Содержание к диссертации
Введение
I. МЕТОДЫ КЛОНИРОВАНИЯ ГЕНОВ
1. Плазмидные векторы для клонирования генов . . . . 4
2. Методы введения чужеродных фрагментов ДНК 10
в плазмидные векторы
3. Получение специфических молекул ДНК для
клонирования 14
4. Трансформация Е.СОІІ и отбор гибридных клонов .... 18
II. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ЭУКАРИОТ В КЛЕТКАХ
1. Возможность функционирования генов эукариот в прокариотической системе 24
2. Принципы подхода к получению направленной экспрессии генов эукариот в клетках Е.СОІІ 29
3. Методы изучения экспрессии генов эукариот в бактериальной клетке 37
III. ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БРАДИКИНИНА И КИНИН-КАЛЖКРЕИНОВОЙ СИСТЕМЫ 40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы и методы 46
2. Результаты
I/ Конструирование и характеристика векторной плазмиды для экспрессии гена брадикинина 63
2/ Конструирование и характеристика рекомбинантных плазмид, содержащих ген брадикинина 66
3/ Экспрессия.гибридного брадикинин-в-галактозидазного гена в клетках Е.СОІІ _ . 75
3. ОБСУЖДЕНИЕ 95
4. ВЫВОДЫ , ... 107
ЛИТЕРАТУРА . V 108
- Плазмидные векторы для клонирования генов
- Возможность функционирования генов эукариот в прокариотической системе
- ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БРАДИКИНИНА И КИНИН-КАЛЖКРЕИНОВОЙ СИСТЕМЫ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Бурное развитие методов генной инженерии, позволяющих выделять индивидуальные гены высших организмов, и переносить их в другой организм, открыло, с одной стороны, перспективы создания новой отрасли промышленности - биотехнологии, а с другой стороны, значительно расшибло возможности изучения структуры и функции генома эукариот. Получение бактерий - производителей белков растительного и животного происхождения связано с проблемой экспрессии генов в гетерологичном окружении. Трудности достижения успешной экспрессии генов высших организмов в бактериях заключаются в отличии их структуры от структуры генов прокариот. Одним из возможных путей решения этой проблемы является химический синтез эукариотического гена по известной аминокислотной последовательности с последующим клонированием его в подходящем векторе, обеспечивающем его экспрессию в бактериальных клетках. Этот путь оказался вполне реальным для генов, кодирующих олиго- и полипептиды, например для генов таких важных гормонов как инсулин, соматостатин и некоторых других.
Важно также, что клонирование химически синтезированных генов позволяет легко выделять их в требуемых количествах и использовать в качестве молекулярного зонда при поиске и дальнейшем изучении соответствующих природных генов.
Одной из важных и хорошо изученных биологических систем является кинин-калликреиновая система плазмы крови млекопитающих.В ее состав входит вазоактивный олигопептид брадикинин, обладающий гипотензивным действием на сердечно-сосудистую систему и стимулирующий гладкую мускулатуру. В организме брадикинин образуется в результате специфического протеолитического расщепления его высокомолекулярного предшественника - кининогена. Аминокислотная по- следовательность брадикинина известна, поэтому химический синтез этого гена с последующим клонированием его в бактериях позволили бы показать возможность создания штамма Е. сои - производителя олигопетида чужеродного происхождения, а также перейти к изучению кинин-калликреиновой системы на генетическом уровне.
Химический синтез гена брадикинина был осуществлен М.Н. Колосовым и его сотрудниками в Институте биоорганической химии АН СССР. /Коробко и др., 1979/.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было получение штамма е.соіі - продуцента пептидного гормона человека - брадикинина. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи: конструирование вектора для экспресии химически синтезированного гена брадикинина, объединение кодирующих последовательностей гена брадикинина с контрольными элементами іас-оперона е.соіі,входящими в состав вектора, выбор штаммов для фе-нотипического тестирования брадикинина в бактериальных экстрактах, а также конструирование плазьшды, содержащей димер гена брадикинина, для выделения из нее ДНК, соответствующей гену брадикинина.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенной работы впервые был клонирован химически синтезированный ген брадикинина и получена его экспрессия в бактериальной клетке. В полученном штамме HBI0I/ рьв-55 происходит направленная экспрессия гена гормона брадикинина в виде химерного белка, объединенного с В-галактозидазой. Для обнаружения продукции брадикинина бактериальными клетками разработаны методы радиоиммунологического анализа, применение которых позволило определить, что бради-кинин в бактериях синтезируется в количестве 40000 молекул на клетку. Разработан метод частичной очистки брадикинина из пептидных гидролизатов клеток, включающий хромотографию на колонке Bio-Rex70 , который позволяет получить 1,5 мг брадикинина из 25 г клеток.
В целом наши эксперименты продемонстрировали возможность конструирования штамма микроорганизма, способного синтезировать полипептид чужеродного происхождения.
Штаммы E.coii, содержащие рекомбинантные плазмиды, могут быть использованы как для препаративного выделения гена брадикинина, так и для выделения продукта его функционирования - гормона брадикинина.
Плазмидные векторы для клонирования генов
Развитие методов введения чужеродных молекул ДНК в небольшие внехромосомные генетические элементы бактериальной клетки путем рекомбинации in vitro открыло широкие возможности изучения структуры и функционирования генов эукариот.
Клонирование генов представляет собой совокупность методов интеграции индивидуального фрагмента ДНК в плазмидный или фаговый вектор, что обеспечивает репликацию этого фрагмента в бактериальной клетке и, следовательно, стабильное существование в поколениях,
В данном обзоре будут рассмотрены только плазмидные векторы для клонирования генов.
Плазмида является автономной кольцевой внехромосомной молекулой ДНК, которая кодирует множество функций, не являющихся необходимыми для жизнедеятельности хозяйской клетки. Термин "плазмида" впервые был предложен Ледербергом для описания генетических элементов, участвующих ВО ВНехрОМОСОМНОЙ НаСЛедСТВеННОСТИ /Lederberg,
1952/. Впоследствии, при изучении физической природы этих элементов, было показано, что молекулы ДНК, имеющие специфическую плаву, чую плотность в градиенте хлористого цезия, могут переноситься из клетки в клетку в процессе конъюгации, придавая клеткам-хозяевам НОВЫе Генетические СВОЙСТВа / Wohlheiter et al,1964; De Witt, Helinski, 1965/.
Структура молекул плазмидных ДНК была определена путем центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии бромистого этидия /Radioff et ai, 1967/. Было показано, что плазмиды, представляет собой ковалентно замкнутое кольцо, находящееся В СуПерекрученном СОСТОЯНИИ / Clewell, Helinski, 1970; вхаіг et ai, 1972/. На этом физическом свойстве плазмид основывается большинство методов очистси молекул плазмидных ДНК ИЗ КЛеТОЧНЫХ ЛИЗатОВ /Clowes,1972, Helinski and Clewell, 1971/.
Автономность существования плазмид и многие свойства, кодируемые плазмидами, привлекли огромное внимание исследователей в последни 10 лет. К ним легко применимы различные генетические и биохимические методы, поэтому плазмиды широко используются при решении проблем молекулярной биологии и генетики. Плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, используются при клонировании генов как векторы для репликации и отбора чужеродной генетической информации в бактериальных клетках.
Требования, предъявляемые к вектору
Векторы, подходящие для клонирования фрагментов чужеродной ДНК должны отвечать следующим требованиям: а/иметь малый размер; б/иметь, по крайней мере, два маркерных гена /ген устойчивости к антибиотику или ген, придающий ауксотрофность бактерии-хозяину/; в/амплифицирующийся репликон; г/Содержать один участок узнавания для нескольких рестриктаз, которые не должны расщеплять молекулу векторной ДНК в участке начала репликации. Результатом встраивания фрагмента ДНК по участкам узнавания этих рестриктаз должна быть инактивация одного из маркерных генов; д/известная последовательность нуклеотидов; е/свойства, обеспечивающие биологическую безопасность: уменьшение трансмиссибельности в присутствии конъю-гативных плазмид, температуро-чувствительная репликация при температуре тела человека /sutciiffe , 1978/.
Возможность функционирования генов эукариот в прокариотической системе
Универсальность генетического кода предполагает, что один и тот же ген должен кодировать один и тот же специфический полипептид независимо от того, в каком хозяине будет проходить транскрипция и трансляция этого гена.
Однако накопленные за последние годы сведения о структуре и функциях генов про- и эукариот, указывают на наличие существенных различий в механизмах реализации генетической информации у этих организмов.
Основные механизмы экспрессии генов прокариот, включающие регуляцию транскрипции и трансляции, к настоящему времени изучены на молекулярном уровне. Было показано, что транскрипция регулируется степенью эффективности, с которой РНК-полимераза может узнавать и взаимодействовать со специфическими сигнальными последовательностями ДНК-промоторами и терминаторами - и что от специфичности этих участков зависит уровень инициации и терминации транскрипции РНК / Rozenberg,Cour, 1979/. При изучении СТЭрТО вых участков мРНК многих прокариот была обнаружена гомология с Соответствующими участками ДНК / Pribnow , 1975, Schaller et al, 1975/. Была определена последовательность нуклеотидов, расположенных на расстоянии 10 пар оснований от стартовых сигналов мРНК - 5» - ТАТААТГ - 3» в этих участках гомологии. Второй участок гомологии, названный "участок узнавания", был обнаружен для некоторых промоторов на расстоянии 35 пар оснований от начала синтеза мРНК. РНК-полимераза прокариот специфически связывается и взаимодействует с этими участками, что было установлено в экспериментах по химической модификации и дезоксирибонуклеазной де 25. Градации ПрОМОТОрНЫХ последовательностей / Rosenberg & Court , 1979/.
Далее было показано, что информация одного оперона бактериальной клетки транскрибируется в одну олигоцистронную мРНК, которая транслируется в соответствующие белки. Таким образом, у прокариот транслируется полная информация оперона.
В отличие от клеток прокариот молекулярные механизмы, лежащие в основе регуляции экспрессии генов эукариот в основном не изучены, т.к. к ним неприменимы методы классической генетики. Впервые предложение о том, что механизмы экспрессии генов высших организмов могут отличаться от таковых в организмах прокариот, было высказано более 10 лет назад при изучении РНК-полимераз в клетках эукариот. Было установлено, что клетки как высших, так и низших эукариот содержат три различных класса РНК-полимераз.
Физиологическая роль брадикинина и кинин-калжкреиновой системы
Кинины принадлежат к большому классу малых пептидов, которые обнаружены в плазме крови и некоторых тканях млекопитающих. К ним относятся такие пептидные гормоны как вазопрессин, оксито-цин, ангиотензин, вещество Р, брадикинин, каллидин и некоторые другие. Они содержат в своем составе от 9 до 24 аминокислот и действуют с высокой избирательностью на различные ткани организма.
Кинины обладают следующими свойствами:
1. Оказывают гипотензивное действие, расширяя мелкие кровеносные сосуды.
2. Повышают тонус гладкой мускулатуры.
3. Повышают проницаемость стенок капилляров.
4. Вызывают миграцию лейкоцитов.
5. Взаимодействуют с рецепторами боли.
Физиологическая роль кининов заключается в регуляции процессов микроциркуляции и транскапиллярного обмена. В связи с этим кинины играют особенно важную роль в секретирующих органах слюнных и потовых железах, поджелудочной железе, желудке и кишечнике /Rocha е Silva, 1949/.
Активация кининовой системы происходит при действии на организм различных повреждающих факторов, нарушающих целостность клеток и приводящих к активации систему свертывания крови и фиб-ринолиза. К этим факторам относятся травмы, токсины, облучение, накопление продуктов обмена, аллергические механизмы повреждения тканей, а также различные заболевания сердечно-сосудистой системы. /Eisen, 1980/.
Брадикинин является самым коротким активным кинином, который содержит 9 аминокислот: арг-про-про-гли-фен-сер-про-фен-арг. Как гипотензивный фактор брадикинин был впервые обнаружен в 1949 году / Rocha є siiva, 1949/. Слово "брадикинин" образовано от двух латинских терминов - "брадис" - медленный, "кинин" - вещество, оказывающее воздействие. В большинстве случаев действие брадикинина и аналогичных кининов на тонус мускулатуры наступает после определенного периода времени - латентного периода, в противоположность быстро действующим биологически активным пептидам - гистамину и серотонину. Механизм, действия брадикинина на тонус гладкой мускулатуры остается не выясненным до настоящего времени.
Возможно, он оказывает влияние на гладкую мускулатуру сосудов не прямо, а через рецепторы, расположенные на эндотелиальных клетках, выстилающих сосуды / Ryan et al, 1979, Chang & Altura,I98I/.
В плазме млекопитающих брадикинин существует в форме неак тивного предшественника, называемого кининогеном. Активный пептид образуется после протеолиза кининогена специфическими ферментами - калликреинами плазмы или тканей. К настоящему времени охарактеризованы кининогены быка и человека /уапо et ai, 1967,
Nagasawa & Nakayasu, 1979, Kerbirion et al , 1980/. В ПЛаЗМЄ крови быка содержится, по крайней мере, два предшественника бра-дикинина - высокомолекулярный кининоген /ВМВК/ и низкомолекулярный /НМВК/. Все кининогены являются гликопротеидами. ВМВ кининоген быка состоит из одной полипептидной цепи с молекулярным весом 76 ОООд, содержащей четыре фрагмента: тяжелая цепь, кинино-вая последовательность, фрагмент 1 2 богатый глицином и гистиди-ном, и легкая цепь. Он содержит 580 аминокислот / Kato et ai , 1976/. Этот кининоген является субстратом для калликреина плазмы. / Уапо et air 1971/. HMB кининоген имеет молекулярный вес 48 ОООд и содержит 380 аминокислотных остатков. / Kato et ai, 1976/ и является субстратом для тканевого калликреина, освобождающего из НМВ-кининогена декапептид - лизилбрадикинин /каллидин/. На рис.1 представлена схема ферментативного расщепления кининогенов калликреинами плазмы и тканей.
