Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Генные сети 12
1.2. Структурная геномика 19
1.2.1. Методы реконструкции изоформ мРНК любого гена человека 20
1.2.2. Методы, позволяющие установить геномную структуру любой изоформы мРНК гена (прошлое и настоящее) 26
1.2.3. Стратегии построения полной транскрипционной карты генома человека 28
1.3. Функциональная геномика 30
1.3.1. Как реконструировать генетическую сеть? 31
1.3.2. Методы исследования регуляции экспрессии различных изоформ мРНК одного гена 33
1.3.3. Способы изучения белок - белковых взаимодействий 41
1.3.4. Исследования экспрессии совокупности генов на уровнях транскрипции и трансляции 50
1.4. Современное состояние исследований генов района ql4.3 хромосомы 13 человека, утрачиваемого при многих онкологических заболеваниях 57
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Материалы 63
2.1.1. Оборудование 63
2.1.2. Реактивы и расходные материалы 63
2.1.3. Фотоматериалы 64
2.1.4. Ферментные препараты 64
2.1.5. Штаммы клеток, использованные в работе 64
2.1.6. Библиотека рекомбинантных космидных клонов ICRF С108 65
2.1.7. Библиотека рекомбинантных космидных клонов LANL13NC01 65
2.1.8. Экспрессионная кДНК библиотека для дрожжевой двугибридной системы 66
2.2. Методы 66
2.2.1. Среды, условия хранения и культивирования бактерий 66
2.2.2. Выделение плазмидной и космидной ДНК из клеток Е. coli. 68
2.2.3. Выделение дрожжевой ДНК 70
2.2.4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 71
2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей 72
2.2.6. Клонирование фрагментов ДНК 73
2.2.7. Трансформация в штаммы клеток 75
2.2.8. Выделение тотальной РНК из культуры клеток 78
2.2.9. Приготовление радиоактивно меченых ДНК-зондов 79
2.2.10. Рестрикционный анализ ДНК и Саузерн-блоттинг 80
2.2.11. Гибридизация Саузерн- и нозерн-блотов. Гибридизация на колониях 82
2.2.12. Процедуры полимеразной цепной реакции (ГЩР) 83
2.2.13. ОТ-ПЦР 84
2.2.14. Эксперимент по достройке праймера 85
2.2.15. Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера 86
2.2.16. Проверка взаимодействия двух белков в двугибридной системе 87
2.2.17. Тест на присутствие в дрожжах белка, кодируемого репортерным геном lacZ. 88
2.2.18. Метод "потери плазмид" 89
2.3. Программное обеспечение, использованное в работе 90
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 92
3.1. Космидный контиг области, содержащей гены RFP2, RFP20S, C130RFlnKCNRG 92
3.2. Экзон-интронная структура и возможная функция гепа. RFP2 94
3.2.1. Картирование гена RFP2 94
3.2.2. Изоформы мРНК гена RFP2 95
3.2.3. Экзон-интронная структура гена RFP2 100
3.2.4. Анализ профиля экспрессии гена RFP2 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека 102
3.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформмРНК гена RFP2 104
3.2.6. Ортологи гена RFP2 105
3.2.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном RFP2 106
3.2.8. Поиск партнеров белка RFP2 методом дрожжевой двугибридной системы 112
3.2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы 113
3.2.10. Возможная функция гена RFP2 119
3.3. Экзон-интронная структура и возможная функция гена RFP20S. 120
3.3.1. Картирование гена RFP20S 120
3.3.2. Структура изоформы РНК гена RFP20S 121
3.3.3. Возможная функция гена RFP20S 122
3.4. Экзон-интронная структура и возможная функция гена KCNRG. 123
3.4.1. Картирование гена KCNRG 123
3.4.2. Экзон-интронная структура гена KCNRG 123
3.4.3. Анализ профиля экспрессии гена KCNRG в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека 127
3.4.4. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформмРНК гена KCNRG 128
3.4.5. У тепа KCNRG, вероятно, присутствует собственная промотерная область 129
3.4.6. Ортологи гена KCNRG 130
3.4.7. Анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых геном KCNRG 130
3.4.8. Возможная функция белкового продукта гена KCNRG... 134
3.5. Экзон-интронная структура и возможная функция гена C130RF1 135
3.5.1. Картирование гена C130RF1 135
3.5.2. Реконструкция изоформ мРНК гена C130RF1 136
3.5.3. Экзон-интронная структура гена C130RF1 139
3.5.4. Анализ профиля экспрессии гена C130RF1 в нормальных тканях и опухолевых клеточных лигиях человека 144
3.5.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена C130RF1 147
3.5.6. Ортологи гена C130RF1 147
3.5.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном C130RF1 149
3.5.8. Поиск партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы 151
3.5.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы 152
3.5.10. Возможная функция гена C130RF1 153
4. Заключение 155
5. Выводы 160
6. Список литературы 162
7. Приложения 194
- Стратегии построения полной транскрипционной карты генома человека
- Библиотека рекомбинантных космидных клонов LANL13NC01
- Анализ профиля экспрессии гена RFP2 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека
- Анализ профиля экспрессии гена KCNRG в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека
Введение к работе
Актуальность темы. Опухолевые заболевания занимают второе место в мире как причина смертности после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Для многих типов опухолей пока не выявлены гены, повреждения которых служат "спусковым крючком" активного канцерогенеза. Выявление генов связанных с развитием опухолей создает основу для понимания молекулярных механизмов возникновения и развития онкозаболеваний, а также приводит к появлению новых методов их диагностики и лечения. Поэтому исследования, направленные на поиск и изучение генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, остаются высоко актуальными.
Причиной возникновения и прогрессии опухолей являются изменения генома соматических клеток. Этот факт заметно облегчает переход от стадии описания фенотипических проявлений заболевания, в том числе хромосомных перестроек, часто сопровождающих процесс возникновения опухолей, к стадии выяснения молекулярных механизмов его развития. Показано, что перестройки участков генома человека могут приводить к утрате или дефектам генов (так называемых супрессоров опухолевого роста), в норме подавляющих клеточное деление и развитие опухолей. Одним из таких участков генома явлется 13ql4.3, повреждаемый при некоторых онкологических заболеваниях, таких как В-клеточный хронический лимфолейкоз, рак простаты и других. В большинстве работ минимальный утрачиваемый район был ограничен STS- маркерами D13S273 и D13S25. Благодаря результатам, полученным в ходе международного проекта "Геном человека", в настоящий момент у исследователя имеются практически все необходимые данные для выявления точной структуры генов, находящихся в этой области. Нуклеотидная последовательность этого района, размером приблизительно 800 т.п.н., содержит семь генов, лишь три из которых были ранее охарактеризованы.
Данная работа посвящена характеристике структуры и функции четырех генов человека RFP2, RFP20S, KCNRG и C130RF1, один из которых может являться искомым геном-супрессором опухолевого роста, повреждаемым при перестройках области 13ql4.3.
Цель и задачи исследования. Целью исследования является структурная и функциональная характеристика генов человека RFP2, RFP20S, KCNRG и C130RF1, являющихся возможными кандидатами на роль супрессора опухолевого роста.
Для реализации поставленной цели при исследовании этих генов решались следующие задачи:
Выявить соответствующие генам изоформы мРНК и установить их экзон-интронную структуру;
Провести анализ тканеспецифичности экспрессии исследуемых генов;
Провести in silico функциональную характеристику предсказанных аминокислотных последовательностей кодируемых исследуемыми генами;
Методом дрожжевой двугибридной системы выявить гены, продукты которых являются потенциальными партнерами по взаимодействию белков, кодируемых исследуемыми генами.
Научная новизна. Впервые выявлено наличие нескольких изоформ мРНК генов человека RFP2, RFP20S, KCNRG, C130RF1 и экспериментально подтверждено существование этих изоформ методами ОТ-ПЦР и нозерн-гибридизации. Установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов. Методом анализа in silico выявлены вероятные функциональные домены в аминокислотных последовательностях генов RFP2, KCNRG и C130RF1. С помощью дрожжевой двугибридной системы для белка RFP2 выявлены десять, а для белка C130RF1 - два потенциальных партнера по взаимодействию.
Научно-практическая значимость работы. В области 13ql4.3 уточнена локализация рекомбинантных космид, которые могут быть использованы в клинической цитогенетике на ДІЖ пациентов, больных онкологическими заболеваниями, для идентификации хромосомных перестроек. ДНК этих клонов также может быть использована для поиска областей, регулирующих транскрипционную активность генов данной области.
Полученные данные о структуре генов RFP2, RFP20S, KCNRG и C130RF1 позволяют приступить к их детальному мутационному анализу на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. Подробный структурный анализ этих генов создает базу для последующих функциональных исследований.
Функциональная характеристика исследуемых генов впервые позволила высказать предположения о возможной роли каждого из них в развитии онкологических заболеваний, ассоциированных с исследуемой областью. Полученные результаты по выявлению генов, белковые продукты которых являются потенциальными партнерами RFP2 и C130RF1, могут быть использованы при построении генных сетей, элементами которых являются исследованные гены.
Стратегии построения полной транскрипционной карты генома человека
Огромные средства, которые были затрачены на определение полной нуклеотидной последовательности генома человека международным консорциумом по секвенированию генома человека (IHGSC) и компанией «Селера», не привели к построению полной транскрипционной карты человека. Причина этого в том, что нуклеотидная последовательность генома человека необходима для точного описания и составления списка всех генов, но не достаточна. Гены человека - это очень сложные структурные образования и невозможно с полной уверенностью предсказать местоположение каждого из их элементов, ориентируясь только на нуклеотидную последовательность генома. В заключительной главе статьи в журнале Science (Venter J.C. et al., 2001) Крейг Вентор с коллегами признают, что для выявления истинной природы предсказанных генов необходимо экспериментально показать присутствие соответствующих им мРНК в клетках и тканях. Автор данного обзора целиком и полностью поддерживает это мнение. Таким образом, каждый предсказанный ген требует дополнительной экспериментальной проверки.
В работе (Shoemaker D.D. et al., 2001) было предложено протестировать все экзоны, предсказанные в составе последовательности генома, поместив им соответствующие нуклеотидные матрицы на микрочип.
Гибридизуя микрочип с меченной кДНК синтезированной на матричной РНК выделенной из разных тканей можно определить, существует ли предсказанный экзон в составе реально экспрессирующихся молекул мРНК. Если на такой чип нанести фрагменты последних экзонов совокупности генов человека, представляющие собой последовательности, содержащие альтернативные сайты узнавания для ферментов, осуществляющих полиаденилирование, то на таком чипе можно качественно, а иногда и количественно (в случае различия в экспрессии на порядок) сопоставить экспрессию разных изоформ гена.
Помимо выявления "ложноположительных сигналов", перед учеными стоит еще более сложная проблема: как искать гены, которые транскрибируются лишь на определенных этапах развития, а также гены, уровень экспрессии которых столь низок, а регуляция столь уникальна, что их сложно выявить современными методами идентификации генов. Одним из решений этой проблемы можно признать идею создания базы данных, состоящей из кластеров экспрессирующихся последовательностей (UniGene) (Wheeler D.L. et al., 2001). Для этого устанавливают нуклеотидные последовательности фрагментов клонов кДНК клонотек, полученных из разных тканей на разных этапах развития, со стандартных праймеров, подобранных к последовательности вектора (технология Expressed Sequence Tag, EST). Все эти последовательности хранятся в базе данных dbEST и могут быть проанализированы с помощью разнообразных программных средств, обнаруживающих области гомологии. Набор таких последовательностей производится массированно - скорость пополнения общедоступных баз данных составляет сотни тысяч индивидуальных последовательностей в месяц, что значительно повышает вероятность обнаружения уникального транскрипта. В результате работы программы глобального выравнивания всех EST из одного организма друг против друга получают кластеры экспрессирующихся последовательностей, содержащие от одного до 16384 EST в каждом. EST в составе каждого из кластеров вполне можно рассматривать как фрагменты изоформ мРНК одного гена, при этом одному гену может соответствовать более одного кластера EST. В сентябре 2002 года было описано 121062 EST-кластеров, но это число постоянно изменяет в большую или меньшую сторону, что отражает временные срезы состояния базы данных.
Решению этой проблемы также могли бы помочь результаты межвидового сопоставления геномов млекопитающих, которых можно добиться при использовании методов сравнительной геномики (Hedges S.B. and Kumar S., 2002; Li S. et al., 2002; Rubin G.M. et al., 2000; Graves J.A., 1998). Однако на настоящее время количество геномов доступных для анализа ограничивается геномами человека Homo sapiens (Venter J. et al., 2001; Lander ES et al., 2001), мыши Mus musculus (геном секвенирован компанией "Селера"), рыбы Fugu rubripes (Aparicio S. et al., 2002), насекомым Drosophila melanogaster (Adams M.D. et al., 2000), червем Caenorhabditis elegans (Waterston R. and Sulston J., 1995; Hodgkin J. et al., 1995) и рядом геномов растений. Однако, филогенетическая отдаленность этих геномов от человеческого (кроме генома мыши) ограничивает возможности поиска новых генов эволюционно-консервативными генными семействами.
Провести детальное исследование функции гена без данных о его структуре невозможно. Данные по нуклеотидной последовательности, соответствующей только фрагменту изоформы мРНК, который кодирует аминокислотную последовательность, информативны лишь на первых этапах функционального анализа гена. Таким образом, фундаментом серьезных исследований в функциональной геномике служат результаты структурной геномики: список нуклеотидных последовательностей всех изоформ мРНК (в том числе и минорных) всех генов с указанием их геномной структуры. Этот список на данный момент составлен на 30-50 процентов (Birney Е. et al., 2001), и далек от совершенства. Однако это ограничение никак не помешает нам рассмотреть те методы функциональной геномики, которые успешно применяются в настоящий момент при исследовании индивидуальных генов. Эти методы будут использоваться и тогда, когда список всех генов (полная транскрипционная карта генома человека) будет получен.
Библиотека рекомбинантных космидных клонов LANL13NC01
Фрагмент гена RFP2, соответствующий открытой рамке считывания белка RFP2, за исключением его гидрофобного С-концевого участка, был получен с помощью ПЦР (смотрите пункт 2.2.12) на матрице кДНК с затравляющих праймеров MIKlUDt и DomSal (MIKlUDt: 5 - ТСТ GGA ТСС TTG TGA TGG AGC TGC TTG AA - 3 ; DomSal : 5 - TGT GTC GAC AGA GGG AGG TAA AGG AGT - 3 ), содержащих сайты рестрикции ВатШ и Sail, и клонирован с сохранением рамки считывания в шаттл-вектор pGBT9, содержащий домен связывания с ДНК (BD) GAL4, ген устойчивости кампицилину и ген, позволяющий проводить селекцию дрожжевых клеток на среде без триптофана. После процедур лигирования (проводили при температуре 15С в течении 12 часов) и трансформации клеток Е. coli был получен клон pGBT+RFP2, содержащий вставку кДНК, кодирующую цинк связывающие домены RING и ВВОХ типа, а также "спирально-скрученный" домен белка гена RFP2 в нужной ориентации с сохранением рамки считывания. Сохранность рамки считывания после процедур клонирования проверили с помощью определения нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера (смотрите пункт 2.2.15) с использованием [a-32P]dATP.
Фрагмент гена C130RF1, соответствующий открытой рамке считывания, был получен с помощью ОТ-ПЦР (смотрите пункт 2.2.13) на матрице мРНК, выделенной из клеточной линии Lim 1215 (рак толстого кишечника) с затравляющих праймеров forvTanT и revTanT (forvTanT: 5 AT GGA ТСС CGA TGG CCA CCT CGG TGT-3 ; revTanT: 5 AA GTC GAC ATT CAG AAG ATT TGC TGT TC-3 ). Эти олигонуклеотиды содержат сайты рестрикции ВатШ и Sail. Полученный ОТ-ПЦР продукт был клонирован с сохранением рамки считывания в шатл-вектор pGBT9. После процедур лигирования (проводили при температуре 15С в течении 12 часов) и трансформации клеток Е. coli был получен клон pGBT+C130RFl. Сохранность рамки считывания после процедур клонирования проверили с помощью определения нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера Х У с использованием [ot-JZP]dATP.
КДНК, соответствующая открытой рамке считывания гена C130RF1, была поднята с помощью ОТ-ПЦР (смотрите пункт 2.2.13) на матрице мРНК, выделенной из клеточной линии Lim 1215 (рак толстого кишечника). Для этого были подобраны и синтезированы биотехнологической фирмой "Литех" (Россия) праймеры wi9Gf (5 - TGT AAG СТТ ATG GCC АСС TCG GTG TTG Т - 3 ) и wi9Gr (5 - TGT GGA ТСС AAA CCA GGT GGA GGC GTA
TGA - 3 ). Эти олигонуклеотиды содержат последовательности, соответствующие сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции Hindlll и ВатШ., так чтобы с полученного продукта мРНК после клонирования мог образоваться рекомбинантный белок. Затем наработанный фрагмент кДНК был клонирован по указанным сайтам в вектор pEGFP-Nl "Clontech". После процедур лигирования (проводили при температуре 15С в течение 12 часов) и трансформации клеток Е. coli был получен клон pGC130RFl. Сохранность рамки считывания в полученной конструкции после процедур клонирования мы проверили с помощью определения нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера (смотрите пункт 2.2.15) с использованием [a-32P]dATP.
КДНК, соответствующая открытой рамке считывания изоформы А гена KCNRG, была наработана с помощью ПЦР с плазмидной ДНК клона IMAGE: 4690662. С этой целью были подобраны и синтезированы биотехнологической фирмой "Литех" (Россия) олигонуклеотиды NgreF (5 AT СТС GAG ATG AGT AGT CAG GAA CTG GT - 3 ) и NgreR (5 - TAT GGA TCC ATA CCT GTA АТС CCA GCT A - 3 ). Эти праймеры содержат последовательности, соответствующие сайтам узнавания эндонуклеаз рестрикции Xhol и ВатШ, так чтобы с полученного продукта мРНК после клонирования мог образоваться рекомбинантный белок. Затем наработанный фрагмент ДНК был клонирован по указанным сайтам в вектор pEGFP-Nl. После процедур лигирования (проводили при температуре 15С в течение 12 часов) и трансформации клеток Е. coli был получен клон pGCKCNRG. Сохранность рамки считывания в полученной конструкции после процедур клонирования проверили с помощью определения нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера (смотрите пункт 2.2.15) с использованием [a-32P]dATP.
Для получения компетентных клеток использовали модификацию метода Ханана, описанную Александером (Alexander, D.C. et al., 1984). Клетки культивировали в 40 мл среды 2xYT при 37С до плотности А6оо = 0.5, затем охлаждали в ледяной бане в течение 2 часов. После этого клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 20 мл охлажденного раствора, состоящего из 100 мМ хлорида кальция, 70 мМ хлорида магния и 40 мМ ацетата натрия (рН 5.5), после чего инкубировали во льду в течение 40-45 минут. Затем клетки снова центрифугировали и осторожно ресуспендировали в сходном по составу растворе с добавлением 15% глицерина. Аликвоты компетентных клеток замораживали в жидком азоте и сохраняли при - 70 С.
Приготовленные компетентные клетки обеспечивали эффективность трансформации порядка 5x10 - 1x10 на 1 мкг плазмиды pGEM-3Zf.
Для проведения трансформации к 200 мкл компетентных клеток добавляли ДНК, смесь выдерживали во льду в течение 30 минут и проводили тепловой шок при 42 С в течении 1-1.5 мин. Затем добавляли 800 мкл среды 2xYT, клетки подращивали в течение 70-90 минут при 37 С. Затем подросшие клетки осторожно осаждали центрифугированием при 4000 об/мин, ресуспендировали 50-100 мкл среды 2xYT и распределяли по поверхности бактериологических чашек со средой LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл.
Анализ профиля экспрессии гена RFP2 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека
Не менее интересны и другие белки, в высокой степени гомологичные белковому продукту гена RFP2 и выявляемые программами PSI- и PHI-BLAST при анализе баз данных аминокислотных последовательностей (были отобраны белки с E.value равной или меньше чем 10"7). Среди них белок XPRF (E.value 10 ), продукт гена MIDI, ответственного за развитие синдрома Опитца (G/BBB) - наследственного нарушения морфогенеза срединной линии у человека. Белок XPRF вовлечен в такие фундаментальные процессы, как закладка органов эмбриона и контроль пролиферации клеток (Quaderi N.A. et al., 1997; Gaudenz К. et al., 1998). Другой белок, гомологичный RFP2, Rpt-1 (E.value 10" ) - это внутриклеточный протеин, обнаруженный в покоящихся Т-хелперах. Он связывает промотор и регулирует экспрессию гена а-цепи рецептора интерлейкина-2, а также связывает длинные концевые повторы вируса иммунодефицита человека HIV-1 (Patarka R. et al., 1988). Имеет аминокислотное сходство с RFP2 и так называемый Ro/SSA белок (E.value 10"11), антитела к которому присутствуют в крови пациентов такими аутоиммунными заболеваниями, как синдром Шогрена, системная красная волчанка и волчанка новорожденных (Chan Е.К. et al., 1991; Sibilia J., 1998). Патогенное действие Ro/SSA антител приводит к повреждениям кожи у взрослых людей и остановке сердца у новорожденных.
Белок Ro/SSA входит в состав рибонуклеопротеиновых комплексов, находящихся в большинстве человеческих тканей и клеток, в том числе клетках крови. Качественный и количественный состав этих комплексов варьирует в зависимости от тканевой принадлежности клетки и стадии эмбрионального развития. Облучение УФ и вирусные инфекции приводят к перемещению Ro/SSA-содержащих комплексов из ядра в цитоплазму и даже к мембране клетки, что приводит к усилению аутоиммунных реакций у пациентов.
Ряд белков, имеющих высокое сходство с RFP2, специфичны для мышечной ткани. Все они входят в семейство мускул специфических белков содержащих домен RING и вовлечены в процессы сокращения мышц и регулируют активность, либо функционально ассоциированы с крупным миофибрилярным белком титином. Так белок MURF-1 (E.value 1017), связывается с повтором в титине примыкающем к его киназному домену, регулируя активность М-линии в саркомере (McElhinny A.S. et al., 2002; Centner Т. et al., 2001). В свою очередь, белки MURF-2 (E.value 10"16) и MURF-3 образуют комплексы с MURF-1. При этом MURF-3 влияет на стабильность микротрубочек (Centner Т. et al., 2001).
Белковое семейство Rfp, к которому принадлежит белок RFP2, эволюционно консервативно. Белки, в высокой степени гомологичные RFP2, обнаружены у гребенчатого тритона Pleurodeles waltii, шпорцевой лягушки Xenopus laevis, и даже у нематоды Cenorhabditis elegans. Белок гребенчатого тритона АЗЗ (E.value 10 19) - это ядерный белок, расположенный на петлях "ламповых щеток" хромосом (Bellini М., 1993). Он связан с новосинтезированными транскриптами, что предполагает его участие в процессе синтеза пре-мРНК либо в процессинге. Белок шпорцевой лягушки XNF7 (E.value 10" 6) способен связываться с двуцепочечной ДНК (Reddy В.А. et al., 1991). Этот белок сохраняется в цитоплазме ооцита лягушки со времени его созревания и вплоть до эмбриональной стадии средней бластулы. На стадии средней бластулы он перемещается из цитоплазмы в ядро, что приводит к запуску генетической программы определения дорсально-вентральной симметрии и закладке мезодермы (El-Hodiri Н.М. et al., 1997). Миграция XNF7 между ядром и цитоплазмой регулируется его фосфорилированием митоген-активируемыми киназами и циклином B/cdc2 (El-Hodiri, Н.М. et al., 1997а). Функциональные свойства многих других белков, имеющих высокое сходство с белком RFP2, пока не определены. К числу белков, имеющих сходство с RFP2, относятся еще ряд хорошо описанных белков, в том числе вовлеченных в процессы опухолеобразования (BRCA1), однако степень сходства для них ниже, чем для описанных выше.
В работе 2001 года, представленной в журнале EMBO (Reymond A. et al., 2001), Раймонд с коллегами показали, что белковый продукт гена RFP2 локализуется около ядра. Эксперимент по колокализации, проведенный этими исследователями, белка RFP2 с белками-маркерами аппарата Гольджи гиантином и гаЬ2, позволяет сделать вывод, что белок RFP2 не локализован в аппарате Гольджи, то есть не является мембранным белком цитоплазматической мембраны или секретируемым белком. Следовательно, белок RFP2 является либо цитоплазматическим белком с около ядерной локализацией, либо мембранным белком эндоплазматического ретикулама. Этот результат интересен еще и потому, что в С-концевой области аминокислотной последовательности белка, не кодирующей какие-либо консервативные домены и не имеющей существенной гомологии с известными белками, программа SOSUI предсказала наличие двух трансмембранных доменов.
Среди доменов белкового продукта гена RFP2 хотелось бы отдельно обсудить цинк-связывающий домен RING типа, функцию которого до последнего времени сводили к образованию белок-белковых комплексов. Новые исследования этого домена в разных белках человека (Lai Z. et al., 2001; Lorick K.L. et al., 1999; Freemont P.S., 2000) показали, что наиболее общей его функцией является специфическое взаимодействие с Е2 убиквитин-связывающим энзимом, способствующим переносу по полиубиквитиновой "метки" на белок, подлежащий разрушению в 26S протеосомах. Таким образом, как RING-домен содержащие белки часто являются Е2-зависимыми ЕЗ убиквитин-лигазами (Freemont P.S., 2000)
В связи с нашим обсуждением возможной функции белка RFP2 представляются интересными работы, описывающие белок Der3/Hrdlp, содержащий RING-домен и также являющийся Е2-зависимой ЕЗ убиквитин-лигазой (Taxis С. et al., 2002; Deak P.M. and Wolf D.H., 2001). Этот белок содержит шесть трансмембранных доменов и встроен в мембрану эндоплазматического ретикулума, при этом RING-домен находится со стороны цитоплазмы. Белок Der3/Hrdlp вовлечен в процесс деградации неправильно свернувшихся или неспособных образовывать специфические комплексы белков эндоплазматического ретикулума. Наличие трансмембранных доменов и RING-домена в белке RFP2, а также данные по локализации позволяют высказать гипотезу о схожей функции белкового продукта гена RFP2.
Суммировав вышеизложенные данные, следует отнести белок RFP2 к семейству Rfp-подобных белков, содержащих трехчастный домен, и предположить, что, подобно другим описанным членам этого семейства, RFP2 способен образовывать белковые комплексы. Белковый продукт гена RFP2 является либо цитоплазматическим белком, либо трансмембранным белком эндоплазматического ретикулума. Все ближайшие гомологи белка RFP2 вовлечены в те или иные процессы, связанные с клеточной дифференциацией, регуляцией раннего развития эмбриона, вовлечены в иммунный ответ, а также в неопластическую трансформацию клеток. Многие белки, содержащие цинк-связывающий домен RING типа, являются Е2-зависимыми ЕЗ убиквитин-лигазами. Предполагается, что и RFP2 принимает участие в одном из этих процессов.
Анализ профиля экспрессии гена KCNRG в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека
Белковый продукт гена KCNRG содержит единственный домен ТІ, занимающий положение с аминокислотной позиции 7 по позицию 94. Этот результат получен при анализе аминокислотной последовательности гена KCNRG с помощью программы "Search the Conserved Domain Database using RPS-BLAST"). Домен ТІ - это N-концевой, цитоплазматический домен ответственный за тетрамеризацию а-субъединиц калиевых каналов, открывающихся в зависимости от разности потенциалов на мембране клетки (Miller С, 1992; Larsson Н.Р. et al., 1996). Этот домен имеет отдаленную гомологию с BTB/POZ доменом, который участвует в белок-белковых взаимодействиях и присутствует во многих транскрипционных факторах. Большинство исследованных белков, содержащих ТІ-домен, являются потенциал-зависимыми калиевыми каналами, которые лучше всего изучены в электрочувствительных клетках мозга, скелетных и сердечных мышцах.
Потенциал-зависимые калиевые каналы состоят из четырех а-субъединиц, которые формируют пору для прохождения ионов, и четырех р-субъединиц, регулирующих активность канала. Таким образом, потенциал-зависимые калиевые каналы имеют структуру октамера. Каждая а-субъединица содержит шесть трансмембранных доменов S1-S6, Р-сегмент между S5 и S6, который участвует в формировании поры для прохождения ионов калия, и глобулярный домен, расположенный в аминоконцевой области белка (локализован в цитозоле), который необходим для инактивации открытого канала (Miller С, 1992; Larsson Н.Р. et al., 1996). Трансмембранный домен S4 содержит положительно заряженные аминокислоты, которые делают его чувствительным к изменению заряда на мембране. За счет этого домена калиевый канал открывается при деполяризации мембраны. Домен ТІ расположен между глобулярным доменом непосредственно перед первым трансмембранным доменом.
Потенциал-зависимые калиевые каналы ответственны за калиевый ток из клетки, но не обратно в клетку из межклеточного пространства. Четыре потенциал-зависимых калиевых канала Shaker, Shal, Shaw и Shab были изолированы из мухи D.melanogaster. Потенциал-зависимые калиевые каналы млекопитающих были разбиты на четыре группы Kvl, Kv2, Kv3, Kv4 исходя из их гомологии с каналами Shaker, Shal, Shaw и Shab мухи D.melanogaster (Chandy K.G. and Gutman G.A., 1995; Manganas L.N. and Trimmer J.S., 2000; Revest P. and Longstaff A., 1998). Недавно были клонированы четыре семейства неактивных каналов Kv5, Kv6, Kv8, Kv9. Субъединицы из этих семейств активны только в гетерокомплексах с белками из семейств Kvl, Kv2, Kv3, Kv4 (Patel A J. et al.,1997).
Однако белок KCNRG не содержит трансмембранных доменов и является растворимым. Этот вывод был получен нами с помощью программы SOSUI, предсказывающей трансмембранные домены в исследуемой аминокислотной последовательности. Белок KCNRG не содержит также и глобулярного домена. Эти данные позволяют нам выдвинуть гипотезу, что белковый продукт гена KCNRG регулирует активность потенциал-зависимых калиевых каналов через процесс их сборки в октамеры.
Для того чтобы проверить эту гипотезу, нами была создана конструкция pGKCNRG (смотрите пункт 2.2.6 материалов и методов) на базе вектора pEGFP-Nl, кодирующего зеленый флюорисцентный белок. Эта конструкция была передана нашим французским коллегам из лаборатории нейрофизиологии (University of Bordeaux II, France). Эта конструкция была использована, для того чтобы проверить возможное участие KCNRG в регуляции тока калия в клетке. На клеточной линии LNCaP (рак простаты) сотрудниками лаборатории нейрофизиологии (University of Bordeaux II, France) было показано, что гиперэкспрессиия белка KCNRG приводит к снижению тока калия (личное сообщение). Этот результат свидетельствует о возможном участии белкового продукта гена KCNRG в регуляции калиевых каналов, по крайней мере, в клеточной линии LNCaP.
Эти данные, а также результаты, полученные при анализе аминокислотной последовательности белка, позволяют выдвинуть гипотезу, что KCNRG препятствует сборке каналов, выполняя регуляторную функцию. Конкретизировать калиевые каналы, с которыми взаимодействует белок KCNRG, подавляя их активность, не представляется возможным: библиотека для дрожжевой двугибридной системы, использованная в этом исследовании, не подходит для этой задачи. Эта библиотека обогощена С-концевыми аминокислотными последовательностями. В нашем же случае, очевидно, необходима N-область. Так же представляется сомнительным, что белок, содержащий трансмембранные домены сможет правильно свернуться и проникнуть в ядро. В такой ситуации следует использовать библиотеку, созданную на основе совокупности случайных праймеров.
В последнее время появились работы, в которых показано, что активность калиевых каналов является одним из ключевых факторов определяющих переход клеток из фазы G1 клеточного цикла к митозу (Abdul М. and Hoosein N., 2002). В некоторых клеточных типах, усиление экспрессии генов калиевых каналов или понижение активности их белковых продуктов ассоциированы с делением этих клеток. Например, Скрима с соавторами (Skryma R.N. et al., 1997) показали, что клеточная линия LNCaP рака простаты активно пролиферирует при активации потенциал-зависимых калиевых каналов. Когда калиевые каналы блокированы, митогенная активность клеток оказывается подавленной. Для потенциал-зависимых калиевых каналов показана вовлеченность в клеточный цикл (Abdul М. and Hoosein N., 2002), дифференцировку (Rao J.N. et al., 2002) и апоптоз (Ekhterae D. et al., 2001; Krick S. et al., 2002). В частности, активность потенциал-зависимых калиевых каналов важна при пролиферации лимфоцитов (Chung I.
et al., 1997). Так активность калиевого канала Kvl.3 приводит к пролиферации Т-лимфоцитов (Chang М.С. et al., 2001; Levite М. et al., 2000).
Как было показано нашими коллегами из лаборатории нейрофизиологии, KCNRG вероятно подавляет активность калиевых каналов. Возможно, любой фактор, подавляющий активность калиевых каналов, может ослаблять митотическую активность некоторых типов клеток (лимфоцитов, клеток простаты). Известно, что селективный блокатор Е-4031 калиевого канала HERG, подавляет пролиферацию клеточных линий СЕМ, U937 и К562 (Smith G.A. et al., 2002). Таким образом, ген KCNRG, расположенный в области делитируемой при многих онкологических заболеваниях, в частности, при раке простаты и В-ХЛЛ, белок которого возможно наделен такой активностью, становится первостепенным кандидатом на роль супрессора опухолевого роста при этих заболеваниях.
![Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae](/i/i/4278/150135.png "Идентификация и характеристика генов, влияющих на поддержание и фенотипическое проявление прионоподобного детерминанта [ISP+], у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Аксенова Анна Юрьевна")
