Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Соматическая гибридизация высших растений 10
2. Методы конструирования растительной клетки . 1.2. мутанты клеток растений 16
3« Приемы селекции соматических гибридов 20
4. Трансмиссионная генетика процесса парасексуальной гибридизации близкородственных видов 24
1.4.1. Судьба ядерных генов при гибридизации соматических клеток растений 25
1.4.2. Двуродительское наследование и митотическая сегрегация плазмагенов при соматической гибридизации 28
1.5. Трансмиссионная генетика процесса отдаленной гибридизации 32
2. Плазмиды Agrobacterium turaefaciens как векторы для генетической инженерии высших растений . 36
2.2. Структура и функции Т-ДБК 41
2.3. Перенос чужеродных генов в растительную клетку
Материалы и методы 52
Глава I. Получение и анализ гибридов соматических клеток Nicotiana plumbaginifolia + N.tabacum (трансформированная Agrobacterium tumefaciens клеточная линия) 65
1.1. Гибридизация и выделение продуктов слияния 66
1.2. Анализ клеточных линий 67
1.3. Анализ клонов, полученных из единичных гетерокариоцитов 69
Глава 2. Получение и анализ межтрибных гибридов соматических клеток Atropa belladonna + Nicotiana tabacum (опухолевый штамм) 77
2.1. Слияние протопластов и отбор гибридов табак + красавка 77
2.2. Индукция морфогенеза у клеточных линий 79
2.3. Биохимический анализ гибридных линий табак + красавка
2.3.1. Судьба ядерных генных детерминант 80
2.3.2. Судьба внеядерных генных детерминант 83
2.4. Цитогенетический анализ гибридных клеток 84
Глава 3. Изучение признаков, связанных с экспрессией генов Т-района у соматических гибридов Nicotiana + Atropa
3.1. Активность лизопиндегидрогеназы 97
3.2. Супрессия стеблевого органогенеза 99
3.3. Супрессия ризогенеза 100
3.4. Способность к гормононезависимому росту и росту на D -лактозе 101
3.5. Устойчивость к 2-аминоэтилцистеину (АЭЦ) 101
3.6. Устойчивость к 5-бромдезоксиуридину (БрДУ) 104
3.7. Устойчивость к 5-метилтриптофану (МТ) 107
Глава 4. Отдаленная гибридизация
4.1. Выделение и анализ межсемейственных гибридов клеток в комбинации видов Vicia faba +Nicotiana tabacum (опухолввый штамм) 112
4.2, Эксперименты по гибридизации опухолевых клеток табака с мезофильными клетками кукурузы и ячменя 115
Обсуждение полученных результатов 121
Выводы 137
Литература 139-176.
- Соматическая гибридизация высших растений
- Гибридизация и выделение продуктов слияния
- Слияние протопластов и отбор гибридов табак + красавка
- Активность лизопиндегидрогеназы
- Выделение и анализ межсемейственных гибридов клеток в комбинации видов Vicia faba +Nicotiana tabacum (опухолввый штамм)
Соматическая гибридизация высших растений
Цель данного раздела заключается в ознакомлении с новейшими возможностями создания реконструированных форм растений,основанными на применении экспериментальной техники парасексуальной /соматической, неполовой/ гибридизации путем слияния протопластов. В задачи обзора входит также краткий анализ генетических процессов, обусловленных гибридизацией, и оценка новизны синтезируемых растительных форм.
Такого рода необычная гибридизация, в которой в качестве родительских клеток участвуют соматические либо культивируемые in vitro клетки, является альтернативой половому скрещиванию, т.е. процессу гибридизации, в котором принимают участие гаметы. Соматическая гибридизация стала реальностью, с одной стороны, благодаря разработке метода культуры клеток и тканей растений, а с другой - метода изолированных протопластов. Успехи, достигнутые за последние несколько десятилетий в области культуры клеток и тканей, позволили исследователю выращивать на специально разработанных питательных средах растительные клетки in vitro в неорганизованном состоянии. При изменении условий культивирования, в частности, соотношения фитогормонов в питательных средах,клетки можно вернуть к организованному росту и регенерировать целые организмы-растения. Метод культуры клеток и тканей, таким образом, позволяет исследователю возвращать клетки высокоспециализированных тканей в дедифференцированное состояние, в котором они могут находиться длительное время, необходимое для проведения с ними тех или иных опытов, а кроме того, экспериментатор может вынудить клетки снова вернуться к организованному росту благодаря экспериментально реализуемому свойству растительной клетки
Интенсивное развитие метода изолированных протопластов началось с разработки энзиматических приемов выделения больших количеств протопластов /Cocking , I960/, сущность которых заключается в использовании ферментных препаратов для гидролиза жесткой целлюлозно-пектиновой клеточной оболочки растений. В настоящее время в этой области достигнуты большие успехи, о чем свидетельствует множество /более 1500/ публикаций по изолированным протопластам, проведение международных симпозиумов, конференций, конгрессов, последние из которых: У Международный конгресс по культуре тканей растений, проведенный в июле 1982г. в г.Токио, УІ Международный симпозиум по протопластам, проходивший в августе 1983г. в Базеле. Следует заметить, что сама техника выделения больших количеств протопластов уже. стала рутинной процедурой, а наиболее згзким местом технологии работы с протопластами является подбор условий культивирования и, в частности, выяснение состава питательных сред. Невзирая на то, что формулы сред уже разработаны для протопластов около 200 видов растений /в том числе табак, петунья, дурман, перец, картофель, томаты, красавка, соя, вика, морковь и др. - см. обзоры Глеба, Сытник, 1982; 1984/, пока не достигнуто больших успехов в культивировании протопластов злаков /обзор Dale , 1983/; у последних единичные положительные результаты получены лишь применительно к рису /Anonymous ,1975/, кукурузе / Potrykus et ai., 1977/ и некоторым другим видам / Va-sil, Vasil , 1980; 1981; Chourey, Zurawsky , 1981/.
Гибридизация и выделение продуктов слияния
Были поставлены два эксперимента по слиянию клеток. В первом опыте слияние каллусных и мезофильных гаплоидных протопластов индуцировали при помощи полиэтиленгликоля и буфера с "высоким содержанием ионов Са44" и высоким рН" по методике К.Као (као, 1977), после чего клетки культивировали в течение трех недель на гормонеодержащей среде M0-I. В течение первых суток у родительских и гибридных клеток ресинтезировалась клеточная стенка, а первые деления наблюдались через 2-3 дня после слияния при культивировании на рассеянном свету. Спустя три недели, образовавшиеся колонии отмывали 0,2 М средой Линсмейер и Скута, лишенной гормонов, и культивировали в ней микроколонии, помещая чашки в темноту. Образовавшиеся в этих условиях клеточные колонии диаметром 2-3 мм, переносили на агаризованную (0,7$) среду того же состава, но без осмотика, и выращивали в условиях культуральной комнаты при интенсивном освещении (4-5 Клюке). Всего в опыте обнаружено 16 колоний, способных к быстрому росту и позеленению на лишенной гормонов среде; в дальнейших пересадках на ту же среду однако, выжили лишь девять колоний, а одна была утеряна вследствие инфекции. Таким образом, в настоящее время у нас имеются коллекции клеток восьми линий, которые и были подвергнуты анализу. Поскольку принятая в этом опыте процедура выделения гибридов не гарантирует одноклеточного их происхождения, мы называем этот материал клеточными линиями; в работе они обозначаются номерами от I до 9.
Во втором эксперименте слияние индуцировали согласно методике Л.Менцеля с соавторами ( Menczel et al.,1981). После гибри - 67 дизации клетки культивировали в среде КЗ (Nagy, Maiiga, 1976) в течение 6 дней, после чего делящиеся гетероплазмические продукты слияния (стадия 2-3-х делений) отлавливали с помощью микропипетки на I мкл и культивировали в микрокаплях в чашках Куп-рака как описано Ю.Глебой (Gleba , 1978). Спустя месяц, образовавшиеся колонии высаживали либо сразу на лишенную гормонов среду Линсмейер и Скуга (клоны 1-І и 1-2), либо культивировали в течение еще одного месяца на гормоносодержащей среде, а затем пересаживали на безгормональную среду с целью индукции морфогенеза. Всего выделено 19 делящихся продуктов слияния, выжило из которых только девять, которые и были проанализированы. Клетки всех клонов (этот термин здесь уместен, поскольку речь идет о клеточных культурах, каждая из которых происходит от единичного продукта слияния; для обозначения клонов принята нумерация от 1-І до 1-9) оказались способными к росту как на гормонсодержащей, так и на лишенной гормонов среде. Как и клетки исходной опухолевой линии табака, клетки всех гибридных линий и клонов были способны к росту на питательных средах с D-лактозой (14 мМ), используемой в качестве единственного источника углеводов (xianghui, Schie-der, 1981).
Попытки индукции морфогенеза во всех клеточных линиях и гибридных клонах, за исключением клона 1-І, из клеток которого регенерировали нормальные растениям, pliimbagenifolia , оказались безуспешными независимо от состава питательных сред и условий культивирования (рис. 5).
Слияние протопластов и отбор гибридов табак + красавка
При половом скрещивании видов высших растений, относящихся к различным таксономическим трибам, не удается получить гибридное потомство. В противоположность этому применение техники пара-сексуальной гибридизации, основанной на слиянии протопластов, позволило некоторым экспериментаторам получить такого рода клеточные гибриды, часть из них обнаруживала способность к регенерации морфологически ненормальных растений (см. обзоры Глеба, Сытник, 1982, 1984; Gleba, Evans , 1983).
В наших опытах эта возможность была использована в экспериментах по гибридизации опухолевых клеток табака (Nicotiana ta-bacum Ь. , сорт Белый Барлей), трансформированных штаммом Agro-bacterium tumefaciens Вб S3 , и мезофильных протопластов красавки, Atropa belladonna Ь. Селекция гибридов основывалась на использовании селективных маркеров клеток корончатых галлов табака, кодируемых Т-районом /гормононезависимость и неспособность к позеленению (регенерации)/ В этой работе нас интересовало поведение генов Т-области в синтезированных путем слияния протопластов гибридных клетках табак + красавка. Наиболее интересным казался вопрос о возможности восстановления морфогенетических способностей, подавляемых генами Т-района в опухолевых клетках (sohell et ai., 1984), в результате такого рода гибридизации.
Активность лизопиндегидрогеназы
В результате опухолевой трансформации в клетках исходной линии табака (B6S3 ) синтезируется необычная аминокислота октопин, отсутствующая в нормальных клетках. Как показали результаты опытов, проведенных в лаборатории Дж.Шелла ( Schroder et aL, 1981), синтез октопина в опухолевых клетках осуществляет фермент лизопин-дегидрогеназа, кодируемый геном, соответствующим транскрипту 3 Т-ДНК. Исследования Г.Вуллемса с сотрудниками ( Wullems et al., 1980) и наши собственные данные (Каневский и др., 1983) показали, что при гибридизации опухолевой (табак) и нормальной ( N.tabacum иы. plumbaginifolia ) клеток признак активности лизопиндегидро-геназы наследуется как доминантный (семидоминантный). При изучении соматических гибридов табака и красавки лизопиндегидрогеназ-ная активность обнаружена в клетках всех 23-х исследованных линий (см. главу 2). Следует обратить внимание, что в клетках красавки обнаружено низкомолекулярное сюединение, окрашиваемое раствором фенантрохинона и занимающее при электрофорезе промежуточное положение между октопином и аргинином, которое синтезируется наряду с октопином в клетках ряда гибридов. В этих экспериментах, проводимых трижды, мы обнаружили нестабильность уровня экспрессии лизопиндегидрогеназы в культуре клеток родительской линии табака. Часто при нанесении 5-Ю мкл реакционной смеси на бумагу спустя 60-и минутной инкубации, соответствующий табаку трек оказывался "пустым", в то время как у гибридов в таких же количествах экстракта пятна октопина всегда выявлялись достаточно интенсивно. Лишь увеличивая объем наносимого образца в 2-2,5 раза удавалось обнаружить приемлемые для фотосъемки количества октопина. Интересно заметить, что в работе Г.Слогтерена с сотр. ( Sloghteren et al., 1983) также сообщалось об изменении уровня активности лизопиндегидрогеназы на различных стадиях дифференцировки опухолевых клеток. В этих опытах показано, что октопин активно синтезировался лишь в трансформированных клетках регенерантов, но не каллусных тканях.
Таким образом, у всех исследованных нами потомков ген синтеза октопина при гибридизации клеток табака и красавки сохранялся и активно экспрессировался как в каллусной культуре клеток, так и в клетках регенерантов (12 линий), что позволяет говорить о доминантном характере наследования и экспрессии этого, контроли - 99 руемого Т-ДНК, признака в гибридах соматических клеток данной комбинации видов.
Выделение и анализ межсемейственных гибридов клеток в комбинации видов Vicia faba +Nicotiana tabacum (опухолввый штамм)
Выделение протопластов из клеток опухолевого табака и листа конских бобов проводилось как описано в разделе "Материалы и методы". Слияние проводили по методике Л.Менделя с сотр. (Menczel et al. , 1981). Визуально оцениваемая частота образования гибридных клеток составляла около 15-20$. После слияния клетки культивировали в среде М0-І ( Gleba et al., 1982) при 28С на рассеянном свету в течение 3-х недель, постепенно снижая осмотическое давление маннита с 0,4 до 0,2 М. Спустя месяц, часть материала на этом этапе использовали для цитологических исследований, для чего клетки фиксировали 3%-тм раствором глютаральдегида и спирт-уксусной смесью (3:1), окрашивали 1% раствором ацетоорсеина и готовили давленные препараты хромосом. Учитывая морфологические различия родительских хромосом (у конских бобов они в 3-4 раза длиннее хромосом табака), вели поиск метафазных пластинок гибридных клеток, В ряде случаев были обнаружены клетки с полным набором хромосом табака и несколькими хромосомами конских бобов. Фотографии метафазной пластинки такой гибридной клетки представлены на рис. 16 А,Б. Данные цитологического анализа через месяц после слияния протопластов однозначно показали, что при межсемейственной гибридизации клеток табака и конских бобов происходит слияние клеток и их ядер, и образующиеся гетерокариоциты способны к делению. Вместе с тем наши исследования свидетельствовали, что в процессе деления клеток гибридов происходит элиминация хромосомного материала бобов.
Основная часть материала была использована для селекции гибридных линий; в основу отбора легли: а) способность гибридов к автономному росту на лишенных гормонов средах (признак опухолевой клетки) плюс б) способность к позеленению/регенерации побегов на свету (признак нормальной клетки). Используя селективные условия, нам удалось отобрать около 30 плотных зеленых колоний. После нескольких пассажей на лишенной гормонов среде с D-лактозой хороший рост сохранили 15 линий; 7 из них,однако, быстро утратили способность к позеленению и фенотипически ничем не отличались от родительской линии опухолевого табака.Это явление может быть связано либо с быстро! элиминацией хромосом и/или пластид бобов, либо с химерностью линий с предпочтительным быстрым размножением клеток табака в смешанной популяции клеток. В результате проведенной работы мы получили коллекцию из 8 зеленеющих на свету гормононезависимых клеточных линий, которые и были подвергнуты различным анализам.
Тщательный цитологический анализ всех 8 клеточных линий через 8 месяцев после слияния протопластов не позволил нам выявить метафазы с морфологическими типами хромосом конских бобов. Однако биохимический анализ множественных молекулярных форм эстера-зы позволил обнаружить гибридность по этому критерию второй линии, имевшей изоферменты, видоспецифические как для табака, так и для конских бобов (см. рис. 17 А). Аналогичным образом подтверждена гибридная природа четвертой линии при анализе множественных молекулярных форм амилазы (см. рис. 17 Б). Полученные результаты вместе с цитологическим анализом приводят к следующему заключению. Данный материал (линия 2 и 4) не может быть химерным, так как смесь родительских клеток при биохимических анализах давала бы при электрофорезе сумму изоферментных спект - 114 - . ров обоих родительских типов для обоих ферментов, цитологический же анализ обнаружил бы и клетки бобов. Наиболее реальным кажется предположение, что в данном случае мы имеем дело с глубоко асимметричными клеточными гибридами, содержащими полный (или почти полный) набор хромосом опухолевого табака и небольшие фрагменты хромосом конских бобов, не обнаруживаемые при хромосомном анализе. Вполне вероятно, что после слияния ядер обоих родителей и последующей элиминации хромосом бобов происходят процессы рекомбинации /реконструкции хромосом либо транслокации генов бобовых на хромосому/мы табака с последующей их экспрессией - в данном случае это имеет место в отношении генов, кодирующих синтез эстераз у линии 2 и амилаз у линии 4, а также генов, определяющих способность клеток к позеленению на свету. Таким образом, очевидно, что клетки линий 2 и 4 являются хромосомными сегрегантами гибридных продуктов табак + конские бобы.
