Введение к работе
Актуальность проблемы. Симбиоз между растениями и грибами арбускулярной микоризы (AM) является одним из наиболее древних и широко распространённых взаимовыгодных растительно-микробных взаимодействий. Его возникновение около 450 миллионов лет назад, вероятно, явилось ключевым фактором, способствовавшим колонизации растениями суши (Remy et al., 1994). Более 80% видов наземных растений формируют AM, что способствует улучшению их минерального питания (преимущественно фосфатного) и дополнительному поступлению воды в растение (Harrison et al., 2005). Была доказана роль AM симбиоза в повышении устойчивости растений к биотическим (патогены корней) и абиотическим (наличие тяжёлых металлов, засоленность почв, засуха) стрессовым факторам (Dumas-Gaudot et al., 2000; Gianinazzi et al., 2005). В свою очередь растение предоставляет грибу ассимилированный при фотосинтезе углерод, который он самостоятельно получает сапротрофным путём в недостаточном для нормальной жизнедеятельности количестве. Было подсчитано, что все растения земли передают AM грибам около 5 миллиардов тонн углерода в год (Parniske et al., 2004). Таким образом, научная, агрономическая и экологическая значимость данных взаимовыгодных растительно-грибных взаимодействий огромна.
Большую роль в процессе определения генетических детерминант симбиоза играет получение и изучение симбиотических {SYA4) мутантов растений с нарушениями развития AM, что даёт возможность исследовать симбиоз на конкретных этапах его формирования. Клонирование SYM генов позволяет определить молекулярные основы мутаций и предположить функцию молекулярных продуктов изучаемых генов.
Другим приоритетным направлением генетики симбиоза является идентификация генов растений и AM грибов, экспрессия которых существенно изменяется в процессе формирования и функционирования AM симбиоза. Такие гены можно рассматривать в качестве молекулярных маркеров процессов (сигналинга, защитных реакций, метаболизма), происходящих в растении и грибе при симбиозе. Использование в исследованиях такого рода симбиотических мутантов растений с блоком развития AM существенно увеличивает информативность подхода и позволяет связать происходящие изменения с конкретными стадиями развития симбиоза.
Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение роли поздних симбиотических генов гороха PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании функционального AM симбиоза. Были поставлены следующие задачи исследования:
изучение эффекта мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию генов Glomus intraradices при формировании AM симбиоза;
изучение экспрессии генов гороха {Pisum sativum L.), предположительно связанных с формированием AM симбиоза, при микоризации корней растений дикого типа и мутантов RisNod24 (Pssym36), SGEFix"-2 (Pssym33) и SGEFix"-l (Pssym40);
анализ экспрессии генов G.intraradices в растительных клетках, содержащих арбускулы;
разработка молекулярных маркеров и анализ сцепления генов PsSym36, PsSym40 и маркеров для локализации генов на генетической карте гороха с целью их последующего точного картирования и позиционного клонирования.
Научная новизна. Впервые проведено исследование влияния мутаций в симбиотических генах гороха посевного (Pisum sativum L.) PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на экспрессию восьми генов P. sativum и десяти генов G. intraradices, предположительно вовлечённых в формирование функционального AM симбиоза. Было показано, что блокирование развития арбускул в корнях мутанта RisNod24 (Pssym36) приводит к существенному снижению экспрессии большей части анализированных грибных и растительных генов, в то время как более высокие темпы микоризации корней мутанта SGEFix"-l (Pssym40) коррелируют с более высоким, чем у растений дикого типа, уровнем экспрессии изученных грибных генов. Мутации в генах PsSym33 и PsSym40 имеют менее выраженный эффект на экспрессию анализированных генов гороха, чем мутация в гене PsSym36. Использование метода микродиссекции клеток лазером позволило осуществить выделение РНК из клеток, содержащих арбускулы, и впервые продемонстрировать преимущественную экспрессию генов G. intraradices, кодирующих супероксиддисмутазу (SOD), стеароил-СоА-десатуразу (DESAT) и пептидил-пролил-изомеразу (PEPISOM), в арбускулах.
Методическая и практическая значимость. Методология и молекулярные инструменты, разработанные в данном исследовании, могут быть использованы в дальнейшем при изучении растительных и грибных генов, контролирующих формирование и функционирование AM. Полученный растительный материал (популяции растений поколений F1 и F2), разработанные молекулярные маркеры, а также данные картирования могут существенно облегчить дальнейшую работу по локализации генов гороха PsSym36 и PsSym40 на генетической карте для последующего точного картирования и позиционного клонирования данных генов. Полученные данные экспрессии растительных и грибных генов могут послужить базой для последующей работы по определению роли генов PsSym36, PsSym33 и PsSym40 в формировании симбиотических взаимоотношений растения с клубеньковыми бактериями и грибами арбускулярной микоризы. Результаты проведённых исследований могут быть использованы в курсах генетики развития и функционирования растительно-микробных систем профильных институтов и университетов.
Финансовая поддержка. Стипендия Департамента Науки, технологии и космоса Французского посольства в Москве, гранты РФФИ (07-04-01558, 07-04-01171).
Апробация работы. Результаты работы были представлены на международном симпозиуме и школе молодых учёных «The third Baltic sea region symposium and postgraduate course on agro-biotechnology focused on root-microbe systems» (Saint-Petersburg, Russia, 2007), конференциях «Plant-Microbial Interactions 2008 Conference» (Krakow, Poland, 2008), «Forum des Jeunes Chercheurs» (Besancon, France, 2008), «International Conference on Mycorrhiza 2009 ICOM6» (Belo Horizonte, Brazil, 2009), 9-м конгрессе IPMB «Leading Biology through Plant Science» (St. Louis, USA, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 6 тезисов докладов на международных научных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, четырёх глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводов, списка литературы (259 наименований) и приложения. Работа изложена на 191 странице, содержит 23 рисунка и 19 таблиц.
Похожие диссертации на Характеристика генов гороха (Pisum sativum L.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
