Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Антропологические исследования народов Дагестана 9
1.2 Популяционно-генетические исследования народов Дагестана. Аутосомные, митохондриальные и Y-хромосомные маркеры 13
1.3 Филогеография гаплогрупп Y-хромосомы: Применение в популяционно-генетических исследованиях 21
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы исследования 30
2.2 Методы исследования
2.2.1 Выделение геномной ДНК 34
2.2.2 Анализ аутосомных Alu- инсерционных локусов 34
2.2.3. Анализ полиморфизма диаллельных локусов Y-хромосомы 38
2.2.4. Статистическая обработка результатов анализа аутосомных Alu-инсерционных локусов 45
2.2.4 Статистическая обработка результатов анализа диаллельных маркеров Y-хромосомы 48
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Анализ полиморфизма Alu-инсерционных локусов в популяциях Дагестана 51
3.1.1 Анализ генетических взаимоотношений между популяциями методом многомерного шкалирования 58
3.2 Анализ полиморфизма Y-хромосомы в популяциях Дагестана 62
3.2.1 Филогеография гаплогруппы R 64
3.2.2 Филогеография гаплогруппы G 69
3.2.3 Филогеография гаплогруппы J 83
3.2.4 Филогеография гаплогрупп Па, lib, 11с 87
3.2.5. Филогеография гаплогруппы ЕЗЬ 88
Заключение 89
Выводы 91
Список литературы
- Антропологические исследования народов Дагестана
- Филогеография гаплогрупп Y-хромосомы: Применение в популяционно-генетических исследованиях
- Анализ аутосомных Alu- инсерционных локусов
- Анализ полиморфизма Alu-инсерционных локусов в популяциях Дагестана
Введение к работе
Республика Дагестан, входящая в состав Российской Федерации, является одним из уникальных регионов мира как с точки зрения разнообразия естественно-географических условий, так и по этнокультурному многообразию проживающего здесь населения и сложности историко-генетических проблем. Располагаясь на северо-восточных склонах Большого Кавказа и в юго-западной части Прикаспийской низменности, Дагестан граничит с Республикой Азербайджан, Грузией, Чеченской Республикой, Республикой Калмыкия и Ставропольским краем.
История заселения территории Дагестана анатомически современным человеком, судя по находкам памятников верхнего палеолита, началась очень рано [Магомедов М.Г., 1997], однако, широкое освоение данной территории людьми, по-видимому, происходило намного позже в эпоху неолита и энеолита [Магомедов М.Г., 1997; Гаджиев М.Г. с соавт., 2002]. Причиной этому являлось то, что в период позднего палеолита ледниковые условия Восточного Кавказа препятствовали широкому заселению первобытными людьми нынешней территории Дагестана и прежде всего его горной части [Гаджиев М.Г. с соавт., 2002]. Исходной областью, откуда началось заселение территории Дагестана в эпоху неолита, считается Южный Прикаспий, т.е. район Северного Ирана, расположенный между Каспийским морем и горой Эльбрус [Гаджиев М.Г. с соавт., 2002]. Постоянные связи местного населения с племенами Закавказья и Передней Азии, представлявшими в древности единый этнокультурный мир, обусловило то, что Дагестан стал одним из древнейших на Кавказе очагов сложения и развития раннеземледельческой культуры. [Османов М.О., 2002]. Стержневой процесс складывания племенных обществ, основ будущих народностей, по всей вероятности, завершился очень рано - в эпоху железа [Гаджиев Г.А., 1972]. На протяжении тысячелетий здесь формировались и развивались в непрерывном историко-культурном взаимодействии десятки народов. В настоящее время в республике Дагестан насчитывается около 26 коренных народностей [Bulayeva К.В. et al, 2006]. Заслуживает особого
5 внимания тот факт, что в составе Иберо-Кавказской языковой семьи по сей день сохранилась очень высокая степень дифференциации языков, что свидетельствует о длительной и непрерывной лингвистической эволюции в этом регионе [Nichols J., 2003]. Помимо лингвистической дифференциации в Дагестане, в особенности в высокогорных поселениях постоянно шел процесс изоляции, действие которой усиливалось высоким процентом эндогамных браков внутри селений. По мнению некоторых исследователей, традиция эндогамных браков в Дагестане имеет тысячелетнюю историю [Гаджиев А. Г., 1972; BulayevaK.B. et al, 2003, 2006].
До недавнего прошлого горцы составляли 2/3 коренного населения Дагестана [Булаева К.Б. и соавт., 1995]. В частности, в работе Роговой И.Е. было показано, что доля сельского населения за последние десятилетия постоянно снижалась: в начале XX века эта доля составляла 91%, а в 1992 г. -54% от общей численности населения [Рогова И.Е., 1997]. Урбанизация, как процесс уже начата, и ее неизбежные последствия являются нежелательными с точки зрения исследования генетической структуры местного населения. Поскольку сельское население, в особенности жители высокогорных поселений в прошлом меньше подвергались метисации, то актуальным является задача изучения генетической структуры именно малых народов горной части Дагестана. Впервые популяции Дагестана были изучены с помощью различных антропологических программ [Бунак В.В., 1953; Дебец Г.Ф., 1956; Миклашевская Н.Н., 1960; Гаджиев А.Г., 1972; Алексеев Н.Н., 1974]. Дальнейшие работы были основаны на использовании биохимических и различных генетических маркеров [Barbujani G. et al, 1994; Булаева К.Б. с соавт., 2003, 2004; Bulayeva К.В. et al., 2003; Nasidze I. and Stoneking M., 2001; Nasidze I. et al., 2001, 2003, 2004a]. Известна целая серия генетико-адаптационных и генетико-эпидемиологических исследований в популяциях Дагестана [Булаева К.Б. с соавт., 1995, 2003], однако, работы, так или иначе касающиеся проблемы этногенеза коренных народов, пока не дали однозначной генетической оценки происхождения генофонда народов Дагестана. Результаты
антропологических исследований, хотя и указывают на участие популяций Передней Азии и Европы в этногенезе народов Дагестана, все же не позволяют определить их относительный генетический вклад. Исследования, проведенные Булаевой К.Б. с соавт. (2003, 2004, 2006), ставят под сомнение участие популяций Передней Азии в формировании генофонда народов Дагестана, однако анализ Y-хромосомных и мтДНК маркеров в целом по Кавказу указывает на присутствие переднеазиатского компонента [Nasidze I. et al., 2003, 2004а]. Таким образом, наиболее интересный аспект изучения генетической структуры народов Дагестана - реконструкция происхождения генофонда, пока остается не решенной.
На наш взгляд наиболее адекватным и продуктивным подходом в изучении данной проблемы является филогенетический метод с использованием маркеров Y-хромосомы и мтДНК. Постоянно растущий уровень филогенетического разрешения, а также покрытие популяционными исследованиями все большего количества географических групп популяций Евразии совершенствует необходимую базу для сравнительного анализа и тем самым улучшает достижимость поставленной цели.
В связи с вышесказанным были определены цели и задачи исследования.
Цель работы: исследование генетической структуры популяций Дагестана по аутосомным и Y-хромосомным маркерам.
Задачи исследования:
Определить частоту аллелей 12-и Alu-инсерционных локусов в 9 популяциях Дагестана.
Оценить гетерогенность и степень генетической дифференциации популяций Дагестана по частотам аллелей 12 Alu-инсерционных локусов.
Провести сравнительный анализ генетической структуры народов Дагестана и западной Евразии по частотам аллелей Alu-инсерционных локусов.
4. Провести анализ полиморфизма 33-х диаллельных локусов
нерекомбинирующей области Y-хромосомы и определить частоты гаплогрупп в
исследуемых популяциях Дагестана.
5. Провести филогеографический анализ гаплогрупп Y хромосомы в
популяциях Дагестана.
Научная новизна.
Впервые в популяциях Дагестана (аварцев, даргинцев, табассаранцев, лезгинов, андийцев, багуалинцев, чамалинцев, кумыков и караногайцев) проведен филогеографический анализ гаплогрупп Y-хромосомы с использованием 33 диаллельных маркеров нерекомбинирующей области Y-хромосомы. В составе Y-хромосомного пула популяций Дагестана выявлено 19 монофилетических линий Y-хромосомы, что позволило оценить возможные источники происхождения отдельных элементов всего генофонда автохтонных групп. Установлено, что 60% гаплогрупп Y-хромосомы (Ли J2) в популяциях Дагестана являются характерным компонентом генофонда популяций всей Передней Азии. Впервые по частотам аллелей Alu-инсерционных локусов проведен сравнительный анализ популяций Дагестана с популяциями Передней Азии и Европы. Впервые показана генетическая близость жителей горной и предгорной частей Дагестана к популяциям Передней Азии.
Научно-практическая значимость.
Впервые получены данные, свидетельствующие о генетических связях народов Дагестана по отцовской линии наследования, с населением Передней Азии. Полученные результаты совместно с данными археологии и антропологии могут быть использованы при решении вопросов этногенеза коренных народов Дагестана. Результаты исследования могут быть использованы при чтении курсов популяционной генетики и антропологии на биологических факультетах университетов.
8 Положения, выносимые на защиту:
Соответствие распределения частот Alu инсерций в популяциях горной и предгорной частей Дагестана таковому в популяциях Передней Азии.
Относительно высокая степень генетической дифференциации (Gst=4%) в популяциях Дагестана по сравнению с популяциями Европы (Gst=2%) по частотам 12 Alu инсерций.
Генетическая гетерогенность равнинных жителей (кумыков, караногайцев) и малочисленных горных изолятов Дагестана (андийцев, чамалинцев, багуалинцев) по данным о распределении частот 12 Alu инсерций. Генетическая гомогенность табассаранцев, лезгинов, аварцев и даргинцев.
Присутствие в Y-хромосомном пуле багуалинцев, андийцев и лезгин гаплогрупп Па, ПЬ и Пс, характерных для генофонда популяций Европы.
Обособленность популяций Дагестана от жителей других регионов Северного Кавказа в генетическом отношении необычным для этого региона низкими частотами гаплогрупп J2 и G и высокой частотой гаплогруппы Л.
Гаплогруппа J Y-хромосомы, составляющая основную долю отцовских линий популяций Дагестана, является характерной для генофонда населения Передней Азии.
Антропологические исследования народов Дагестана
Самые ранние антропологические исследования на территории Дагестана были начаты еще в конце 19 века, однако из-за несовершенства методологии того времени эти исследования привели к запутыванию вопроса о происхождении местного населения, поскольку было объявлено о значительной смешанности коренного населения с монголоидной расой [Гаджиев А.Г., 1972]. Причина затруднений антропологов заключалась в морфологических особенностях жителей горной зоны, характеризующихся выраженной массивностью черепа и большей шириной лица по сравнению с другими представителями народов Кавказа. В дальнейшем, усовершенствованные антропологические методы позволили исследователям отвергнуть мнение о смешанности автохтонного населения с монголоидной расой. Было установлено, что антропологический тип жителей Дагестана принадлежит к балкано-кавказской ветви европеоидной расы [Дебец Г.Ф., 1956; Бунак В.В., 1953; Акимова М.С., 1952; Миклашевская Н.Н., 1953]. В 50-ые годы в результате работ грузинских антропологов внутри балкано-кавказской расы был выделен кавкасионский тип, характеризующийся очень широким лицом (146-148 мм), относительно (по кавказскому масштабу) светлой пигментацией глаз, высоким ростом (169-170 см) [Рогинский Я.Я. и Левин М.Г., 1978]. В нее, наряду с чеченцами, ингушами и осетинами, были отнесены жители горной части Дагестана. Равнинные жители юго-востока и восточной части Дагестана также отнесены к этому типу, но имеют небольшую примесь каспийского типа (более грацильный, узколицый и темноволосый). Необходимо заметить, что, несмотря на успехи в типизации народов Дагестана, происхождение особенностей кавкасионского типа так и не было раскрыто. Поскольку вклад монголоидной расы был исключен, причины этих особенностей антропологи
пытались объяснить результатом смешения двух различных ветвей внутри самой европеоидной расы [Дебец Г.Ф., 1956; Миклашевская Н.Н., 1953]. В связи с этим предпринимались попытки установления соответствующих расовых типов, которые бы при смешении могли привести к формированию особенностей кавкасионского типа. Поиски исходных расовых типов оказались безуспешными, так как отсутствовала согласованность в изменении признаков исходных вариантов. Тем не менее, некоторые советские антропологи выдвинули ряд гипотез [Дебец Г.Ф., 1956; Миклашевская Н.Н., 1960; Алексеев Н.Н., 1974]. В соответствии с первой - особенности кавкасионского типа объясняются генетическими связями народов Дагестана с населением эпохи бронзы юга России и Украины - носителями протоевропеоидного типа [Дебец Г.Ф., 1956]. Согласно этой гипотезе предполагается, что в горах Кавказа в изоляции продукт смешения протоевропеоидного и местного типов сохранился в виде реликта в несколько измененном виде. Вторая гипотеза, выдвинутая Миклашевской Н. Н., связывала светлые оттенки в пигментации радужной оболочки глаз и кожи, а также общую массивность кавкасионского типа с проникновением на территорию Дагестана сарматов [Миклашевская Н.Н., 1960]. Третья гипотеза, высказанная Алексеевым Н. Н., объясняет происхождение кавкасионского типа сохранением антропологических особенностей древнего населения этой территории, восходящего, возможно, к палеоевропейскому типу европеоидной расы эпохи неолита и даже позднего палеолита [Алексеев Н. Н., 1974]. Несмотря на расхождения, относительно источников исходных вариантов, сформировавших кавкасионский тип, все предположения сходятся в одном - они указывают на сохранение в облике кавкасионского типа признаков протоевропеоидного населения Евразии.
Последующие антропологические исследования, хотя и не принесли принципиальных новшеств в типологическом отношении, все же выявили некоторые важные особенности в распределении антропологических вариантов Дагестана. Было продемонстрировано, что на равнине характерный для всех дагестанцев кавкасионский тип претерпел заметные изменения в результате метисации с другими представителями балкано-кавказской расы [Гаджиев Г.Г., 1972]. Так, в работе Гаджиева Г.Г. показано, что лезгинские группы несут легкий отпечаток арменоидной (переднее-азиатской) расы, хотя, в целом, очень близки к кавкасионскому типу [Гаджиев Г.Г., 1972]. Кумыкские группы, обладая довольно значительной шириной лица, в чем они вплотную примыкают к кавказским группам, по всем остальным лицевым параметрам очень близки к азербайджанцам, т.е. к типичным представителям каспийской расы (темная пигментация, волнистоволосость, мезокефалия, узкое лицо, сравнительно небольшой рост) [Гаджиев Г.Г., 1972; Ибрагимов М.-Р.А., Аджиев A.M., 2002]. Все антропологические варианты, признаки которых отмечены у жителей Дагестана, принадлежат к одной балкано-кавказской расе [Рогинский Я.Я. и Левин М.Г., 1978].
В настоящее время ареал расселения представителей балкано-кавказской расы включает Переднюю Азию, Балканский полуостров, Кавказ и западную окраину Средней Азии [Рогинский Я.Я. и Левин М.Г. 1978]. Территория расселения различных ветвей балкано-кавказской расы дает отчетливое представление о распространении родственных в типологическом отношении к дагестанцам народов. Типологические сходства жителей этих регионов следует рассматривать как свидетельство единого происхождения некоторых исторических пластов, населения этой обширной территории. Результаты сравнительного анализа с использованием дерматоглифических и серологических признаков показали, что народы, входящие в ареал распространения балкано-кавказской расы демонстрируют сходство с жителями Кавказа [Гаджиев А.Г., 1972]. Такого рода сопоставления служат дополнительным фактическим материалом для поиска возможных генетических связей местного населения Дагестана с другими народами мира. Так, данные дерматоглифических сопоставлений свидетельствуют о близости кавказских групп к народам Передней Азии, Средней Азии и Памира.
Филогеография гаплогрупп Y-хромосомы: Применение в популяционно-генетических исследованиях
Сформированный в рамках эволюционного мировоззрения, филогенетический анализ изначально разрабатывался биологами-систематиками для реконструкции эволюционной генеалогии видов, основываясь на морфологических признаках [Павлинов И.Я., 2006]. В настоящее время в русле этого направления широкое распространение получили методы внутривидовой филогении, которые опираются на данные о нуклеотидной изменчивости организмов. Нуклеотидные замены в этих методах служат в качестве филогенетических сигналов, определяющих топологию получаемого дерева. С самого начала исследования внутривидовой филогении и филогеографии были основаны на использовании данных нерекомбинирующей части генома, в особенности на основе полиморфизма мтДНК [Малярчук Б.А. и Деренко М.В., 2006]. Использование нерекомбинирующей области Y-хромосомы при филогенетическом анализе долгое время сдерживалось отсутствием достаточного количества доступных полиморфных маркеров [Hammer M.F. et al., 1998]. Недавние достижения в области молекулярной генетики, в особенности, использование денатурирующей высоко-производительной жидкостной хроматографии (DHPLC), позволили выявить сотни новых нуклеотидных замен в нерекомбинирующей области Y-хромосомы [Oefner P.J. and Underhill P.A., 1998; Underhill P.A. et al., 2000; Shen P. et al., 2000, Hammer M.F. et al. 2001; Cinniouglu С et al., 2004]. Часть выявленных нуклеотидных замен оказались информативными маркерами при филогенетическом анализе. Появление новых маркеров существенно повысило уровень разрешения филогенетического дерева Y-хромосомы [Avise J.C., 2000; Underhill Р.А. et al., 2000]. В результате усилий исследователей со всего мира, объединяемых в консорциум по изучению Y-хромосомы (YCC), в 2002 году была опубликована номенклатура Y-хромосомных гаплогрупп, в основу которой был положен кладистический принцип [YCC, 2002].
По этой классификации, все современное многообразие Y-хромосом сходится к одному предковому варианту, так называемому корню филогенетического древа. С помощью кладистического анализа было установлено, что к корню Y-хромосомного дерева наиболее близки гаплогруппы, характерные для жителей Африки [Hammer M.F. et al., 1998]. Всего, согласно опубликованной классификации, в филогенетическом древе Y-хромосомы выделяют 18 основных гаплогрупп, которые обозначаются заглавными буквами латинского алфавита (A-R). Изучение географического распределения различных ветвей (клад) этого филогенетического древа, т.е. филогеографический анализ, позволил оценить древние маршруты расселения анатомически современного человека по всем континентам. Так, две первые гаплогруппы А и В, ответвляющиеся прямо у основания филогенетического дерева, характерны только для жителей Африки [Underbill Р.А. et al., 2000; Semino О. et al., 2002], а остальные 16 (несущие мутацию Ml68) распределены по всем континентам [Underhill Р.А. et al., 2001].
Согласно современным представлениям, заселение Евразии происходило из Африки по двум возможным маршрутам [Jobbing М.А. and Tyler-Smith С, 2003; Lius J.R. et al., 2004]. Первый маршрут пролегал через Эфиопию, аравийский полуостров, побережье Индии и доходил до юго-восточной Азии и Австралии [Underhill Р.А. et al., 2001]. В пределах Евразии этот маршрут известен как "аустрический" путь миграции. Выход древнего человека из Африки по этому пути был возможен только в периоды снижения уровня моря, т.е. только при наступлении ледниковых похолоданий [Underhill Р.А. et al., 2001]. Второй рассматриваемый путь начинался на севере Африки и выходил на Ближний Восток через так называемый левантийский коридор [Quintana-Murci L. et al., 1999; Underhill P.A. et al., 2001]. Археологические данные свидетельствуют о том, что древние люди, использующие каменные орудия, характерные для эпохи среднего палеолита, достигли Австралии по так называемому, "аустрическому" пути еще 50 тыс. лет тому назад [Bowler J.M. et al., 2003]. Присутствие древнего человека на Евразийском континенте датируется чуть более поздним периодом: около 47 тыс. лет назад в Израиле, 43 тыс. лет назад в Западной Европе и около 42 тыс. лет назад на Алтае [Goebel Т., 1999; Mellars Р., 2002]. До недавнего времени считалось, что оба коридора в прошлом сыграли одинаково важную роль при расселении человека из Африки [Cavalli-Sforza L.L. et al., 1994]. Однако появившиеся недавно работы по-разному оценивают роль этих двух возможных маршрутов [Lius J.R. et al, 2004; Macaulay V. et al., 2005]. Так, Lius J.R. с соавт., на основе анализа филогеографии гаплогрупп Y-хромосомы, пришел к выводу, что левантийский коридор в прошлом сыграл более важную роль в распространении предшественников евразийских гаплогрупп чем "аустрический" маршрут через Эфиопию [Lius J.R. et al., 2004]. Авторы более поздней работы, опираясь на реконструкцию глубокой филогении мтДНК гаплогрупп, предложили совершенно иную модель заселения Евразии, где распространение западноевразииских гаплогрупп рассматривается как результат ответвления от "аустрического" маршрута [Macaulay V. et al., 2005]. Хотя роль левантийского коридора и модель бореального пути в целом нельзя исключить, современные филогеографические реконструкции больше согласуются с моделью "аустрического" маршрута. Все Y-хромосомные гаплогруппы, встречающиеся за пределами Африки, подразделяются на три основные группы, которые представляют собой основные ответвления от единого узла - предковой линии, несущей мутацию М168.
Анализ аутосомных Alu- инсерционных локусов
ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew С.С., 1984]. Кровь набирали в пробирки, где в качестве консерванта был распылен 0,5 М раствор ЭДТА, тщательно перемешивали и хранили при температуре 4С. Для получения фракции клеточных ядер к 8 мл крови добавляли 40 мл лизирующего буфера (320 мМ сахароза; 5 мМ MgCl2; 1% тритон Х-100; 10 мМ трис-НС1, рН=7,6) и центрифугировали 20 мин при температуре 4 С и 4000 об./мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку повторно приливали 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 мин. К полученному осадку добавляли 400 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl), 40 мкл 10% SDS, 30-40 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали при 37С в течение 16 часов. Из полученного лизата выделяли ДНК. Экстракцию ДНК проводили в три этапа: забуференным фенолом (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола -Трис-НО, рН 7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах. Выделение ДНК проводили, смешивая лизат и растворитель до образования однородной эмульсии, разделение фаз осуществляли центрифугированием при 10000-12000 об./мин в течение 10 мин. ДНК осаждали двумя объемами 96% этанола. Осадок промывали 70%о этанолом, подсушивали на воздухе, затем растворяли в дистиллированной воде и хранили при -20С.
Генотипирование 12 Alu инсерционных локусов PV92, В65, ТРА25, АСЕ, АРОА1, А25, Ya5NBC123, Ya5NBC27, Ya5NBC182, Ya5NBC148, Ya5NBC51, Ya5NBC102 проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» (г. Москва).
Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл lOxTaq-буфера (67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2 S04,, 1,5мМ MgCl2, 0,01% Tween-20), ОД мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г. Москва) и 5-Ю пМ локусспецифичньгх олигонуклеотидных праймеров.
ПНР проводили по схеме: начальная денатурация (94С, 4 мин.); 28-30 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация - 94С, 35-60 сек; 2) отжиг - 50-68С, 35-60 сек; 3) синтез - 72С, 45-120 сек; после чего проводили инкубацию при 72С в течение 10 минут. Условия проведения ПНР варьировали в зависимости от температуры отжига праймеров. Размеры аллелей определяли путем одновременного электрофореза с ДНК фага X, гидролизированного рестриктазой PstI или плазмиды pUC19, рестрицированной Mspl или Hpall. Перечень аутосомных Alu - инсерций, последовательности праймеров и температура отжига представлены в табл. 2. Разделение фрагментов ДНК проводили с помощью электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном из 30% раствора ПААГ (соотношение акриламид:М,]Ч -метиленбисакриламид - 29:1). Электрофорез проводили в ІхТБЕ буфере (0,089 М трис-НС1; 0,089 М борная кислота; 0,002 М ЭДТА, рН=8,0). Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25%) бромфенолового синего, 0,25% ксиленцианола и 15%о фикола.
Анализ полиморфизма диаллельных локусов Y-хромосомы Анализ диаллельных маркеров нерекомбинирующей области Y-хромосомы проводился по следующим 33 локусам: М9, М89, YAP (Ml), Ml 74, М40, М35, Ml30, M48, 12f2, M267, Ml72, M201, M342, PI5, Ml70, M253, P37, M231, Tat(M46), P43, Ml28, M20, Ml75, M70, 92R7, M207, M242, M306, SRY1532, M73, M269, M124, LLY22g. Классификация маркеров согласно протоколам "The Y chromosome consortium" [YCC, 2002; Jobling M.A. and Tyler-Smith C, 2003]. На рис 2 представлено филогенетическое древо диаллельных гаплогрупп Y-хромосомы, предложенное консорциумом по изучению Y-хромосомы (YCC) [YCC, 2002].
Анализ полиморфизма 33 диаллельных локусов Y хромосомы включал ІТЦР - амплификацию с последующим ПДРФ - анализом и секвенирование. Полиморфизм локусов YAP и 12f2 анализировали без проведения рестрикции. Детекция полиморфных нуклеотидных замен в остальных 9 локусах (Ml 24, М201, М48, Р15, М128, М70, М73, М342, М267) проводили с помощью секвенирования ПЦР - продуктов. (Анализ полиморфизма диаллельных локусов Y хромосомы проводился на базе Эстонского биоцентра (г. Тарту, Эстония). Амплификация проводилась на термоциклере «Biometra UNOII» в объеме 15-20 мкл. Реакционная смесь включала 1/10 объема ПЦР-буфера (750 мМ трис-НС1, рН 9,0; 200 мМ (NH4)2S04 0,1%; Tween 20) 2,5 мМ MgCl2, 0,125-0,2 ед. Taq-ДНК полимеразы, по 0,2 пМ праймеров, 1-3 мкл ДНК. Последовательности праймеров представлены в таблице 3.
Анализ полиморфизма Alu-инсерционных локусов в популяциях Дагестана
Было проведено генотипирование 12 аутосомных Alu-инсерционных локусов (PV92, В65, ТРА25, АСЕ, АРОА1, А25, Ya5NBC123, Ya5NBC27, Ya5NBC182, Ya5NBC148, Ya5NBC51, Ya5NBC102) у 617 неродственных индивидов из девяти коренных этнических групп Дагестана (аварцев, даргинцев, лезгинов, табасаранцев, чамалинцев, багуалинцев, андийцев, кумыков и караногайцев). На основе исторических данных, коренные жители Дагестана были подразделены на две группы: этнические группы автохтонного происхождения и неавтохтонного происхождения [Османов М.О., 2002]. Под этнической группой неавтохтонного происхождения здесь понимается этническая общность, сложившаяся не на основе местных племен Дагестана. Караногайцы, занимающие северные степные районы, отнесены к представителям неавтохтонного населения Дагестана. В группу этносов автохтонного происхождения вошли все остальные. По результатам генотипирования были проведены оценки частот Alu-инсерций в каждом локусе и подсчитаны стандартные ошибки, которые сведены в таблицу 4.
Во всех выборках по каждому л оку су было протестировано распределение генотипов на соответствие распределению Харди-Вайнберга. Из 108 проведенных тестов семь показали значимое отклонение от равновесия Харди-Вайнберга (табл. 5). При справедливости нулевой гипотезы на 108 тестов в среднем ожидается 5,4 случайных значимых отклонений, если за уровень значимости взят а=5%. Поскольку в нашей работе все значимые отклонения были выявлены в разных локусах и в разных популяциях, то можно считать, что систематические ошибки в результатах генотипирования отсутствуют. Результаты тестов равновесия Харди-Вайнберга свидетельствуют о том, что допущение о селективной нейтральности по отношению к выбранным локусам является справедливым.
Результаты попарного сравнения всех популяций по частотам аллелей показали, что статистически значимые отличия наблюдались не между всеми группами (табл. 6). Частоты аллелей у жителей горных районов (андийцы, даргинцы, табасаранцы, лезгины, чамалинцы, багуалинцы и аварцы) статистически значимо отличаются от частот аллелей у степных жителей (кумыки и караногайцы). Среди жителей горных районов только андо-дидойские группы (андийцы, чамалинцы, багуалинцы) показали значимые отличия частот от остальных ірупп. Аварцы, даргинцы, табасаранцы и лезгины, наиболее многочисленные этнические группы Дагестана, не отличаются значимо по частотам аллелей. Согласно проведенным Хи-квадрат тестам, аварцы, даргинцы, лезгины и табассаранцы, которые по численности составляют больше половины всего населения Дагестана, являются генетически гомогенными. Оценки средней ожидаемой гетерозиготности по 12 локусам в популяциях Дагестана представлены в виде гистограммы на рис. 3.
Учитывая 95%-й доверительный интервал, различия показателей гетерозиготности между популяциями следует считать статистически не значимыми. Если предположить, что полученные оценки, несмотря на величину ошибки, правильно отражают соотношение генеральных значений гетерозиготности, то изучаемые популяции можно выстроить в следующий ряд. Наименьшие значения зарегистрированы у двух горных изолятов: чамалинцев (0,38) и багуалинцев (0,37). Для остальных популяций, проживающих в горных и предгорных селениях, характерны промежуточные значения (0,39-0,4). Самая высокая гетерозиготность наблюдается у караногайцев (0,43) - жителей северных степных районов Дагестана. Наиболее вероятным объяснением данному феномену является то, что дрейф генов в небольших субпопуляциях приводит к отклонению частот аллелей от средних значений для всей популяции и стремлению принять крайние значения. В результате этого снижается показатель гетерозиготности. Последствия инбридинга, для показателя гетерозиготности при значениях коэффициента F=0,005 в популяциях со смешанной системой брачных отношений (родственные и неродственные браки), по всей видимости, мало ощутимы. Это, прежде всего, связано с тем, что скорость снижения гетерозиготности очень медленная, и, во-вторых, последствия инбридинга быстро стираются за одно поколение случайного скрещивания [Хедрик Ф., 2003].
Выраженная этническая подразделенность и особенности брачной структуры являются основными характеристиками народов Дагестана [Гаджиев А.Г., 1972; Булаева К.Б. с соавт., 2003; Bulayeva К.В. et al, 2003]. Учитывая небольшую численность большинства этнических групп, а также действие изоляции следует ожидать, что генная дифференциация между локальными группами должна быть более выраженной, чем- в других популяциях. Показатель генной дифференциации Gst, рассчитанный по одиннадцати локусам для всех изученных популяций Дагестана, составил 0,04, что в два раза выше, чем для популяций Европы, (Gst=0,02), рассчитанный по тому же набору локусов [Watkins W.S. et al., 2003].
