариотических трансактиваторов 43
3.1. ДНК-связывающие домены 44
3.1.1. ДНК-связывающие домены, содержащие мотив «спираль-петля- спираль» 44
3.1.2. ДНК-связывающие домены, содержащие цинк («цинковые пальцы») 44
3.1.2.1. (Зра-цинковые пальцы (С2Н2) 44
3.1.2.2. Семейство рецепторов гормонов 45
3.1.2.3. ДНК-связывающие домены с мотивом «петля-слой- спираль» 45
3.1.2.4. Семейство Gal4 46
3.1.3. ДНК-связывающие домены факторов, содержащих «лейциновуюзастежку» 46
3.1.3.1. Семейство факторов с «лейциновой
застежкой» 46
3.1.3.2. Семейство факторов с мотивом «спираль-петля- спираль» 47
3.1.4. Белки с р-слойным ДНК-связывающим доменом 47
3.2. Трансактиваторные домены 47
3.2.1. Кислые трансактиваторные домены 49
3.2.2. Глутамин-богатые трансактиваторные домены 50
3.2.3. Пролин-богатые трансактиваторные домены 51
3.2.4. Серин/треониновые трансактиваторные домены 52
3.3. Сигналы ядерной локализации 53
Заключение 55
Материалы и методы 56
Материалы 56
Методы 61
1. Получение плазмидиых конструкций 61
2. ПЦР-мутагенез 64
3. Выделение Rpn4 из Е. coli 64
4. Трансформация нативных клеток S. cerevisiae плазмидной ДНК 65
5. Выделение геномной ДНК S. cerevisiae 66
6. Выделение суммарной РНК из дрожжей 66
7. Агарозно-формальдегидный электрофорез РНК 67
8. Синтез кДНК 67
9. Полуколичественная ПНР 69
10. ПЦР в реальном времени 71
11. Метод выращивания серии разведений дрожжевой культуры на чашках Петри 72
12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии SDS 72
13. Вестерн-блоттинг 72
14. Метод формальдегидной фиксации и иммунопреципитации хроматина...73
Результаты 75
1. Rpn4p - позитивный и негативный транскрипционный регулятор убиквитин-протеасомной системы 75
2. Анализ С-концевой области Rpn4p 78
3. Анализ центральной части Rpn4p 81
4. Анализ, N-концевой области Rpn4p 84
5. Мутационный анализ N-концевого трансактиваторного домена 88
Обсуждение результатов 90
Выводы 95
Список литературы
- Внутриклеточная локализация протеасом
- Выяснение роли Rpn4p и его характеристика
- ДНК-связывающие домены, содержащие цинк («цинковые пальцы»)
- Белки с р-слойным ДНК-связывающим доменом
Введение к работе
Содержание белков в клетке обусловлено динамическим равновесием между процессами их синтеза и деградации. У эукариот за деградацию основной массы белков отвечает высокоселективная убиквитин-протеасомная система. Эта система состоит, во-первых, из комплекса ферментов, осуществляющих узнавание белковых субстратов и ковалентное присоединение к ним полиубиквитипа, и, во-вторых, крупного многосубъединичного протеазного комплекса - протеасомы, который узнает полиубиквитинированныс белки и расщепляет их до олигопептидов. В протеасоме происходит деградация регуляторных белков, контролирующих все основные клеточные процессы, а также белков с нарушенной структурой. Убиквитин-протеасомная система необходима для нормального функционирования клетки и ее выживания при стрессовых воздействиях. У человека нарушения в работе этой протеолитической системы связаны с возникновением различных онкогенных и нейродегенеративных болезней, а также с нарушением работы иммунной системы.
В настоящее время структура и функционирование протеасомы изучены довольно подробно, однако исследование регуляции экспрессии протеасомных генов остается очень актуальной проблемой. Система координированной регуляции протеасомных генов экспериментально описана пока только у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Эта система состоит из регуляторного элемента, называемого РАСЕ (Proteasome Associated Control Element) и транскрипционного фактора, Rpn4p, связывающегося с этой последовательностью. В то же время сам Rpn4p является субстратом протеасомы, поэтому содержание протеасом в клетке, по-видимому, регулируется по принципу отрицательной обратной связи. К настоящему времени подробно изучены механизмы деградации Rpn4p в протеасоме, но очень немного известно о механизме действия Rpn4p как транскрипционного фактора.
Внутриклеточная локализация протеасом
На ранних этапах изучения убиквитин-протеасомной системы, считалось, что ее субстратами являются только цитозольные белки. Сейчас показано, что в протеасоме разрушаются также белки, находящиеся в ядре, клеточной мембране и эндоплазматическом ретикулуме (Bonifacino and Weissman, 1998; Brodsky and McCracken 1999; Hicke, 1999; Lord et al., 2000). В клетках млекопитающих протеолитические комплексы распределены равномерно между этими компартментами (Brooks et al, 2000), тогда как у S. cerevisiae до 80% частиц сосредоточено в ядре и перинуклеарном пространстве (Russell et al., 1999). Большая часть иммунопротеасом обнаруживается вблизи мембраны ЭПР, где также локализуются молекулы МНС I класса (Rivett et al., 2001). Регуляторные комплексы протеасомы таюке проявляют неравномерное субклеточное распределение. У клеток млекопитающих REGy и РА200 обнаруживаются преимущественно в ядре, REGa/p в цитоплазме, а 19S активатор распределен между обоими компартментами более или менее равномерно. Распределение протеасомных комплексов внутри ядра таюке неравномерное: 19S и 20S комплексы образуют скопления в тельцах, называемых кластосомами (от греч. klastos - «разрушенный» и soma - «тело») (Lafarga et al., 2002). В кластосомах также скапливаются полиубиквитинированные субстраты протеасом. Было показано, что тельца исчезают при обработке клеток ингибиторами протеасомы и вновь возникают после их отмывки (Lafarga et al., 2002).
Образование протеасомных комплексов - многоступенчатый процесс, который начинается в цитоплазме и заканчивается в ядре. Считается, что зрелые протеасомы образуются только в ядре, и пока не ясно, каким образом происходит транспорт протеасом из ядра в цитоплазму.
Первая стадия сборки 20S протеасомы проходит в цитоплазме и заключается в формировании кольца из а-субъединиц. Процесс происходит самопроизвольно и независимо от других субъединиц. Для олигомеризации а-субъединиц необходимо наличие N-концевого консервативного участка (Zwickl et al, 1994). Далее на а-кольце собирается кольцо из р-субъединиц. р-субъединицы на N-конце содержат лидерный пептид, который необходим для их правильного сворачивания и предотвращения преждевременной активации (Baker and Agard, 1994). В результате образуется 13S комплекс (300 кДа), состоящий из одного а- и одного (3-кольца. 13S предшественники далее транспортируются в ядро при участии кариоферина а/р (Reits et al, 1997; Lehmann et al., 2002). Сигналы ядерной локализации обнаружены у некоторых а-субъединиц. Внутри ядра 13S комплекс димеризуется в 16S комплекс, и при этом происходит автокаталитическое отщепление лидерного пептида с высвобождением треонина, который затем войдет в состав активного центра. На заключительном этапе субъединицы 20S протеасомы подвергаются химическим модификациям (Schmidtke et al, 1997). 26S протеасома образуется в АТФ-зависимом процессе объединения 20S комплекса с комплексом РА700. Во время сборки 26S протеасомы происходит фосфорилирование обоих комплексов. В РА700 фосфорилируются, по крайней мере, четыре субъединицы, одна из них Rpt6, непосредственно контактирующая с СЗ субъединицей а-кольца. В 20S протеасоме происходит фосфорилирование двух а-субъединиц - С8 и С9 (Mason et al., 1996; Mason et al., 1998; Satoh et al., 2001). Показано также, что под действием у-интерферона уменьшается количество 26S протеасом и это коррелирует со снижением степени фосфорилирования указанных субъединиц (Bose et al., 2001). Эти данные указывают на то, что сборка протеасом -регулируемый процесс и одним из факторов регуляции может быть фосфорилирование протеасомных субъединиц. Система убиквитинирования белков
Как было упомянуто ранее, субстратами протеасомы являются полиубиквитинированные белки. В клетках эукариот существует иерархическая система ферментов, которая способна распознавать белки, имеющие сигналы деградации, и модифицировать их полиубиквитином (рис.3.). В чем физиологический смысл полиубиквитинирования? По всей видимости, эта модификация необходима для повышения сродства субстрата к ферменту. Экспериментально было показано, что искусственное привлечение белков к протеасоме достаточно для того, чтобы они были в ней разрушены (Janse et al., 2004). Наибольшим сродством к протеасоме обладает полиубиквитиновая цепь с длиной не менее 4 мономеров, именно такой длины цепь служит сигналом для деградации (Thrower et al., 2000). 0 AMPtPPi
Убиквитин - это небольшой высококонсервативный глобулярный белок, состоящий из 76 а.к. Убиквитин никогда не образуется в клетке в мономерной форме: он либо синтезируется в виде предшественника Ubi4, состоящего из 5 мономеров, соединенных друг с другом голова к хвосту, либо является N-концевым доменом рибосомных белков Rpl40A, Rpl40B и Rps31. Высвобождение молекул убиквитина происходит в результате расщепления предшественника или отщепления N-концевых убиквитиновых доменов рибосомных белков (Ozkaynak et al, 1987).
В состав системы убиквитинирования у S. cerevisiae входит один фермент Е1 (Uba, Ubiquitin-Activating Enzyme), который активирует молекулу убиквитина через образование тиоэфирной связи с карбоксилом Gly-76 убиквитина; порядка десяти ферментов Е2 (Ubc, Ubiquitin-Conjugating Enzyme), которые посредством реакции трансацетилирования принимают активированную молекулу убиквитина от фермента Е1; и нескольких десятков ферментов ЕЗ (Ubr, Ubiquitin-Recognition Factor или Ubiquitin-Protein Ligase), катализирующих образование изопептидной связи между остатком лизина субстрата (или убиквитина Lys-48) и Gly-76 убиквитина и, таким образом, осуществляющих присоединение убиквитина к белку и наращивание цепи полиубиквитина (Ciechanover, 1998).
Выяснение роли Rpn4p и его характеристика
Ген RPN4 впервые обнаружили в 1993 г. в клетках дрожжей по способности супрессировать мутацию sec 63-101 (Nelson et al, 1993). Это точечная мутация в цитоплазматическом домене интегрального белка ядерной мембраны и эндоплазматического ретикулума (ЭПР) Sec63p, который участвует в транслокации белков внутрь этих клеточных компартментов (Nelson et al, 1993). Было показано, что в штаммах с делецией гена RPN4 нарушена морфология ядра и ядерная локализация белков, но при этом белки нормально транспортируются в ЭПР (Nelson et al, 1993). Оказалось, что белок Rpn4p содержит два обогащенных остатками кислых аминокислот участка, подобных "кислому" участку в цитоплазматическом домене Sec63p, рядом с которым локализована мутация sec 63-101. Предположено, что Rpn4p может взаимодействовать с гипотетическим белком-посредником, который, в свою очередь, связывается с кислым доменом Sec63p (Nelson et al, 1993). Взаимодействуя с Sec63p, Rpn4p может участвовать в поддержании структуры ядра и регулировать ядерный транспорт белков. Показано также, что Rpn4p находится преимущественно в ядре.
Позднее, в 1995 г. установили, что RPN4 входит в число генов, мутации в которых вызывают нарушение деградации субстратов убиквитин-протеасомного пути (Johnson et al, 1995). При этом в штамме с мутацией в гене RPN4 накапливались полиубиквитинированные белки. Все это позволило сделать вывод о том, что Rpn4p является компонентом пути убиквитин-зависимого протеолиза и действует на стадиях, следующих за полиубиквитинированием.
Дальнейшие предположения о функциях Rpn4p появились при изучении свойств штамма дрожжей с мутациями в гене RPN2, кодирующем субъединицу регуляторного комплекса 26S протеасомы (Yokota et al, 1996). В этом мутантном штамме наблюдалась стабилизация субстратов UPS и нарушение транспорта белков в ядро. Кроме этого обнаружили генетические взаимодействия между генами RPN4, RPN2 и геном другой субъединицы протеасомы - RPN12 (Yokota et al, 1996). На основе полученных результатов было предположено, что Rpn4p может быть субъединицей протеасомы
В дальнейшем это предположение нашло экспериментальное подтверждение. В 1998 г. Было показано, что Rpn4p содержится в препаратах частично очищенных протеасом, и 26S протеасома соосаждается с антителами против Rpn4p (Fujimuro et al, 1998). Если рассматривать Rpn4p как субъединицу протсасомы, то можно понять причины стабилизации субстратов UPS в штамме с мутациями в гене RPN4. Однако впоследствии Rpn4p не удалось обнаружить в препаратах очищенных протеасом (Glickman et al, 1998; Verma etal, 2000).
В 1999 г. совершенно неожиданно Rpn4p охарактеризовали как активатор транскрипции протеасомных генов (Mannhaupt et al, 1999; Капранов и др., 2001). В одногибридной системе (Mannhaupt et al, 1999) и методом аффинной хроматографии с использованием РАСЕ-сефарозы (Капранов и др., 2001) Rpn4p идентифицировали как РАСЕ-связывающий белок. Специфичность его связывания с РАСЕ показана методом задержки в геле, а способность активировать транскрипцию установлена в модельной системе с промоторами протеасомных генов, сшитых с репортерным геном хлорамфениколацетилтраисферазы (Mannhaupt et al, 1999; Капранов и др., 2001). На функцию Rpn4p как фактора транскрипции указывает его преимущественно ядерная локализация, а также два участка, обогащенных остатками кислых аминокислот, которые могут служить кислыми трансактиваторпыми доменами, и два мотива цинковых пальцев, способных образовывать ДНК-связывающий домен.
Rpn4p участвует и в поддержании нормального и индуцируемого стрессом уровней экспрессии протеасомных генов (Xie and Varshavsky, 2001; Ju et al, 2004; London et al, 2004). Поскольку протеасома - это необходимый участник клеточного ответа на стресс, то не удивительно, что мутации в гене RPN4 повышают чувствительность клеток дрожжей к различным стрессовым агентам (Johnson et al., 1995; Ju et al, 2004; London et al, 2004; Owsianik et al, 2002; Halm et al, 2006). Кроме того, экспрессия самого RPN4 контролируется несколькими стресс-факторами, такими как HSF, Yaplp, Pdrlp и Pdr3p (Owsianik et al, 2002; Hahn et al, 2006).
Стало ясно, что Rpn4p это не субъединица протеасомы, а ассоциированный с протеасомой фактор транскрипции. Теперь, возвращаясь назад, можно сказать, что нарушение деградации белков, наблюдаемое в клетках дрожжей с делецией гена RPN4, обусловлено снижением количества протеасом. Однако открытым остается вопрос о том, какова роль Rpn4p в транспорте белков в ядро: регулирует он содержание протеасом, субстратами которых могут служить транспортные белки, или экспрессию генов транспортных белков?
Показано, что Rpn4p — крайне нестабильный in vivo белок, разрушающийся в протеасоме. Период полураспада Rpn4p равен примерно 2 мин (Xie and Varshavsky, 2001). В большинстве случаев субстраты протеасомы перед деградацией предварительно полиубиквитинируются. Однако нарушение убиквитинирования не стабилизирует Rpn4p. Оказалось, что этот белок деградирует по двум независимым путям - убиквитин-зависимому и -независимому (Ju et al, 2004).
Об убиквитин-независимом механизме деградации Rpn4p известно немного. Установлено лишь, что сигналом к этому пути служат первые 10 аминокислотных остатков, так называемый N-концевой сигнал деградации (N-degron) (Ju et al, 2004). Какие компоненты УПС узнают этот сигнал до сих пор не известно.
Более подробно изучен путь убиквитин-зависимой деградации Rpn4p. Оказалось, что сигналом убиквитинирования служит так называемый N-концевой кислый домен (Nerminal acid domain, NAD) (Ju et al, 2006), он же предполагаемый трансактиваторный домен. Этот участок - один сайтов связывания убиквитин-лигазы Ubr2p, принадлежащей к классу RING-лигаз (Wang et al, 2004). Rpn4p пока единственный охарактеризованный субстрат Ubr2p лигазы (Wang et al, 2004). Эта лигаза убиквитинирует Rpn4p по нескольким остаткам лизина, находящимся в N-концевой области, преимущественный среди которых Lysl87 (Ju et al, 2006). Следует отметить, что химерный белок, состоящий из фрагмента Rpn4p, включающего NAD и Lysl87, и стабильного белка р-галактозидазы, деградирует так же быстро, как и нативный Rnp4p (Ju et al, 2006). Взаимодействие Ubr2p с Rpn4p регулируется фосфорилированием двух остатков Ser, входящих в состав NAD. In vitro показано, что эти остатки фосфорилирует казеинкиназа II (Ju et al, 2007). Кроме иЬг2р-лигазы в убиквитинировании Rpn4p участвует Е2-фермент Rad6p (Wang et al, 2004) и вспомогательный белок Mublp (Ju et al, 2008), которые образуют комплекс с убиквитин-лигазой.
ДНК-связывающие домены, содержащие цинк («цинковые пальцы»)
Система регуляции протеасомных генов у S. cerevisiae устроена достаточно просто, тогда как у высших эукариот подобная система имеет, по-видимому, более сложную структуру.
Протеасомные гены у высших эукариот так же, как и у дрожжей регулируются координировано. Это следует из данных о том, что подавление синтеза отдельных субъединиц протеасом при помощи РНК-интерференции (Lundgren et al, 2003), использование ингибиторов протеасомы (Meiners et al, 2003) или сверхэкспрессия какой-либо из субъединиц 20S комплекса (Chondrogianni et al, 2005) вызывают одновременную активацию транскрипции всех протеасомных генов.
Наряду с координированной регуляцией существует дифференцированная регуляция протеасомных генов. Наиболее ярким примером является экспрессия трех каталитических субъединиц иммунопротеасомы: LMP2, LMP7 и MECL. Синтез этих субъединиц активируется у-интерфероном (Schroder et al, 2004). Детально описан сигнальный путь от рецептора у-интерферона до транскрипционных факторов STAT1 и IRF1, которые, в конечном итоге, и осуществляют регуляцию у-интерферон-зависимых генов (Schroder et al, 2004). Из генов вышеперечисленных субъединиц, пока только для гена LMP2 показана активация транскрипции при участии комплекса STAT MRF1, который непосредственно связывается с его промоторной областью in vivo (Chatterjee-Kishore et al, 2000). Участвует ли этот комплекс в регуляции генов других субъединиц иммунопротеасомы в настоящее время не ясно. Другим примером дифференцированной регуляции экспрессии протеасомных генов является падение содержания каталитических Р-субъединиц в процессе старения клеточной культуры, тогда как уровень содержания структурных Р-субъединиц при этом не меняется (Chondrogianni et al, 2003; Place et al, 2005). Содержание каталитических субъединиц снижается также в фибробластах при их обработке ингибиторами гистондеацетилаз (Place, 2005). Авторы предполагают, что у высших эукариот существует регулятор экспрессии протеасом, активность которого ингибируется ацетилированием (Place et al, 2005). Однако эти результаты не противоречат другому предположению о том, что ингибироваиие гистондеацетилаз изменяет структуру хроматина в области протеасомных генов, что негативно влияет на активность генов.
Были предприняты попытки при помощи биоинформатического анализа выявить регуляторные элементы в промоторных областях протеасомных генов Drosophila melanogastev. В результате какие-либо копсенсусные последовательности не обнаружены. В подтверждение этим данным, в промоторах генов субъединиц S2/Rpnl и р2, были картированы два разных элемента. Причем эти элементы соответствуют 5 -нетранслируемой области мРНК (Lundgren et al, 2005). Авторы работы предполагают, что протеасомные гены могут регулироваться или на уровне транскрипции с участием нескольких транскрипционных факторов, или на уровне трансляции при участии факторов, взаимодействующих с 5 -нетранслируемой областью мРНК.
Ведутся поиски транскрипционных факторов, которые могут участвовать в регуляции экспрессии протеасомных генов в условиях стресса. Подобный регулятор выявлен у мышей, это Nrf2, фактор окислительного стресса. Nrf2 непосредственно взаимодействует с промоторпыми областями некоторых протеасомных генов через последовательность ARE (Antioxidant Response Element) и активирует их транскрипцию в условиях окислительного стресса (Kwak et al, 2003). Интересно отметить, что сам фактор является субстратом протеасомы (Nguyen et al, 2003). Другим фактором, активирующим протеасомные гены у мышей при окислительном стрессе независимо от Nrf2, является PPARa (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) (Anderson et al, 2004). Однако данные о непосредственном связывании PPARa с протеасомными генами отсутствуют. Поскольку фактор теплового шока Hsflp опосредованно через Rpn4p участвует в активации протеасомных генов у дрожжей (Hahn et ah, 2006), было предположено, что и в клетках млекопитающих фактор теплового шока регулирует протеасомные гены. Однако это предположение экспериментально не подтвердилось (Taylor et al., 2005).
Таким образом, исходя из данных, имеющихся на сегодняшний день, система координированной регуляции экспрессии протеасомных генов у высших эукариот устроена сложнее, чем у дрожжей и, по-видимому, включает в себя несколько транскрипционных факторов, взаимодействующих с разными регуляторными элементами.
Белки с р-слойным ДНК-связывающим доменом
Помимо ДНК-связывающих и трансактиваторных доменов, эукариотические транскрипционные факторы должны обладать сигналами транспорта в ядро. В середине 1980-х было обнаружено, что для транспорта белков в ядре необходимо и достаточно наличие специальных последовательностей, называемых сигналами ядерной локализации (NLS, nuclear localization signal) (Kalderon et al., 1984; Lanford and Butel, 1984). Классические NLS можно разделить на два типа. Примером первого типа является NLS большого Т антигена вируса SV40 PKKKRKV132 -последовательность из 3-5 основных основных остатков, иногда включающих пролин или глицин.
К другому типу относятся сигналы, состоящие из двух кластеров основных остатков, соединенных между собой спенсером из любых 10 аминокислот. Впервые такой сигнал был описан у нуклеоплазмина KR-10aa-KKKL171 (Dingwall and Laskey, 1991). Были описаны случаи транскрипционных факторов, содержащих более одного функционального NLS. Так, например, BRCA1 содержит два сигнала первого типа с последовательностями KRKRRP508 и PKKNNRLRRK615 (Jans et al., 2000), в то время как b-Myb - сигналы двух разных типов (Takemoto et al., 1994). Классические сигналы ядерной локализации распознаются эволюциошю консервативными транспортными белками, называемыми импортинами а (кариоферинами а). Эти факторы функционируют как адапторные белки: они связывают транспортируемый белок и в то же время образуют комплекс с кариоферинами [3 (Pemberton and Paschal, 2005).
Кариоферины-а могут узнавать и неклассические NLS: например, NLS белка Mata2 состоит из чередующихся полярных и неполярных остатков (VRILESWFAKNIENPYLDT159) (Hall et al, 1990), а в NLS с-Мус важны остатки пролина и аспартата на границе кластера из положительно заряженных остатков (PAAKRVKLD328) (Makkerh et al, 1996).
Последовательности с активностью NLS были обнаружены также в ДНК-связывающих доменах у целой группы транскрипционных факторов грибов, чьи ДНК-связывающие домены относятся к семейству Gal4. Хорошо изученным представителем этой группы является дрожжевой трансактиватор Gal4p. Было установлено, что в N-концевой области фактора (1-147 а.о.) находится ДНК связывающий домен (Keegan et al., 1986). В этой же области находится участок с активностью NLS (1-74 а.о.), который достаточен для транспорта р-галактозидазы в ядро (Silver et al., 1984). NLS Gal4p обогащен положительно заряженными остатками (RKLKLKCSKEKPRCAKCLKNNWECRYSPKTKR16) и мог бы узнаваться кариоферинами а, однако в экспериментах in vitro было установлено, что с этой последовательностью взаимодействуют преимущественно кариоферины р (Chan et al., 1998). Авторы этой работы отметили, что последовательность NLS очень похожа на участок одного из кариоферинов а, который опосредует связывание с кариоферином р. В этой же работе было показано, что взаимодействие транспортных белков с NLS и связывание со специфической для фактора последовательностью ДНК являются двумя конкурирующими процессами in vitro: в избытке кариоферина р ослабляется связывание ДНК, и наоборот избыток ДНК блокирует образование комплекса Gal4p с кариоферином. Исследования in vivo механизмов ядерного транспорта транскрипционного фактора AlcR, участвующего в метаболизме этанола у Aspergillus nidulans, подведили наличие конкуренции между процессами взаимодействия с ДНК и транслокации в ядро (Nicolaev et al., 2003). Было показано, что нарушение структуры ДНК-связывающего домена AlcR путем введения точечных мутаций цистеинов приводит к повышению эффективности транспорта фактора в ядро. Заключение
Организация и функционирование убиквитин-протеасомной системы изучены довольно подробно. Вместе с этим данных, касающихся регуляции экспрессии протеасомных генов, накоплено немного. На сегодняшний день только у S. cerevisiae экспериментально охарактеризована регуляция транскрипции протеасомных генов по принципу отрицательной обратной связи. В этой регуляции участвует транскрипционный фактор Rpn4p, связывающийся с последовательностью РАСЕ. Гомологи Rpn4p и РАСЕ обнаружены также и у других дрожжей подкласса Hemiascomycetes, что указывает на распространенность регуляторной системы Rpn4-PACE у этой группы организмов. Что же касается грибов других классов и высших эукариот, то у них протеасомные гены, по-видимому, также регулируются координировано, однако фактор, отвечающий за эту регуляцию, до сих пор не обнаружен. Интересно отметить, что у высших эукариот охарактеризованы транскрипционные факторы, регулирующие отдельные группы протеасомных генов.
Таким образом, дрожжевой белок Rpn4 остается пока единственным известным фактором, осуществляющим координированную регуляцию протеасомных генов. Известны механизмы деградации Rpn4p в протеасоме, но очень мало данных о механизмах его функционирования. Раскрытие механизмов действия этого фактора может пролить свет на регуляцию экспрессии протеасомных генов у других организмов. Прежде всего, необходимо выявить его функцонально важные области. Согласно данным биоинформатического анализа большая часть Rpn4p не обнаруживает значимой гомологии с участками известных транскрипционных факторов, поэтому возникает необходимость провести картирование функционально значимых областей белка.
