Содержание к диссертации
Введение
1. Генетический метод как элемент интегрированной защиты растений 8
1.1. Интегрированная защита крестоцветных культур от капустных мух 10
1.1.1. Мониторинг, прогноз и математическое моделирование динамики численности капустных мух 11
1.1.2. Биологический метод защиты крестоцветных культур от капустных мух 15
1.1.3. Применение химических средств защиты против капустных мух 20
1.1.4. Использование сортов, устойчивых к повреждению капустными мухами 21
1.1.5. Агротехнические приемы снижения вредоносности капустных мух 23
1.1.6. Перспективы внедрения генетического метода в систему интегрированной защиты растений от капустных мух 24
1.2. Генетический метод борьбы с двукрылыми насекомыми на современном этапе 25
1.2.1. Опыт генетического метода борьбы с луковой мухой 26
1.2.2. SIT программы борьбы со средиземноморской и другими плодовыми мухами 28
1.2.2.1. Массовое разведение насекомых - основополагающая часть генетическо гометода 29
1.2.2.2. Контроль качества живых культур при массовом разведении 30
1.2.2.3. Линии для получения только мужского потомства 32
1.2.2.4. Фильтр-система разведения средиземноморской плодовой мухи. 34
1.2.2.5. Технологии генной инженерии для совершенствования генетического метода борьбы с плодовыми мухами 36
1.2.3. Генетический метод борьбы с капустными мухами 37
1.2.3.1. Разведение капустных мух на естественном субстрате и питательных средах 37
1.2.3.2. SIT и другие варианты генетического метода 39
1.2.4. Использование хромосомных мутаций в борьбе с двукрылыми насекомыми 41
1.2.4.1. Индукция и выделение транслокаций хромосом у двукрылых насекомых 43
2. Материал и методы исследований 48
3. Индукция и выделение линий с транслокациями хромосом 56
3.1. Анализ наследования частичной стерильности в F1 после облучения 57
3.2. Частота выделения наследственных изменений, приводящих к повышенному уровню ПЭЛ, в F1 после облучения 65
3.3. Линии с наследованием стерильности по типу транслокаций хромосом, в F2 после облучения 69
4. Отбор перспективных линий и выделение гомозигот по аутосомной транслокации 71
4.1. Репродуктивные показатели линий с транслокациями хромосом 71
4.1.1. Плодовитость весенней капустной мухи с аутосомными транслокациями хромосом 71
4.1.2. Эмбриональная гибель 73
4.1.3. Выживаемость постэмбриональных стадий и соотношение полов 75
4.1.4. Половая активность 76
4.2. Освобождение носителей транслокации от дополнительного генетического груза 80
5. Выделение гомозиготной линии Т25 84
5.1. Получение потомства, от скрещивания двух гетерозиготных по транслокации особей, в родительском поколении 84
5.2. Анализ потомства F1 от скрещивания двух гетерозигот по Т25 89
5.2.1. Скрещивания самцов F1 с самками лабораторной популяции 90
5.2.2. Скрещивания самок и самцов F1 92
5.2.3. Окончательное определение генотипов F1 по результатам анализа F2 95
5.3. Окончательное выделение гомозиготной линии 97
6. Оценка и улучшение основных показателей репродуктивного потенциала гомозиготной линии Т25 99
6.1. Основные репродуктивные показатели при разведении с диапаузой и гомодинамно 99
6.2. Преодоление негативных последствий инбридинга 100
7. Получение и оценка межлинейных гибридов, наследующих две транслокации 103
7.1. Двойные гетерозиготы по аутосомным транслокациям 103
- Генетический метод борьбы с двукрылыми насекомыми на современном этапе
- Частота выделения наследственных изменений, приводящих к повышенному уровню ПЭЛ, в F1 после облучения
- Освобождение носителей транслокации от дополнительного генетического груза
- Основные репродуктивные показатели при разведении с диапаузой и гомодинамно
Введение к работе
Система интегрированной защиты крестоцветных от капустных мух базируется на традиционных для сельского хозяйства России методах: агротехнические приемы (Прокофьева, 1980), обработки инсектицидами химической (Розова, 1988, Степанычева, 1988) и биологической природы (Должен-ко, 1986; Данилов, Бородавко, 1997). Перечисленные методы борьбы отличаются локальным действием. Они не затрагивают вредителя, который накапливается в естественных местах обитания. Для весенней капустной мухи это - дикие крестоцветные растения. Популяция вредителя может сильно увеличиваться также на сельскохозяйственных посевах, где не ведется борьба, например, в частном секторе.
Защита растений на современном этапе должна стремиться не к локальному снижению численности вредителя на конкретном поле, а к её долгосрочной регуляции на популяционном уровне (Анисимов, 2003). В зарубежной литературе эта стратегия защиты носит название "area-wide control" (Lindquist, 2000; Klassen, 2000).
Широкомасштабная борьба (борьба на больших территориях) предполагает сочетание новых высоких технологий и традиционных методов: / выпуск стерилизованных самцов (SIT - sterile insect technique); / возделывание устойчивых сортов; s отвлекающие посевы (trap crops); S биологический метод (сохранение и привлечение в агроценозы природных паразитов и хищников, колонизация энтомофагов, разведенных в искусственных условиях); J самцовый вакуум, ингибирование спаривания; V обработки специфическими биологическими и химическими препаратами. Большинство из перечисленных методов разрабатывались применительно к весенней капустной мухе: устойчивые сорта (Асякин и др., 1988; Freuler et al., 1990), SIT (Брадовский, 1980). Их эффективность была различной. В частности классический биометод (колонизация алеохары и триблио-графы) давал весьма ограниченный эффект.
Каждый из элементов "area-wide control" самостоятельно часто не способен долгосрочно удерживать популяцию вредителя на уровне, ниже экономического порога вредоносности. Только в комплексе эти методы и технологии, взаимно дополняя друг друга, дают искомый эффект длительной де-
5 прессии природной популяции вредителя на значительной территории (Lindquist, 2000).
Одним из элементов широкомасштабной борьбы является метод полной стерилизации (SIT). Это - наиболее распространенный вариант генетического метода борьбы, который предполагает снижение репродуктивного потенциала вредителя за счет введения в генофонд его популяции груза индуцированных доминантных летальных мутаций (ДЛМ). Эффективность SIT на капустной мухе была ограничена из-за низкой соматической устойчивости вида к облучению, а также в виду низкого уровня наследуемой стерильности, при использовании более низких доз облучения (Анисимов, 1985, 1997; Белякова, 1996; Белякова, Анисимов, 1998а).
Помимо SIT для капустной мухи отрабатывался вариант генетического метода на основе условно летальных мутаций (Анисимов, Гользберг, 1984; Гользберг, Анисимов, 1985а; Гользберг, 1985; Гользберг, Хайцев, 1985; Ап-isimov, 1988 et.al.; Гользберг, Анисимов, 1988 а, б, в) и транслокаций хромосом (Самойлов, Анисимов, 1984 а,б; Анисимов, Самойлов, 1985; Самойлов, 1985 а, б, в; 1988; Anisimov, Samoilov., 1987; Белякова, Анисимов, 1995; 2000; Белякова, 1996; Анисимов и др., 2001 а, б, 2002; Лепп, Анисимов, 2001).
Реализация транслокационного метода возможна при оптимизации массового разведения линий D. brassicae с транслокациями хромосом, которые для этого необходимо вывести в гомозиготное состояние. Если решить проблему с получением и разведением гомозиготных линий, то использование транслокаций мзжно будет признать перспективным вариантом генетического метода борьбы с капустной мухой.
Транслокации хромосом, которые предполагается использовать в качестве механизма снижения численности вредителя, обладают рядом преимуществ по сравнению с ДЛМ, которые используют в SIT. Во-первых, носители транслокации, которых предлагается выпускать в природные популяции вредителя, сами не подвергаются действию радиации. Они -далекие потомки облученных насекомых. Поэтому, их половая и двигательная активность выше, чем у стерилизованных самцов, которых выпускают при реализации программ SIT. Нормальная половая активность носителей транслокаций хромосом обеспечивает быстрое проникновение мутаций в генофонд природных популяций вредителя.
Во-вторых, хромосомные перестройки, в частности транслокации, в отличие от ДЛМ, наследуются в ряду поколений, сохраняя стерилизующий эффект в далеком потомстве. Долгосрочное действие транслокаций хромосом хорошо вписывается в общую стратегию "area wide control", который предполагает длительное сдерживание численности вредителя на популя-ционном уровне.
Поэтому в дальнейшей работе по созданию генетического метода борьбы с капустной мухой основные усилия должны быть сосредоточены на вопросах, связанных с индукцией и выделением транслокаций, их гомозиго-тизацией и совмещением в одном генотипе для увеличения уровня наследуемой стерильности.
Закономерности, выявленные и доказанные на капустной мухе, можно будет распространять на другие виды двукрылых вредителей с аналогичной организацией хромосомного аппарата. Прежде всего, это родственные для D. brassicae виды. Среди потенциальных кандидатов можно назвать мух-цветочниц: летнюю капустную, луковую, ростковую и других представителей семейства Anthomyyidae, к которому принадлежит наш модельный объект -D. brassicae.
Цель работы - создать биологическую основу эффективный и технологичный вариант генетического метода борьбы с весенней капустной мухой на основе транслокаций хромосом.
Задачи работы:
Расширить коллекцию линий D. brassicae с наследуемой полустерильностью. Выбрать транслокации хромосом перспективные для гомозиготи-зации.
Выделить линию с транслокацией хромосом в гомозиготном состоянии. Оценить основные показатели репродуктивного потенциала у носителей транслокации в гомо- и гетерозиготном состоянии при длительном лабораторном разведении.
На основе гомозиготной линии получить межлинейные гибриды, наследующие две транслокации. Оценить уровень и характер наследования стерильности в потомстве гибридов.
Научная новизна. Впервые у весенней капустной мухи получена хромосомная перестройка в гомозиготном состоянии. Доказана возможность
7 длительного внутрилинейного разведения линии гомозиготной по транслокации хромосом.
Проведена оценка основных показателей репродуктивного потенциала в ряду поколений у носителей гомозиготной транслокации хромосом.
Практическая значимость.
Выделение транслокации Т25 в гомозиготное состояние позволяет осуществлять массовое разведение носителей хромосомной перестройки. Наличие гомозиготной линии Т25 дает возможность получать в режиме массовых скрещиваний межлинейные гибриды, наследующие 2 транслокации и за счет этого имеющие повышенный уровень наследуемой стерильности (более 70%).
Цикл аутбредного разведения, методика которого отработана на примере линии, с транслокацией Т25, позволяет вводить гомозиготную транслокацию в генотип любой другой культуры или популяции D. brassicae, качества которой желательно совместить с наследованием хромосомной перестройки. За счет этого можно приблизить выпускаемых в природу носителей транслокации по основным биологическим показателям к особям дикого типа и облегчить интродукцию хромосомной перестройки в генофонд природной популяции вредителя.
8 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Генетический метод борьбы с двукрылыми насекомыми на современном этапе
По данным объединенного сельскохозяйственного отдела ФАО/МАГАТЭ на сегодняшний день число видов вредных насекомых из отряда Diptera, на которых применяется генетический метод искоренения или контроля численности, приближается к 70 (Insect and Pest Control Newsletter, 2001). Прежде всего это ряд видов плодовых мух, дынная, луковая и некоторых другие мухи, имеющие сельскохозяйственное значение (LaChance, Klassen, 1991; Holler, Horris 1993; Loosjes, 2000), а также двукрылых насекомых ветеринарного и медицинского значения: муха це-це, комары рода Anopheles, мясные мухи и др. (Snow, 1988; LaChance, Klassen, 1991; Holler, Horris, 1993;Mclnnisetal., 1994). Подробно описать опыт разработки и реализации генетического метода борьбы для всех видов в рамках данного обзора не представляется возможным. Поэтому мы, в основном, ограничились несколькими видами вредных насекомых сельскохозяйственного значения, а именно, непосредственно капустными мухами, близкой к ним - луковой и средиземноморской плодовой, для которой генетический метод развит, пожалуй, наиболее широко и глубоко. 1.2.1. Опыт генетического метода борьбы с луковой мухой Луковая муха - серьезный вредитель луковых культур в регионах с умеренным климатом. В Нидерландах луковые культуры выращиваются отдельными производителями на полях 2-6 га каждое. Луковые поля, обычно, расположены среди полей, занятых другими культурами, и составляют приблизительно 5-10% посевных площадей в хозяйстве. Луковая муха была выбрана в 1965 г в качестве "мишени" для генетической борьбы в Нидерландах. Предпочтение отдавалось выпуску стерильных насекомых (SIT). Выпуски полностью стерильных насекомых на небольших площадях (1 га) были успешными (Loosjes, 2000). С 1981 г. SIT была применена для борьбы с луковой мухой в Нидерландах частной компанией Groene Vlieg при финансовой поддержке правительства. Было налажено непрерывное массовое разведение луковой мухи. Мух регулярно собирали на полях и разводили в 4-10 поколениях, затем их стерилизовали гамма облучением на стадии куколки, незадолго до появления имаго. При появлении мух маркировали флуорисцирующим порошком. Мух сохраняли в течение короткого периода при +3С и затем загружали в двухслойные марлевые контейнеры по весу (до 40000 стерилизованных особей в каждом). Затем контейнеры перевозили автомобилем и устанавливали по границам поля. Для наблюдения за выпущенными насекомыми устанавливали по три ловушки на каждое поле. Результаты по обследованию ловушек использовали для регулирования объемов последующих выпусков. Выпуски проводили еженедельно. Ежегодно производили более 400 млн. пупариев которых затем использовали на площади около 100 га (16% от общего количества площадей, занимаемых под лук в Нидерландах).
Программа работала около 10 лет. В течение этого периода большую часть расходов взяло на себя государство, и стоимость SIT для фермеров была даже ниже, чем использование пестицидов (Loosjes, 2000). Однако эта программа столкнулась с рядом трудностей. Принцип SIT - 100% участие фермеров не был соблюден (фактически в программе приняли участие только около 60% производителей лука). Основная причина - недоверие фермеров к SIT. Большинство фермеров привыкли к легкому применению и видимому эффекту химической борьбы. Они больше доверяют инсектицидам, которые применяют самостоятельно. Разница в цене {для фермеров, участвующих в программе SIT ее стоимость была ниже химической защиты) вместо того чтобы привлечь, наоборот отпугнула производителей. Они не могли понять, как более дешевая технология может дать им требуемый уровень контроля? Примечательно, что число клиентов увеличилось, когда цены были подняты до уровня затрат на химическую обработку. Недоверие усугублялось тем, что при высоких уровнях численности популяции вредителя SIT менее эффективна, чем химический метод. С увеличением плотности популяции вредителя число выпускаемых насекомых также должно возрастать, а, следовательно, и затраты тоже. Необходимость еженедельно проводить точные учеты численности, также мало привлекательна для производителя. Химическая обработка не зависит от размера популяции \л не требует дополнительных перерасчетов норм выпусков. Эта зависимость SIT от плотности популяции делает трудным соревнование с химическим методом, пока уровни численности луковой мухи высокие. В результате, иногда численность стерильных насекомых, выпускаемых на поля, была ниже необходимой и, как итог, наблюдался рост численности популяции вредителя. Таким образом, поля, где стерильных мух было недостаточно или вовсе не было, дали отрицательный эффект, что сказалось на выполнении программы в целом. Когда же численность вредителя снижена, SIT становится эффективнее обработок инсектицидами. Значительное сокращение численности популяций вредителя было достигнуто в регионах, где большая часть производителей была задействована в программе, и SIT использовали более 10 лет (Loosjes, 2000). 1.2.2. SIT программы борьбы со средиземноморской и другими плодовыми мухами Гораздо большие успехи, как по масштабам практического применения, так и по глубине и широте используемых приемов, достигнуты в отношении генетического метода борьбы с плодовыми мухами и, прежде всего, со средиземноморской плодовой мухой Ceratitis capitata (Wied). Средиземноморская плодовая муха является наиболее широко распространенным и, кроме того, для большинства регионов земного шара, карантинным вредителем свежих плодов. В связи с этим, SIT программы (выпуск стерильных насекомых) все больше используются как эффективный подход для искоренения этого вида (Steiner et al., 1962, Fisher et al., 1985). Успехи в устранении начинающихся эпизоотии этого вида были сообщены еще Вонгом с соавторами (Wong et al., 1986). С помощью методов полной и частичной стерилизации средиземноморская плодовая муха уже полностью искоренена на Северо-Американском континенте; достигнуты значительные успехи в борьбе с другими плодовыми мухами: карибской, дынной, мексиканской и др. (LaChance, Klassen, 1991; Holler, Horris 1993; Yamagishii , Kakino-hana , 2000). Для дальнейшей разработки подобных программ ведутся исследования в следующих направлениях: совершенствование методик массового разведения, сортировка по полу при разведении, в том числе с привлечением генной инженерии, использование температурочувствительных мутаций, испытание полученных линий в полевых условиях, удешевление производства стерильных насекомых. Одна из причин высокой стоимости SIT программ - то, что требуется выпускать большое количество насекомых из-за уменьшенной конкурентоспособности облученных насекомых. Следовательно, надо рассмотреть, действительно ли необходим высокий уровень стерильности, если можно выпускать частично стерильных самцов, при использовании GSS (Genetic Sexing Strains - линии, для получения только муж- ского потомства). Кроме того, не все программы нацелены на уничтожение дикой популяции.
В программах борьбы полная стерильность не является необходимым условием, а дикая популяция должна только подавляться ниже определенного порога. Этот уровень должен поддерживаться непрерывными выпусками (Franz, 2000). Облучение негативно влияет на качество выпускаемых насекомых (Steffens, 1983). Например, было показано, что увеличение дозы от 50 Gy к 110 Gy не обеспечивало большую стерильность в популяции средиземноморской плодовой мухи при конкуренции с необлученными самцами. Авторы заключили, что повышение стерильности, вызванное радиацией, аннулировано уменьшенной конкурентоспособностью. Радиационная доза, необходимая для стерилизации самцов может быть снижена, если самцы несут транслокацию Y хромосомы и аутосомную. В результате самцы уже частично наследуют стерильность, и это дает возможность снизить дозу облучения. Сокращение дозы было бы весьма желательно, так как это повысит качество выпускаемых насекомых (Steffens, 1982; 1983). 1.2.2.1. Массовое разведение насекомых - основополагающая часть генетического метода Наличие технологии массового производства насекомых является необходимым условием для создания генетического метода борьбы применительно к тому или иному виду вредителя. Особей вредителя, несущих мутации, предполагается в массе выпускать в природную среду, предварительно размножив их в инсектариях и на биофабриках. Успехи генетического метода борьбы с плодовыми мухами, во многом, связаны с разработкой дешевой и эффективной технологии их массового разведения. Так, технология разведения и контроля качества средиземноморской плодовой мухи включает следующие элементы: Имаго содержат в садках, для производства яиц, объемом 0,9 м3 по, приблизительно, 75500 самок в каждом. Самки дают в среднем 12 + 3 яйца в день в течение 10 дней. Имаго внутри садков питаются смесью: 1 часть гидролизованного белка на 3 части сахарного тростника. Личиночная диета: сахарный тростник (27%), кукурузная мука (3%), мука из цельного зерна (2%), пшеничные зародыши (2%), смесь витаминов (0,1%), бензоат натрия (0,3%), кислота аскорбиновая (1,19%) и вода. В подносы загружают по 4 -5 кг питательной среды и вносят в среднем по 14 жизнеспособных яиц на миллиграмм субстрата. 12.2.2. Контроль качества живых культур при массовом разведении При массовом разведении главная задача - получение качественного живого материала.
Частота выделения наследственных изменений, приводящих к повышенному уровню ПЭЛ, в F1 после облучения
На весенней капустной мухе ранее были определены частоты выхода полустерильных особей в F1 после облучения в широком диапазоне доз (Белякова, Анисимов, 2000). Сравнивая наши результаты с полученными ранее данными, следует отметить некоторые отклонения в области малых доз. В частности, для дозы 2,5 Gy отмечен более высокий выход полустерильных самцов F1 (табл. 6). В результате частоты перестроек у самцов для доз 2,5 и 5 Gy совпадают, хотя теоретически у этого показателя следовало ожидать дозовой зависимости. Колебания частот, отмеченные при сравнительном анализе результатов, не позволяют определить характер зависимости выхода хромосомных перестроек от дозы. По нашим данным, для самцов F1 она близка к линейной (рис. 5). Например, можно выделить семьи F1, в которых выделено 3-4 полустерильных потомков F1 из 5 тестированных (табл. 11). Если частота выделения перестроек в разных семьях примерно одинакова и соответствует средней величине в опыте (для дозы 2,5 Gy - 11,8%), то вероятность появления такого потомства (4 полустерильных из 5 тестированных) составляет менее 1%. Следовательно, есть отдельные облученные самцы, в гаметах которых ре-ципрокные симметричные перестройки формируются чаще, чем у других облученных особей. Вероятно, стадия сперматогенеза и состояние наследственного материала у данных особей в момент облучения максимально благоприятствует возникновению аберраций именно этого типа11 (транслокаций, инверсий). Однако идентифицировать, какому возрасту у весенней капустной мухи соответствует данная стадия сперматогенеза, пока не удается. Семьи F1 со значительной долей полустерильных потомков были получены от самцов, облученных на разных стадии зрелой куколки (табл. 11). В период, предшествующий выходу имаго из пупария, у молодых самцов присутствуют половые клетки на разных ста- Гибридологический анализ наследования повышенного уровня ПЭЛ в F2 затруднен из-за ограниченного объема потомства, которое удается получить от полустерильных особей F1. Всего от 1І4 особей F1, которые могли быть носителями транслокаций, половозрелое потомство удалось получить только в 32 семьях F2. Наследование полустерильности зафиксировано в 25 семьях F2, от которых были заложены линии с хромосомными мутациями. Большая часть линий заложена от самцов F1 (85%). Это естественно, так как самца можно спаривать с несколькими самками и тем самым увеличивать объем потомства F2, что соответственно увеличивает вероятность успешного выделения мутаций.
Увеличить объем потомства полустерильных самок F1 возможно лишь путем искусственного повышения их плодовитости за счет определенных пищевых добавок (пивные дрожжи и др.). Однако при использовании этого приема есть риск потерять все потомство13. Очевидно, что второе поколение является этапом, на котором мы теряем значительную долю индуцированных перестроек, особенно в потомстве полустерильных самок F1. Чисто методические трудности являются препятствием для детального анализа наследования полустерильности в F2 после облучения. Пока не представляется возможным преодолеть «узкое горлышко» второго поколения, поэтому вопрос о выделении у весенней капустной мухи транслокаций, сцепленных с женским полом, остается открытым. Нам не удалось получить такие линии. Нельзя сделать достоверный вывод об их отсутствии. Скорее всего, т-сцепленные транслокации были потеряны в F2. Уровень поздней эмбриональной гибели является основным показателем, характеризующим линию с транслокацией. Был проведен сравнительный анализ частот ПЭЛ в F2 для некоторых линий; от которых удалось получить достаточное количество потомства (табл. 12). днях сперматогенеза (Hertveldt et al., 1980). Выделить среди них ту стадию, которая является восприимчивой к индукции хромосомных перестроек, методически не представляется возможным для такого объекта, как капустная муха. Подводя итоги анализа F1, следует особо отметить колебания частот выхода перестроек, которые были отмечены нами при индукции малыми дозами. Механизм этого явления сложен и слагается, по-видимому, из двух составляющих: 1) взаимодействие зависимых от дозы процессов фрагментации хромосом и репарации разрывов; 2) возрастная гетерогенность облучаемых гамет у весенней капустной мухи. В связи с этим возникает чисто методический вопрос, какая доза оптимальна для выделения транслокаций у D. brassicae? При высокой полустрерилизующей дозе мы имеем достаточно стабильную и высокую (23-25%) частоту выхода перестроек. Кроме того, при индукции высокими дозами существует корреляция между уровнем эмбриональной гибели у облученных отцов и их потомков. Следовательно, можно упростить методику выделения транслокаций12. С другой стороны, низкие дозы индукции позволяют получать транслокации, пригодные для выведения в гомозиготное состояние, так как доля точечных летальных мутаций, сцепленных с перестройкой, снижается вместе с дозой. Однако частота выхода транслокаций у самцов F1 в этом случае снижается до 10-12%, а у самок F1 до 4-5%. Кроме того, частоты значительно варьируют, поэтому для гарантированного выделения перестроек необходимо расширять объем анализа в F1. У каждого диапазона доз есть свои преимущества и недостатки. С нашей точки зрения, высокие дозы можно использовать для получения сцепленных с полом транслокаций, которые не подлежат гомозиготизации. А малые дозы применять для выделения аутосомных линий. Всего в результате первичного выделения в потомстве F1 было отобрано 114 особей, которые по уровню ПЭЛ могли быть носителями транслокаций. Транслокации хромосом, которые нам удалось выделить в потомстве облученных самцов весенней капустной мухи, делятся на 2 типа: аутосомные и наследуемые только самцами, т.е. сцепленные с мужским полом. Влияние сцепленных с мужским полом траьслокаций на потенциал размножения D. brassicae уже не однократно исследовалось ранее (Анисимов, Самойлов, 1985; Самойлов, 1988; Белякова, Анисимов, 1995). Поэтому мы сосредоточились на изучении аутосом-ных .транслокаций, которые наследуются насекомыми обоих полов. В качестве объектов были выбраны наиболее легко поддерживаемые в культуре линии (325, (379 и (353. 4.1.1. Плодовитость весенней капустной мухи с аутосомными транслокаииями хромосом Весенняя капустная муха обладает весьма значительным репродуктивным потенциалом, благодаря чему коэффициент размножения природных популяций D.brassicae может достигать 20-35, то есть численность вредителя за одно поколение может увеличиваться в 20-35 раз (Гусева, 1987). Основой столь мощного потенциала размножения является плодовитость капустных мух. Этот показатель подвержен значительным колебаниям и, по литературным данным, составляет от 50 до 120 яиц на самку (Swailes, 1961; Hertveldt et al., 1980; Гусева, Вол, 1995). В лабораторной популяции весенней капустной мухи, которая служила контрольным материалом в наших исследованиях, средняя плодовитость мух составляет около 70 яиц на самку (табл. 13). Анализируя данный показатель у му-тантных насекомых мы рассматривали 3 варианта: 1) плодовитость нормальных самок, которые спаривались с самцами, наследующими транслокацию в гетерозиготном состоянии (самка АА х самец AT); 2) плодовитость гетерозиготной по транслокации самки после спаривания с нормальным самцом (самка AT х самец АА); 3) плодовитость самки AT при скрещивании с самцом AT.
Освобождение носителей транслокации от дополнительного генетического груза
Транслокация Т25 индуцирована сравнительно низкой дозой радиации и выделена в первом поколении после облучения самцов у самца F1. Кроме транслокации Х-лучи могли индуцировать любые иные наследственные нарушения в других участках генома (рецессивные и доминантные точковые мутации, делеции, дупликации, инверсии и др.), снижающие жизнеспособность носителя в гомозиготном и даже в гетерозиготном состоянии. Поэтому прежде чем приступить к выделению линии с аутосомной транслокацией в гомозиготном состоянии, желательно было освободить вовлеченные в перестройку хромосомы от дополнительного генетического груза индуцированных мутаций. После индукции транслокации линию.(325 поддерживали в гетерозиготном состоянии. Было проведено 14 последовательных поколений индивидуального и посемейного разведения. В каждом поколении линейных насекомых скрещивали исключительно с интактными особями противоположного пола, которых отбирали из лабораторной популяции дикого типа, никогда не подвергавшейся воздействию мутагенами (возможно, кроме пестицидов, до момента сбора исходного материала в поле). Такая схема разведения преследовала 2 цели. Во-первых, увеличить объем разведения и снизить уровень инбридинга в линии (525. Во-вторых, заменить у носителей транслокации участки генома, подвергшиеся облучению, на генетический материал интактных насекомых. В генотипе самца-основателя линии (самца F1) половина хромосом диплоидного набора была подвергнута облучению. В ходе аутбредного разведения линии Т25 за счет механизма независимой перекомбинации негомологичных хромосом в мейозе происходило постепенное замещение хромосом, подвергшихся облучению, на соответствующие гомологичные хромосомы, не подвергавшиеся воздействию (за исключением двух хромосом, связанных с транслокацией). Через 14 поколений аутбридинга в генотипе носителей транслокации останется только 2 «облученных» хромосомы, которые невозможно заменить целиком, так как они вовлечены в перестройку. Освободить линию (325 от нежелательных мутаций, наследующихся сцеплено с транслокацией (т.е. локализованных в траслоцированных хромосомах), несколько сложнее, но возможно за счет кроссинговера между гомологичными хромосомами. Регулярный кроссинговер у короткоусых двукрылых свойственен только самкам14 (Морган, 1924, Hiraizumi, 1971; Gethmann, 1988). Поэтому для удаления нежелательных мутаций из траслоцированных хромосом использовали самок линии Т25. В 14-м поколении разведения из линии Т25 отобрали 90 самок и скре- Схема выделения гомозиготной линии, использованная нами на капустной мухе, опирается на гибридологический анализ наследования полустерильности при скрещивании гетерозиготных носителей транслокации. Она предусматривает только индивидуальные скрещивания. Ее оригинальность заключается в том, что выделение гомозигот не требует наличия дополнительных фенотипических маркеров или проведения цитогенетического анализа.
Исходная схема гомозиготизации включала 4 последовательных поколения внутрилинейных скрещиваний с предварительным тестированием самцов (см. Материал и методы): 1) в исходном (родительском) поколении необходимо получить потомство от двух гетерозигот по транслокации (скрещивания типа $АТ х с?АТ); 2) в первом поколении от гетерозиготных родителей необходимо отделить гомозиготных по транслокации (ТТ) и нормальных (АА) самцов от гетерозигот (AT) и скрестить их с такими же самками F1 (ТТ и АА); 3) во втором поколении необходимо отделить гетерозиготные семьи (в F1 скрещивания 9"ГТ х с?АА и $АА х cfTT) от гомозиготных по транслокации (в F1 скрещивания ТТ х сЛТ) и нормальных (в F1 скрещивания $АА х с АА) семьи, по возможности разделить два последних варианта, или заложить скрещивания для проверки гомозиготных по транслокации семей и их отделения от нормальных в F3; 4) в третьем поколении необходимо окончательно выявить гомозиготные по транслокации семьи и заложить чистую линию. 5.1. Получение потомства, от скрещивания двух гетерозиготных по транслскации особей, в родительском поколении С целью получения потомства, от скрещивания двух гетерозиготных особей, было проведено две. повторное опытов в двух последовательных поколениях. Их результаты представлены в таблицах 20, 21 и приложениях 1 и 2. Как по частоте ПЭЛ (табл. 20), так и по соотношению нормальных и мутантных особей (Приложение 1), существенных различий между повторностями обнаружено не было, что позволяет рассматривать их результаты совместно. Всего, путем первого скрещивания с нормальными самками лабораторной популяции из 295-х поставленных на спаривание удалось протестировать 252 самца, из гетерозиготной по Т25 линий. Из остальных 42-х поставленных пар 30 не дали яйцекладок, а 12 дали полностью стерильные яйцекладки (100% РЛ). Среди протестированных самцов, 137 (см. Приложение 1) можно было сразу отнести к носителям транслокации в гетерозиготном состоянии {SS AT). Уровень ПЭЛ в их потомстве достоверно отличался от контрольного (3,2±0,13%) и достоверно не отличался от уровня ПЭЛ, характерного для гетерозиготных по Т25 насекомых (51,5±0,61%). В потомстве 110 самцов из гетерозиготной линии (325 уровень ПЭЛ, хотя и был в некоторых случаях повышен, но достоверно не отличался от контроля. 108 из них можно было сразу отнести к классу выщепляющихся потомков, не несущих транслокации (J c? АА), т.к. уровень ПЭЛ у них был значительно и высоко достоверно (р 0,001) ниже, чем в потомстве гетерозигот по транслокации. По потомству двух самцов (№№ 119 и 218, Приложение 1) однозначного заключения было сделать нельзя. Из-за больших ошибок процентов, достоверного отличия от уровня ПЭЛ, характерного для транслокации, так же как и от контроля, у них выявить не удалось. Мы пытались проверить генотипы их потомков в F1, но безуспешно, и эти два самца были исключены из дальнейших расчетов и анализа. Еще в 6 случаях классификация самцов была затруднена из-за достоверно более высокого уровня ПЭЛ, чем в контроле, но также достоверно более низкого уровня ПЭЛ, чем у гетерозигот по транслокации Т25. Это может быть следствием не только ограниченности объема проанализированных яиц в кладке (это учитывается в ошибке процента), но и изменчивости гетерозиготных самцов по доле производимых несбалансированных гамет, нормальных самок и самцов, по спонтанному уровню ПЭЛ, а также наличия каких-то других мутаций, вызывающих небольшое повышение уровня ПЭЛ, у нормальных особей. Эти самцы (№№ 26, 35, 48, 86, 103 и 275, см. Приложение 1) были окончательно классифицированы по результатам повторных скрещиваний, или анализа их потомков F1. Два их них несли транслокацию (SS AT), три - были нормальными {SS АА), а один наследовал иную мутацию, детерминирующую приблизительно 25% ПЭЛ. В отношении Т25 его следует считать нормальным (S АА). Таким образом, при тестировании самцов родительского поколения нам удалось оценить генотипы 251 самца.
Из них 139 (55,4%) были гетерозиготными по транслокации ( $S AT), а 112 (44,6%) не несли мутации ( $ 3 АА). Теоретически, соотношение гетерозиготных и нормальных самцов должно быть 1 : 1, и достоверного отличия от него нам выявить не удалось (вероятность сходства - 0,087). Однако наблюдаемая тенденция к преобладанию мутантных самцов над нормальными в потомстве гетерозиготных по Т25 насекомых свидетельствует о том, что эта мутация в гетерозиготном состоянии не снижает жизнеспособность носителей, а может быть и увеличивает ее. Такой своеобразный гетерозисный эффект для некоторых мутаций описан (Анисимов, Дементьева, 1981; Дементьева, 1985; Anisimov, 1988). С точки зрения генетического метода борьбы, такое свойство Т25 является весьма привлекательным, способным существенно повысить его эффективность. С методической точки зрения результаты описанных выше экспериментов показывают, что частота ПЭЛ является достаточно результативным и надежным критерием разделения гетерозиготных по мутациям типа Т25 самцов от их братьев, не несущих мутацию, и может быть использована для гибридологического анализа. С его помощью у весенней капустной мухи удается классифицировать генотипы 99,2% фертильных самцов, оставляющих потомство (85,1% от общего количества), причем 96,8% (83,1% от общего количества) уже после первого спаривания. Разделение мутантных и нормальных самцов также достаточно надежно. Самцы из линии (325, по частоте ПЭЛ, распадаются на две четкие группы. Как видно из рисунка их распределение по частоте ПЭЛ дает два четких пика. Одна соответствует контрольному распределению и практически не перекрывается с другой, соответствующей классу гетерозигот (рис. 8).
Основные репродуктивные показатели при разведении с диапаузой и гомодинамно
В первых 2-х поколениях после выделения транслокации Т25 в гомозиготное состояние была проведена оценка линии по уровню эмбриональной гибели. Тестирование показало, что по частотам РЛ и ПЭЛ гомозиготные особи не сильно отличаются от насекомых лабораторной популяции (табл. 25). Выживаемость личинок и куколок, а также соотношение полов в линий не отличались от контроля, которым служила лабораторная популяция (табл. 26). Особый интерес представляют данные о выживаемости линейных насекомых при выходе из диапаузы, которая была индуцирована у гомозиготных особей в апре- ле и продолжалась до октября. По сравнению с популяционным уровнем в линии было отмечено некоторое снижение выживаемости куколок (диапаузирующая ста-дия у капустной мухи), однако в целом результаты можно считать удовлетворительными. Повышенная смертность на стадии диапаузируюицей куколки была отмечена при разведении не только гомозигот Т25, но и в контроле {табл. 26). Очевидно, что повышенная смертность при хранении диапаузирующих куколок свойственна не только гомозиготной линии Т25, а всем лабораторным культурам весенней капустной мухи. Данное негативное явление обусловлено особенностями индукции диапаузы, хранения и реактивации покоящихся куколок в лабораторных условиях. В целом гомозиготная линия Т25 в течение первых 3-х поколений внутрили-нейного разведения (F3-F5) не отличалась от лабораторной популяции по основным показателям репродуктивного потенциала. Кроме того, она пригодна для развития с диапаузой, что является необходимым условием технологии разведения весенней капустной мухи. 6.2. Преодоление негативных последствий инбридинга В F7 линии Т25 было отмечено снижение плодовитости самок (15±3,9) и выживаемости личинок (25,7±5,6%). Кроме того, возросла доля нерезультативных скрещиваний (без яйцекладок) до 42%. В итоге к восьмому поколению объем разведения линии Т25 сократился до опасных пределов. Удалось получить жизнеспособное потомство от 3-х пар. Возникла реальная угроза потери линии. Причиной сложившейся ситуации, скорее всего, являлся инбредный характер разведения гомозиготной линии. Хотя исходно в F3 гомозиготная линия была заложена от 7-ми пар, но данные насекомые находились в родстве друг с другом. На начальном этапе гомозиготизации они имели общего предка1. Видимо, достаточно высокая степень родства между гомозиготными особями была причиной инбредной депрессии, в которую вошла линия Т25 через 7 поколений после выделения в гомозиготу.
Для преодоления негативных последствий инбридинга были проведены скрещивания линейных самцов с самками лабораторной популяции. Схема обновления гомозиготной линии состояла из скрещиваний в 3-х последовательных поколениях (рис. 11). Цикл аутбридйнга проходит в основном в режиме массового разведения. Только на заключительном этапе необходим индивидуальный анализ потомства (F10 на рис. 11). Проведение массовых скрещиваний не требует значительных усилий. Поэтому в будущем цикл аутбредного разведения можно включить в технологию производства гомозиготных линий как один из возможных её элементов. Данный прием можно использовать не только в экстренных ситуациях, когда из-за снижения репродукции возникает угроза потерять линию. Цикл аутбридйнга по-зволяет вводить гомозиготную транслокацию в генотип любой другой культуры или популяции D.brassicae, качества которой желательно совместить с наследованием хромосомной перестройки. Если природная популяция весенней капустной мухи, с которой предполагается вести борьбу генетическим методом, имеет ряд отличий от лабораторной культуры (например, по полетной активности, плодовитости, адаптации к условиям обитания в конкретном регионе и др.), то имеет смысл провести в линии цикл аутбридйнга с участием местных природных самок. За счет этого можно приблизить выпускаемых в природу носителей транслокации по основным биологическим показателям к особям дикого типа, облегчить интродукцию и сохранение хромосомной перестройки в генофонде природной популяции вредителя. 7. Получение и оценка межлинейных гибридов, наследующих две транслокации. Эффективность генетического метода на основе транслокаций зависит от уровня стерильности и половой активности носителей перестройки, которые предназначены для выпуска в агроценозы. Необходимо максимально повысить наследуемую стерильность, сохраняя при этом половую активность мутантных насекомых. Для повышения стерильности используют 2 метода: дополнительное облучение носителей одной перестройки или совмещение двух и более транслокаций в одном генотипе (Серебровский, 1971; Steffens, 1985). При выборе оптимального для весенней капустной мухи метода необходимо учитывать, что у этого вида при облучении даже в малых дозах (5 Gy) в гаметах облученных самцов возникают со значительной частотой мутации, которые вызывают нарушения половой активности самцов F1. Это один из негативных эффектов при реализации метода частичной стерилизации на весенней капустной мухе (Белякова, 1996). Поэтому для данного объекта совмещение двух транслокаций предпочтительнее, чем дополнительное облучение носителей одной перестройки (Анисимов, 1997). Использование ДЕОЙНЫХ гетерозигот предполагает выпуск насекомых, которые сами не подвергались облучению, поэтому их половая активность остается в норме. Об этом свидетельствуют данные о высокой конкурентоспособности межлинейных гибридов весенней капустной мухи, полученных от скрещивания носителей аутосомной и сцепленной с мужским полом (М) транслокаций (Белякова, Анисимов, 1995).. 7.1. Двойные гетерозиготы по аутосомным транслокациям Ранее у весенней капустной мухи в одном генотипе, совмещали только М-сцепленную и аутосомную транслокации. Это ограничение было обусловлено чисто методическими трудностями, которые можно легко преодолеть, если использовать для межлинейных скрещиваний гомозиготных самок. Наличие гомозиготной линии Т25 позволило нам впервые провести совмещение двух аутосомных транслокаций. Для этого дополнительно была выбрана линия 13 15, в которой гетерозиготная транслокация наследовалась по аутомосно-му типу. Уровень ПЭЛ у носителей Т15 составляет 53,9+3,9%.
После гибридизации уровень ПЭЛ у двойных гетерозигот колебался от 62,9% до 93,3%. У некоторых носителей (табл. 28, жирный шрифт) двух транслокаций отмечены достоверные отклонения от теоретически ожидаемого уровня ПЭЛ (75%), и ожидаемого для этих конкретных транслокаций (77,7%), причем в разные стороны. При совмещении транслокаций Т25 (51,6%) и Т15 (53,9%) ожидаемая частота ПЭЛ у двойных гетерозигот - 77,7%. Фактически уровень ПЭЛ в потомстве от скрещиваний гомозиготных по Т25 самок с гетерозиготными по Т15 самцами со- ставил в среднем 72,8% (табл. 28), что несколько ниже ожидаемых значений, однако достаточно, для регуляции репродуктивного потенциала природных популяций весенней капустной мухи на уровне, ниже экономического порога вредоносности (Клишина, 1983). Отклонения от теории были отмечены при анализе расщепления в потомстве F1 от скрещиваний гомозиготных самок Т25 с самцами, гетерозиготными по ауто-сомным перестройкам. Доля двойных гетерозигот в F1 должна составлять 50% среди самцов и среди самок. Реально было отмечено существенное преобладание гибридов F1 с двумя транслокациями, о чем свидетельствовал высокий уро-вень ПЭЛ (более 65%) в их потомстве F2 от скрещивания с нормальными самками. В результате преобладания в F1 двойных гетерозигот над одинарными гете-роозиготами по Т25, общий уровень ПЭЛ при их скрещивании с нормой повысился до 68,3±1,48%, при теоретически ожидаемом 62,5%, или 64,6 % для данных двух транслокаций. Это свидетельствует о том, что объединение двух транслокаций, в гетерозиготном состоянии, не только не снижает, а возможно и повышает жизнеспособность их носителей. С позиций генетического метода это следует рассматривать как положительный эффект, так как он может приводит к повышению уровня наследуемой стерильности в природных популяциях вредителя.
