Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Разнообразие генофонда человечества и проблемы геногеографии и этногенетки 13
1.2. Краткая история этногенетических исследований населения Сибири... 16
1.3. Системы генетических маркеров 25
1.4. Y-хромосомаи ее применение в популяционной генетике 31
1.4.1. Строение и функции Y-хромосомы 31
1.4.2. Свойства Y-хромосомы как инстумента для эволюционных и популяционных исследований 34
1.4.3. Классификация гаплогрупп Y-хромосомы 36
1.5. Заселение человеком территории Сибири 39
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
2.1. Материал исследования 49
2.2. Маркеры использованные для характеристики генетического разнообразия 55
2.3. Выделение ДНК 56
2.4. Генотипирование диаллельных маркеров 60
2.5. Генотипирование микросателлитных маркеров 70
2.6.Статистический анализ 73
2.7.Используемые компьютерные программы 75
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 76
3.1. Распределение гаплогрупп Y-хромосомы у исследованных этносов ... 76
3.2. Генетические взаимоотношения между популяциями 80
3.3. Генетические взаимоотношения между гаплогруппами 86
3.4. Оценка генетического разнообразия 90
3.5. Генетическая дифференциация этносов 94
3.6. Разнообразие и филогения микросателлитных гаплотипов внутри гаплорупп 97
3.7. Оценка возраста гаплогрупп 117
3.8. Оценка времени дивергенции популяций 122
3.9. Древние миграции и формирование генофонда населения Сибири 124
Заключение 138
Выводы 143
Литература
- Разнообразие генофонда человечества и проблемы геногеографии и этногенетки
- Y-хромосомаи ее применение в популяционной генетике
- Маркеры использованные для характеристики генетического разнообразия
- Распределение гаплогрупп Y-хромосомы у исследованных этносов
Введение к работе
Изучение генетического разнообразия популяций человека имеет важное значение для понимания процессов антропогенеза, формирования попу-ляционного генофонда, расогенеза, расселения человека по земному шару, механизмов адаптации популяций к различным условиям обитания, устойчивости или восприимчивости к тем или иным заболеваниям и разработки методов ДНК-идентификации личности (Underbill et al., 1997; Jorde et al., 1998; Zhivotovsky et al., 2003; Jorde, Wooding, 2004; Tishkoff, Kidd, 2004; Jobling, Gill, 2004). Множество полиморфных ДНК-маркеров, выявленное при расшифровке генома человека, является мощным инструментом для такого анализа (The international SNP..., 2001; International Human Genome..., 2001).
Одним из основных подходов к изучению структуры генофондов современных популяций и генетической истории их формирования является анализ гаплогрупп Y-хромосомы, составляемых на основании генотипирова-ния набора ДНК-маркеров ее нерекомбинирующей части. Географические градиенты частот различных гаплогрупп в генофондах популяций отражают различающиеся по времени и направлению миграции людей, имевшие место в прошлом (Underhill et al., 2001).
По причине гаплоидности Y-хромосома в большей своей части не ре-комбинирует в ходе мейоза и передается как целое от отца к сыну. Поэтому каждый конкретный набор маркерных локусов, составляющих нерекомбини-рующую часть Y-хромосомы, рассматривается как единый гаплотип. Благодаря отсутствию рекомбинации в основном сегменте и небольшой эффективной численности, по сравнению с аутосомами и молекулами митохондриаль-ной ДНК, Y-хромосома в большей степени подвержена эффектам генетического дрейфа и характеризуется большей степенью межпопуляционной вариабельности (Jobling, Tyler-Smith, 2003). Это приводит к высокому уровню географической дифференциации, которая может быть использована для исследования миграционных событий в истории тех или иных этносов. В попу ляциях человека, принадлежащих традиционным обществам, как правило, мужчины чаще остаются в местах своего рождения, чем женщины (патрило-кальность), что проявляется в низком (по сравнению с мтДНК) внутрипопу-ляционном разнообразии и значительной дифференциации между группами популяций по маркерным системам нерекомбинирующей часть Y-хромосомы (Hammer et al., 2001; Karafet et al., 2002; Kayser et al., 2003). Кроме того, одним из несомненных преимуществ Y-хромосомы, как инструмента для эволюционных и популяционных исследований, является большое число разнообразных ДНК-маркеров, имеющих разные темпы мутирования, которые позволяют проводить анализ мужских линий на различных уровнях разрешения (Underhill et al., 2000; Kayser et al., 2004).
В настоящее время актуальным представляется детальное изучение генетической структуры различных этнических и региональных групп населения, с целью выявления ее специфичных особенностей, используя маркеры Y-хромосомы различной природы. За последние годы произошло резкое увеличение количества данных, полученных при анализе нерекомбинантной части Y-хромосомы (Shields et al., 1993; Lell et al., 1997; Bianchi et al., 1998; Santos et al., 1999; Kayser et al., 2001; Karafet et al., 2001; Underhill et al., 2000; Ne-bel et al., 2001 и др.). Это связано, в первую очередь, с обнаружением значительного числа ДНК-маркеров, что позволило интенсифицировать такие работы. Проводятся исследования региональных генофондов населения Европы (Rosser et al., 2000; Semino et al., 2000; Nasidze et al., 2003; Cinnuoglu et al., 2004 и др.), Африки (Bosch et al., 2001; Cruciani et al., 2002; Semino et al., 2002; Coia et al., 2004; Luis et al., 2004 и др.), Ближнего Востока (Nebel et al., 2000; 2001), Средней Азии (Quintana-Murci et al., 2001; Zerjal et al., 2002; Qamar et al., 2002 и др.), Юго-Восточной Азии (Su et al., 1999; Karafet et al., 2001 и др.), Океании (Capelli et al., 2001; Kayser et al., 2000; 2001a; 2003 и др.), Америки (Mesa et al., 2000; Tarazona-Santos et al., 2001; Bortolini et al., 2003).
В тоже время относительно мало работ посвящено проблеме формирования разнообразия генофонда современного населения Сибири, на основе анализа частот и структуры гаплогрупп Y-хромосом. При этом большинство исследований, с привлечением данных по сибирским популяциям касаются, в основном, проблемы заселения Америки (Lell et al., 1997; Bianchi et al., 1998; Santos et al., 1999). Лишь в последнее время появились работы, сосредоточенные именно на сибирских этносах (Karafet et al., 1999; 2002; Lell et al., 2002; Степанов и др., 2000a; 20006; 2002; Деренко и др., 20026; Пузырев и др., 2003).
Современный этнический состав коренного населения Сибири сформировался в результате длительных этногенетических процессов. Археологические (Окладников, 1950; Киселев, 1951), этнографические (Кацюба, Николаев, 1994), антропологические (Алексеев, 1984; 1989) данные указывают на то, что население Сибири формировалось на протяжении тысячелетий при объединении самых различных компонент. Заселение Сибири было комплексным и продолжительным процессом миграций, исходящих с территории Восточной Европы, Средней, Центральной и Юго-Восточной Азии. Пересечение миграционных путей от глобальных (аустерического и бореального маршрутов распространения человека по земному шару в древности), до великого переселения народов и русской экспансии, привело к тому, что народы, населяющие этот обширный регион, весьма разнообразны по своему антропологическому и языковому составу. Огромное влияние на процесс заселения Сибири оказывало изменение климатических условий, вызывавшее смену биоценозов, что отражалось на возможности использования их человеком и заселении им новых территорий.
Генофонд населения Сибири складывался за счет длительного и многоэтапного смешения большого числа локальных генофондов различных племен европеоидного и монголоидного происхождения. Смешение многочисленных тюркских, монгольских, кетских, уральских групп на основе генетического субстрата древних индоевропейских племен (в Южной Сибири) и таежных монголоидов (в Восточной Сибири) сформировало в результате пест рую картину генетического разнообразия коренного населения этого обширного региона (Генофонд населения Сибири, 2003).
Датировки мест и времени проникновения людей, в различное время заселявших этот регион, пути их распространения, преемственность различных археологических культур и родство этносов, существующих в настоящее время, остаются предметом оживленных дискуссий. Неясно и соотношение вклада автохтонного населения (со времен палеолита) и позднее пришедших мигрантов (начиная с неолита) в генофонд современного населения. Требует уточнения также локализация прародины пришлых этносов и соотношение их с археологически известными культурами и современным населением регионов, граничащих с Сибирью.
Мужской генный пул населения Северной Евразии представлен различными по времени и месту происхождения линиями (гаплогруппами), распространение которых связано с миграциями разнородных групп населения в палеолитический и неолитический периоды (Rosser et al., 2000; Semino et al, 2000; Zerjal et al., 2001; 2002; Wells et al., 2001; Степанов, 2002; Karafet et al., 2002). Предположительно, неолитические по времени происхождения линии появились на территории Сибири, как следует из названия, в неолите; более древние палеолитические же могут иметь как глубокие исторические корни на этой территории, так и быть привнесены вместе с неолитическими переселенцами. Отдельные гаплогруппы имеют различающиеся ареалы распространения, и некоторые из них составляют значительную долю от общего числа в современных сибирских популяциях. Подробный анализ таких гаплогрупп весьма интересен, поскольку их распространение тесно связано с процессами этногенеза современных народов, главным образом на начальных этапах. У сибирских этносов структура этих линий, определяемая на основании гено-типирования микросателлитных маркеров, проработана еще довольно слабо и лишь в общих чертах (Степанов, 2002; Zegura et al., 2003). Существует ряд предположений о соответствии некоторых гаплогрупп основным миграционным потокам из Европы, Ближнего Востока и Юго-Восточной Азии, но на сколько они верны, можно выяснить лишь детально изучив структуру и фи-логеографию этих линий при межрегиональном сравнении.
Таким образом, актуальным представляется проведение исследования по анализу линий Y-хромосомы на территории Сибири с использованием маркеров, составляющих единую систему для разработки молекулярной систематики в соответствии с современными данными о наличии информативных маркерных локусов. Новая информация о структуре Y-хромосомной составляющей генофонда народов Сибири будет являться важным дополнением к существующим антропологическим, археологических, лингвистическим данным, а также результатам, полученным при исследовании других маркерных генетических систем. Сравнительный анализ различных генетических систем обеспечит более точное выявление эволюционных взаимосвязей при формировании региональных составляющих сибирского генофонда и даст более детальную информацию об истории заселения Сибири.
Цель исследования:
Охарактеризовать структуру и возраст происхождения линий Y-хромосомы у населения Сибири.
Задачи исследования:
1. Определить частоты встречаемости линий Y-хромосомы в популяциях Сибири и у населения других регионов Евразии (Средняя Азия, Восточная Европа).
2. Провести анализ генетических взаимосвязей этносов Сибири с учетом частоты встречаемости диаллельных гаплогрупп Y-хромосомы.
3. Оценить разнообразие в гаплогруппах Y-хромосомы, провести филогенетический анализ микросателлитных гаплотипов и оценить время происхождения наиболее часто встречающихся на территории Сибири гаплогрупп.
4. Выявить место происхождения и пути распространения линий Y-хромосомы с помощью филогеографического анализа.
Научная новизна исследования
В работе впервые детально охарактеризован генофонд коренного населения Сибири на основании данных о составе и структуре гаплогрупп Y-хромосомы, полученных при генотипировании тридцати четырех, специально отбранных по их информативности для изучаемых популяций, диаллельных и стандартного набора микросателлитных маркеров. Проведена подробная мо-лекулярно-генетическая характеристика семи основных гаплогрупп, составляющих основу мужского генофонда популяций Сибири. В результате исследования выявлены генетические взаимоотношения между этносами Сибири, что позволяет точнее реконструировать процесс заселения современным человеком этой территории и историю формирования генофондов современных популяций. Получены новые знания в области генетики народонаселения и филогеографии.
Научно-практическая значимость работы
Молекулярно-генетическая характеристика генофонда популяций коренного населения Сибири путем анализа различных гаплогрупп Y-хромосомы является важным дополнением к существующим данным о генофонде населения Северной Евразии.
Результаты исследования имеют междисциплинарное значение и представляют интерес для антропологов, этнографов, лингвистов и демографов, занимающихся проблемами истории народонаселения Сибири. Полученные данные могут быть использованы для создания генетических карт и геногео-графических атласов. Возможно использование их в качестве учебного материала при проведении лекционных курсов со студентами различных специальностей (по генетике, антропологии, археологии, истории).
Положения, выносимые на защиту: ч 1. По структуре генофондов коренные этносы Сибири подразделяются на три выраженные группы. Региональная структурированность суммарного генофонда связана с удельным весом в его составе европеоидного и монголоидного компонентов, а также древнего генетического субстрата, которые маркируются соответствующими западно- и восточноевразийскими гаплогруппами.
2. Для популяций Сибири характерен более низкий, по сравнению с другими регионами Евразии (Восточная Европа, Средняя Азия, Центральная Азия и Юго-восточная Азия) уровень генетического разнообразия по микро-сателлитным гаплотипам в составе наиболее частых гаплогрупп, и высокий уровень генетической дифференциации. Наибольшим разнообразием характеризуются южносибирские этносы, что является отражением их формирования на гетерогенной основе. Наибольший уровень генетической дифференциации характерен для популяций Восточной Сибири.
3. В Южной Сибири существует градиент западноевразийских гаплогрупп Y-хромосомы в направлении с запада на восток, определяемый наличием европеоидного компонента в генофонде южносибирских этносов.
4. Накопление разнообразия в гаплогруппах, составляющих большую часть суммарного генофонда сибирских этносов, началось еще в эпоху верхнего палеолита, о чем свидетельствуют абсолютные оценки возраста основных гаплогрупп.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на VII итоговой конференции ГУ НИИ МГ "Актуальные проблемы клинической генетики" (Томск, 2004); III международной конференции "Проблемы вида и видообразования" (Томск, 2004); международных конференциях по геному человека (Human Genome Meeting, Edinburgh, 2001, Shahghai, 2002) международной конференции Европейского общества генетики человека (Annual Meeting of the European Socity of Human Genetics, Munich, 2004); международной конференции Биоразнообразие и динамика экосистем северной Евразии ("Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia") (Новосибирск, 2000); 10-м международном конгрессе по генетики человека (International Congress of Human Genetics, Vienna, 2001); 2-м съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2004); XXVIII и XXXIX международных научных студенческих конференциях "Студент и научно технический прогресс" (Новосибирск, 2000, 2001); научных семинарах ГУ НИИ Медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (2003, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ (3 в рецензируемых журналах, 4 статьи в сборниках, 6 тезисов в материалах зарубежных и 2 в материалах отечественных конференций).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 172 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав (Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Данные проиллюстрированы 17 таблицами и 23 рисунками. Список литературы включает 293 источника, из них 202 зарубежных авторов.
Разнообразие генофонда человечества и проблемы геногеографии и этногенетки
Внутривидовое биологическое разнообразие человека (Homo sapience) является выражением фундаментального свойства всего живого - изменчивости, которое проявляется на всех уровнях организации и имеет в своей основе, в качестве первопричины, разнообразие генов. Различия на уровне генов между людьми обусловливают наследственные индивидуальные особенности каждого человека. Генетический полиморфизм является нормальным состоянием любой локальной популяции человека и человечества в целом, и представляет собой итог генетических процессов, совершающихся на всех уровнях организации - от популяционного до молекулярного. Эти процессы порождаются действием мутационного, селективного, миграционного и других факторов на генетическую структуру популяции и в сложном взаимодействии сливаются в единый популяционно-генетический процесс (Генофонд и геногеография..., 2000).
При сравнении хромосом двух случайно выбранных индивидов ДНК будет различаться в среднем на один нуклеотид из каждой тысячи - тысячи девятисот нуклеотидов (The international SNP..., 2001). С учетом размера генома человека (а это приблизительно 3289 миллионов пар оснований (International Human Genome..., 2001)), и численности народонаселения, вариабельность генома на межпопуляционном уровне поистине огромна.
Наследственное разнообразие, хранимое геномами отдельных индивидов и генофондом человечества в целом, представляет собой базу для решения задач эволюционной генетики, этногеномики, молекулярной эпидемиологии наследственных болезней, генетики мультифакториальных заболеваний, генетического картирования и целого ряда прикладных работ.
Совокупность геномов отдельных организмов, и суммы аллелей генов их составляющих, в пределах популяции формирует ее генофонд. Согласно определению, представленному в первом томе фундаментального издания "Генофонд и геногеография народонаселения" (2000), "генофонд - это географически распределенное и исторически упорядоченное множество генов (и любых реплицирующихся участков молекулы ДІЖ), удерживаемое самосознанием человеческой популяции в пределах ее ареала, воспроизводимое ею в поколениях и поддерживаемое систематическими и стохастическими силами эволюции в динамическом равновесии с состоянием вмещающей популяцию и изменяемой ею среды" (стр. 9). Единство закономерностей становления генетического своеобразия разных регионов мира, позволяет рассматривать генофонд всего человечества в целом как единую систему, состоящую из региональных генофондов-подсистем, что является отражением эволюционно-генетической истории формирования и развития населения земного шара (Генофонд и геногеография..., 2000). Исследования биохимической изменчивости позволили прийти к выводу, что генофонд является иерархически организованной динамической системой, хранящей информацию обо всех произошедших событиях в истории популяции - колебаниях численности, миграциях, адаптации к изменяющимся условиям среды (Алтухов, Рычков, 1970).
Можно выделить различные уровни организации генофонда: популя-ционный, региональный, расовый, видовой. При изучении генофонда народонаселения возникает еще один уровень - этнический. Ни одна из популяций человека не возникает и не существует вне этноса, и каждая обладает этническим самосознанием. Этнический генофонд - это сложная пространственно и культурно дифференцированная система, хранящая в себе следы всех когда-либо проходивших в ней процессов (Генофонд и геногеография..., 2000). Современное генетическое разнообразие, возникшее как итог всех последовательных этапов развития этноса, прослеженное в ретроспективе его развития, позволяет с определенной точностью установить время свершения тех событий в истории популяции, которые дали начало определенным новым вехам этногенеза (Рычков 1984; 1986; 1987; Рычков, Ящук, 1985).
Достижения последних лет в области молекулярной генетики по расшифровке нуклеотидной последовательности генома человека (International Human Genome..., 2001) способствовали развитию ряда новых научных направлений, в том числе геномики, охватывающей такие разделы, как функциональная, сравнительная, медицинская и этногеномика (этногенетика). Согласно определению, данному Е.В. Балановской и Ю.Г. Рычковым (1990), этногенетика есть такое изучение генетики популяций человека, в котором особое внимание уделяется этнической структуре популяций, а целью является выяснение генетических последствий этноисторического и экологического развития народонаселения. Учет этнической структурированности позволяет проводить генетический анализ на едином уровне популяционнои организации даже в географически и исторически разобщенных группах населения.
Одна из основных задач этногенетики заключается в изучении изменчивости генетических маркеров на уровне отдельных популяций, этносов и этнических групп с целью выявления структуры генофондов локальных популяций и филогенетических взаимоотношений между ними. Поскольку генофонд является открытой системой, естественно также уделить особое внимание, помимо этнического уровня его организации, также и региональному уровню (Генофонд и геногеграфия..., 2001).
В приведенном выше определении понятия "генофонд" в качестве первой характеристики упоминается его географическая распределенность, и это далеко не случайно. Генофонд народонаселения не хаотичен и не существует сам по себе, он является сложной открытой стратифицированной системой изменчивости аллельных частот генов, организованной в географическом пространстве ареала его носителей. География распространения генов — гено-география, описывает структуру и историю формирования генофонда в пространстве.
Y-хромосомаи ее применение в популяционной генетике
Y-хромосома - одна из самых маленьких хромосом человеческого набора, размером примерно 51 млн. п.н., что составляет около 1,6% гаплоидного генома, около 23 млн. п.н., из которых приходятся на эухроматиновые домены, а остальное - на гетерохроматиновые, которые могут варьировать по размеру у разных индивидов (International Genome...2001; Tilford et al., 2001). Нерекомбинирующая часть Y-хромосомы, или NRY (от англ. non-recombining), занимает на ней 95%. Именно эта часть уникальна для мужчин. Фланкируюшие псевдоаутосомные районы (ПАР) располагаются на концах плеч хромосомы и занимают около 5% ее длины. Они рекомбинируют с гомологичными участками Х-хромосом в ходе мейоза. ПАРІ человека находится на концах коротких плеч половых хромосом, имеет размер 2,6 млн. п.н. и содержит 12 полноразмерных функциональных генов и 5 -район тринадцатого. ПАР2 имеет размер 320 т.п.н., и по последним данным содержит четыре функциональных гена (Ciccodicola et al., 2000; Lahn et al., 2001).
Эухроматиновые домены NRY занимают 8 млн. п.н. короткого плеча и 14,5 млн. пн длинного, расположенные проксимально. Анализ полной нук-леотидной последовательности выявил, что NRY имеет в своем составе три класса эухроматиновых последовательностей: 1) деградировавшие последовательности предковых хромосом; 2) перенесенные путем транспозиции с X-хромосомы; 3) амплифицированные. Как и другие хромосомы, Y-хромосома имеет прицентромерный гетерохроматин (приблизимтельно 1 млн. п.н.). Второй, гораздо больший гетерохроматиновый участок (около 40 млн. п.н.), расположен дистально на длинном плече и занимает большую его часть. Это самый крупный гетерохроматиновый блок в геноме человека. Он состоит из высокоповторяющихся последовательностей ДНК, относимых к трем семей ствам: DYZ1, DYZ18 и DYZ2. Последний и самый маленький участок гетеро-хроматина (400 т.п.н.) располагается проксимально на длинном плече и представлен более чем тремя тысячами повторов длиной 125 п.н. (Skaletsky et al., 2003).
Считается, что Y и Х-хромосомы млекопитающих произошли от общей предковой гомологичной пары аутосом, существовавшей около 300 млн. лет назад (Lahn, Page, 1999). Y-хромосома в настоящее время не имеет пары, поэтому до последнего времени считалось, что она является "деградирующей свалкой" генетического материала. Высказывалось мнение, что отсутствие возможности исправления возникающих ошибок приводит к постепенной инактивации генов Y-хромосомы, и что при существующих темпах её деградации, Y-хромосома исчезнет из генома человека (в случае его длительного существования как биологического вида) приблизительно через 5 млн. лет (Sykes, 2004). Недавно было выявлено, что Y-хромосома не деградирует ввиду наличия палиндромов. Восемь палиндромов, занимающих 25% всего эу-хроматина NRY, защищают хромосому от потери генов (Skaletsky et al., 2003).
В настоящий момент установлено, что формирование мужской половой хромосомы являлось сложным и поэтапным процессом. Некоторые части генетического материала этой хромосомы имеют недавнее происхождение за счет крупных вставок новой ДНК и делеций старого материала. Так, длинные диспергированные элементы (LINE) Y-хромосомы гораздо эволюционно моложе своих аутосомных соседей (International Human Genome..., 2001). При сравнении различий, накопившихся в NRY, были выделены пять участков с резко различающимся количеством изменений. Участок, ближайший к гену SRY, утратил способность к рекомбинации раньше всего, примерно 290 -350 млн. лет назад, вскоре после того, как появились первые млекопитающие. Далее этот процесс происходил в несколько этапов: около 230-300, 1 ЗОНО, 80-130 и 30-50 млн. лет назад новые блоки ДНК Y-хромосомы были исключены из процесса рекомбинации. Примерно 80-130 млн. лет назад, кроме того, произошло увеличение размеров псевдоаутосомного района ПАРр на обеих половых хромосомах, а 3-4 млн. лет назад (уже после разделения эволюционных линий человека и шимпанзе) произошла транслокация с X-хромосомы участка, содержащего гены TGIF2LY и PCDHY. Последний является единственным из известных генов NRY экспрессирующимся исключительно в тканях головного мозга (Lahn, Page, 1999). Параллельно с уменьшением количества одних генов, исходно имевшихся на предковой аутосоме-предшественнице, происходило также накопление других генов, путем привнесения их из других аутосом и Х-хромосомы, а также увеличение копийно-сти некоторых генов путем их амплификации (Page, 2004).
Долгие годы считалось, что Y-хромосома бедна генами, хотя кроме SRY было уже известно несколько генов, роль которых в сперматогенезе очень важна (Tiepolo, Zuffardi, 1976), но в последнее время открыто большое число Y-сцепленных генов, многие из которых участвуют в фундаментальных клеточных процессах. Сейчас на Y-хромосоме известна локализация 156 транскрипционно активных единиц. Все они расположены в эухроматиновых областях. Известно, что 78 из них являются кодирующими белок генами, из которых 60 являются членами девяти семейств, специфичных для Y-хромосомы. Остальные 18 генов представлены только одной копией. Из 78 известных транскрипционных единиц, не кодирующих белок, 13 являются однокопийными, а оставшиеся 65 подразделяются на 15 семейств (Skaletsky et al., 2003).
Одна часть генов Y-хромосомы экспрессируется во многих тканях и органах, другая - преимущественно в гонадах. Гены Y-хромосомы определяют развитие мужских половых органов в раннем эмбриогенезе. Это происходит, в частности, благодаря действию гена SRY, функцией которого является регуляция транскрипции других генов, отвечающих за развитие семенников (Sinclair et al., 1990).
Маркеры использованные для характеристики генетического разнообразия
Для изучения состава и структуры гаплогрупп Y-хромосомы в рамках данной работы в исследование были включены две системы генетических маркеров: диаллельных локусов, представленных в основном SNP, и полиал-лельных высоковариабельных микросателлитов (YSTR).
С помощью диаллельных маркеров определяли принадлежность образцов к той или иной гаплогруппе. Классификация гаплогрупп дана в соответствии с предложенной Консорциумом по исследованию Y-хромосомы (The Y-Chromosome..., 2002), с одним отличием: гаплогруппы обозначенные в рамках данной работы звездочкой (например I , Rib ) не вполне соответствуют таковым по международной классификации, поскольку мы использовали меньшее число маркеров, чем использовалось для создания современной номенклатуры гаплогрупп. Формально, такие гаплогруппы принято обозначать с примечанием того, по каким маркерам мутантное состоянеие исключено (например, для двух указанных гаплогрупп это будет выглядеть так: IxP37, RlbxM263). Такие полные названия с примечанием приводятся при первом упоминании названия гаплогрупп в тексте главы 3. По всему тексту и на рисунках этого не сделано из-за громоздкости обозначений. Затем проводили генотипирование с помощью набора микросателлитных маркеров, определяя для каждого образца его индивидуальный STR-гаплотип. На основании данных о составе гаплотипов внутри гаплогрупп, выявляли их внутреннее разнообразие и детальные филогенетические взаимоотношения.
Микросателлитные маркеры. Анализ STR-гаплотипов внутри гаплогрупп проводили с использованием семи микросателлитных маркеров не-рекомбинирующей части Y-хромосомы (DYS389I, DYS389II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393 и DYS394 (DYS19)). Один из них (DYS392) является тринуклеотидным повтором, остальные - тетрануклеотидные повторы. Семь использованных маркеров составляют, так называемый, минимальный гапло тип (De Knijff et al., 1997). Именно этот набор YSTR наиболее подробно изучен в различных популяциях мира и является основным дЗатем приливали 5М перхлорат Na и оставляли на 5 минут. После добавления смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1) смесь центрифугировали при 5000 об/мин., отбирали верхнюю фракцию и добавляли к ней ЗМ Na-ацетат (для стабилизации ДНК). Экстракцию ДНК проводили этиловым спиртом с последующим переосаждением (Johns, Paulushomas, 1989).
Генотипирование диаллельных маркеров проводили с помощью проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) и последующего анализа фрагментов ДНК различными способами. Большинство маркеров генотипировали с помощью ПДРФ-анализа, определяя размеры фрагментов рестрикции путем электрофореза в агарозных гелях, в других случаях - непосредственным разделением продуктов аллель-специфичной или обычной ПНР, либо с помощью секвенирования.
Полимеразная цепная реакция. Для проведения ПЦР использовались микроцентрифужные пробирки "Eppendorf \ "Treff Lab" и автоматические амплификаторы MJ Research "РТЛ 00", "Mini Cycler" (США) и "Терцик" (Россия). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы компаниями "ARK Scientific", "Metabion" и "Медиген".
Реакционная смесь объемом 15 мкл. включала: 0,8 — 1,5 нг образца ДНК, 1,5 мкл 10-кратного инкубационного буфера для Taq-полимеразы (65 мМ Tris-HCl; 16,6 мМ (NH SO 0,01% Twin-20; рН = 8,0), по 0,2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтифосфатов, 1,5-2,5 мМ MgCl2, 0,01-0,02 о.е. каждого из праймеров и 1 единицу термостабильной Taq-ДНК-полимеразы (производства "Сибэнзим", Новосибирск).
Для предотвращения потери влаги на поверхность смеси наносили минеральное масло в количестве нескольких микролитров таким образом, чтобы полностью изолировать реакционную среду от контакта с воздухом. Условия проведения ПЦР и состав праймеров приведены в таблице 4.
проведения популяционно-генетических и криминалистических исследований Большинство праймерных последовательностей, кроме специально оговоренных измененных вариантов, описаны в статье по номенклатурной системе гаплогрупп (The Y-Chromosome..., 2002).
Первичная денатурация ДНК (94 С - четыре минуты) проводилась одинаково для всех локусов, так же на заключительной стадии проводили элонгацию в течение четырех минут при 72 С, общую для всех программ. Определенный режим смены температур в течение различного количества циклов выполнялся в соответствии с данными литературных источников, либо собственных результатов подбора температурных условий ПЦР (таблица .
Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции. Для идентификации точковых мутаций проводили рестрикцию продуктов амплификации двадцати двух локусов (МЗ, М9, М20, М25, М46, М70, М77, МІ30, Ml 72, Ml 73, М175, М178, М207, М217, М242, М269, SRY1532, SRY2627, 92R7, Р37 и Р43) с помощью соответствующих рестриктаз. Названия ферментов и длины фрагментов ДНК обоих аллельных вариантов исследованных локусов приведены в таблице 3.
Использовались рестриктазы фирмы "СибЭнзим" (Mfe I, Hinf I, Ssp I, EcoR I, Fat I, Hae III, Dra I, Bsc4 I, Bst4C I, Bst6 I, Bspl9 I и Bbvl2 I), "Promega" (Hps92II), "MBI Fermentas" (Ade I) и "New England Biolabs" (Nla III). Для проведения реакции использовался буферы, прилагаемые к ферментам фирмами-изготовителями. Соблюдались температурные условия, рекомендуемые производителем. Смесь раствора фермента с буфером вносили в амплификационную пробирку под минеральное масло, и перемешивали микропипеткой.
Распределение гаплогрупп Y-хромосомы у исследованных этносов
В результате проведенной работы установлен состав и частоты гаплогрупп Y-хромосомы, определяемых на основании генотипирования тридцати четырех диаллельных локусов ее нерекомбинирующей части у коренного населения Сибири, Восточной Европы и Средней Азии. Частоты распределения гаплогрупп в исследованных этнических группах приведены в таблице 5.
Исследованные славянские этносы, географически представляющие Восточную Европу, характеризуются высокой частотой гаплогрупп Rial, I (IxP37), lib, N3a, наличием линий Rlb3, J2, Е, G. Наиболее частой гапло-группой является Rial, охватывающая 44-51% Y-хромосом. Русские, проживающие на территории Сибири, по составу гаплогрупп практически не отличаются от лиц украинской и белорусской национальности, собранных на исконных территориях расселения восточных славян, за исключением наличия в выбоке русских из Читы двух образцов, относящихся к гаплогруппе СЗ (СЗхМ77) и одного, относящегося к СЗс. Эта незначительная примесь монголоидных гаплогрупп в генофонде пришлого русского населения Сибири, видимо, объясняется метисацией с местным населением в процессе колонизации этого региона Россией, и, таким образом, имеет недавнее происхождение.
Среднеазиатские этносы менее сходны друг с другом. Отличительной чертой выборок среднеазиатских европеоидов (таджиков и узбеков) является высокая частота западноевразийских гаплогрупп: Rial, J (JxM172), J2 и наличие линий Rlb3 и G. Среди узбеков выявлен единственный носитель гап-логруппы Q2. Таджики отличаются от других этносов тем, что только среди представителей этой группы выявлена гаплогруппа L. В небольшой выборке дунган преобладает гаплогруппа Р . Только среди этих трех этносов обнаружена, с невысокой частотой, гаплогруппа К2. Киргизы отличаются большей долей монголоидных гаплогрупп СЗ и СЗс, при этом частота Rial примерно в два раза превышает таковую у таджиков и узбеков. Именно в выборке южных киргизов обнаружен единственный носитель линии D1. Казахи, наряду с наличием гаплогрупп СЗ и СЗс, характеризуются высокой частотой линии ОЗ и отсутствием большинства европеоидных гаплогрупп.
В генофонде коренных сибирских этносов выявлено двадцать пять гаплогрупп. Лишь семь из них имеют частоту более трех процентов (N3a, Rial, Q , СЗ , N2, СЗс и 03). В сумме эти семь гаплогрупп составляют 86% общей выборки сибирских образцов.
В южносибирских популяциях (северные и южные алтайцы, сибирские татары) наибольшей частотой характеризуется гаплогруппа Rial, причем у южных алтайцев она доминирует, составляя 54%, что даже немного больше чем у славян. У тувинцев частота Rial ниже (12%). Из других европеоидных гаплогрупп представлена Rlb3 у южных алтайцев и татар (1-11%), J2 - у алтайцев и татар (2-7%), I и lib - у южных алтайцев и татар (1-7%) и G - у татар (4%). Все Y-хромосомы, относящиеся к линии D, кроме одной из выборки нивхов, обнаружены у южных алтайцев. В регионе Алтая-Саян наблюдается также наиболее высокая частота гаплогруппы N2. У тувинцев именно эта гаплогруппа является наиболее частой (22%). В небольшой выборке западносибирских хантов линия N2 составляет, как и СЗ , 17%, доминирует при этом гаплогруппа N3a (54%). Гаплогруппа N (NxTat, Р43) также характерна для этого региона - почти все обнаруженные образцы, за исключением одного якутского, разделены между южными алтайцами и тувинцами.
Высокая частота гаплогруппы N3a характерна для этносов восточной Сибири (якутов, бурят и эвенков). Причем в популяции якутов она составляет почти 90%. Дальневосточные коряки и чукчи близки к восточносибирским популяциям по наличию этой гаплогруппы (22% и 53% соответственно), а среди исследованных образцов нивхов и канадских эскимосов эта Y-хромосомная линия полностью отсутствует. Коряки, наряду с бурятами и нивхами, кроме того, характеризуются наибольшей среди исследованных популяций частотой гаплогруппы СЗ (по 40% Y-хромосом у бурят и нивхов и 41% у коряков).
Гаплогруппа Q (QxM3,M25) выявлена с различной частотой у большинства сибирских этносов, за исключением хантов, якутов и бурят. Наиболее высокой частотой линии Q характеризуются кеты и северные алтайцы (85% и 32% соответственно).
Характерная особенность исследованных образцов канадских эскимосов - наличие гаплогруппы Q3 (45%), охватывающей около 85% Y-хромосом у американских индейцев. С гораздо меньшей частотой присутствует она и у исследованных нами чукчей (9%). Гаплогруппа Q3 объединяет популяции американских индейцев и распределена по территории Нового Света от Аляски до Патагонии с частотой до 90% у южноамериканских, и примерно 60% у центральноамериканских индейцев (Karafet et al., 1999; Mesa et al., 2000; Ta-razona-Santos et al., 2001; Bortolini et al., 2003; Zegura et al., 2004). Ее географический ареал в Азии крайне узок и, вероятно, отражает обратную миграцию через Берингию носителей возникшей уже на территории Нового Света мутации.
Полученные нами данные по распределению гаплогрупп Y-хромосомы у изученных этносов существенно дополняют имеющуюся картину распределения мужских линий в популяциях Северной Евразии. В целом, наблюдаются значительные межэтнические и межрегиональные различия частот гаплогрупп.
