Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Растительные системы в фармакологии и медицине 12
1.1.1. Преимущества растительных систем 12
1.1.2. Растительные продуценты 14
1.1.2.1. Растения — продуценты рекомбинантных белков 15
1.1.2.2. Растения - продуценты рекомбинантных антител 17
1.1.2.3. Растения - вакцины 21
1.2. Биотехнология растений 26
1.2.1. Методы трансформации растений 26
1.2.1.1. Агробактериальная трансформация 37
1.3. Вопросы, возникающие при создании трансгенных растений — продуцентов фармакологически значимых белков 54
1.3.1. Отбор трансгенного материала :...54
1.3.2. Наследование перенесенных генов /. :.56
1.3.3. Экспрессия гетерологичных генов 57
1.3.4. Гликозилирование белков в растительных системах 60
1.3.5. Эффективность растительных систем (накопление целевого продукта)64
1.4. Иммуностимуляторы для животноводства 69
1.4.1. Интерферон и его функции 71
1.4.1.1. Классификация интерферонов 72
1.4.1.2. Участие у-интерферона в системе иммунного ответа 73
1.4.2. Создание и применение препаратов у-интерферона в медицине и
ветеринарии 76
ГЛАВА II. Материалы и методы 80
1. Растительный материал 80
1.1. Стерилизация семян 85
1.2. Условия культивирования растительного материала 85
1.3. Селекция трансгенных растений табака и гороха 85
1.2. Штамм Agrobacterium tumefaciens 86
2.1. Условия культивирования агробактериального штамма 87
3. Методы агробактериальной трансформации 88
II.3.1. Метод трансформации листовых дисков табака in vitro 88
П.3.2. Метод трансформации незрелых зародышей гороха in vitro 89
II.3.3. Метод трансформации цветков гороха in vivo 91
П.3.4. Метод трансформации проростков гороха inplanta 91
11.4. Молекулярные методы 92
II.4.1. Выделение геномной растительной ДНК 92
И.4.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacteriam twnefaciens 93
П.4.3. Выделение тотальной растительной РНК 94
П.4.4. Постановка реакции обратной транскрипции 94
11.4.5. ПНР-анализ 95
11.4.6. Разделение продуктов ПЦР-реакций методом электрофореза 97
П.4.7. Экстракция цитоплазматических белков из растительного материала.97
И.4.8. Фракционирование белков с помощью сульфата аммония 98
II.4.9. Диализ белковых проб 98
П.4.10. Разделение белков методом электрофореза в ПААГ 99
11.4.11. Окрашивание гелевых пластин 100
11.4.12. Вестерн-блот анализ 100
11.4.13. Дот-блот анализ 102
11.5. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей 103
П.5.1. Серологический анализ крови 103
И.5.2. Иммуноферментный анализ 104
11.6. Статистические методы и компьютерная обработка 105
П.6.1. Статистические методы 105
П.6.2. Построение денситограмм 105
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение 106
Ш.1. Получение линий трансгенных растений табака — продуцентов у-интерферона, характеризующихся стабильным наследованием и высоким уровнем экспрессии гетерологичного гена 106
III. 1.1. Анализ наследования гена у-интерферона у трансгенных растений табака (ТГТ3) 107
III. 1.2. Анализ уровня и стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (То-Т3) 111
III. 1.2.1. Анализ стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (Ti-T3) Ill
III. 1.2.2. Изучение экспрессии гетерологичного гена у-интерферона у потомков исходных трансформантов InterB и Inter311 (ТГТ2) методом ІТЦР- анализа в реальном времени 120
III. 1.3. Анализ белковых проб трансгенных растений табака семей Inter311 и InterB 123
III. 1.4. Изучение активации иммунного ответа у лабораторных мышей 127
III. 1.4.1. Приготовление белкового экстракта, содержащего у-интерферон из трансгенных растений табака линии Inter.311.2 127
III. 1.4.2. Анализ активности у-интерферона, выделенного из трансгенных растений линии Inter311.2 на лабораторных мышах 129
Ш.2. Создание «съедобных» иммуномодуляторов на основе растений гороха 138
III.2.1. Трансформация культуры гороха in vitro 139
Ш.2.1.1. Изучение регенерационной способности растений гороха в условиях in vitro 139
Ш.2.1.2. Изучение корнеобразования у растений гороха в условиях in vitro 140
Ш.2.1.3. Изучение влияния селективного агента Km на процесс трансформации и определение сублетальной концентрации Km для
культуры гороха 142
Ш.2.2. Трансформация гороха in vivo 148
III.2.2.1. Трансформация цветка 148
Ш.2.2.2. Трансформация проростков гороха inplanta 149
Заключение 152
Выводы 155
Список литературы
- Преимущества растительных систем
- Вопросы, возникающие при создании трансгенных растений — продуцентов фармакологически значимых белков
- Условия культивирования агробактериального штамма
- Анализ уровня и стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (То-Т3)
Введение к работе
Генетическая инженерия растений является относительно молодой и интенсивно развивающейся областью современной биотехнологии. Разработанные к настоящему времени методы молекулярной генетики и клеточной инженерии позволяют целенаправленно, по заранее намеченной программе модифицировать геном растения, используя генетическую информацию из разных геномов.
Одним из важных направлений в этой области является создание растений - продуцентов разнообразных фармакологических соединений. Оно позволяет сделать недорогими и, следовательно, общедоступными, многие фармацевтические препараты. В этом плане наилучшими продуцентами считаются микроорганизмы. Однако в ряде случаев существуют серьезные ограничения для использования микроорганизмов в качестве продуцентов фармакологических соединений. В этой ситуации растительные системы являются прекрасной альтернативой микроорганизмам.
При создании трансгенных растений и их внедрении в качестве коммерческих культур наиболее важным моментом является стабильное наследование и стабильно высокая экспрессия перенесенных генов. Показано, что в геноме трансгенных растений гетерологичные гены наследуются, как правило, доминантно по классическим законам Менделя (Potrykus et al., 1985; Budar et al., 1986). Однако функционирование целевых генов в окружении растительного генома может быть различным. Так, в литературе описано множество случаев широкой вариабельности экспрессии трансгенов среди индивидуальных трансформантов, а также случаи их полной инактивации. Таким образом, при создании растений-продуцентов необходимо комбинировать новейшие биотехнологические подходы с традиционными селекционно-генетическими методами, что позволит создавать высокоэффективные, стабильные растительные продуценты, необходимые для современного мира.
Актуальность проблемы. Данная диссертационная работа посвящена получению и изучению трансгенных растений табака и гороха, синтезирующих бычий у-интерферон.
Вирусные и бактериальные заболевания сельскохозяйственных животных приводят к значительным потерям, вследствие падежа или потери
продуктивности. Важным этиологическим фактором таких заболеваний является снижение устойчивости организма к возбудителям, возникающее на фоне различных иммунодефицитов. Анализ причин заболеваемости показал, что основной ущерб животноводству наносят факторные инфекции, клинически проявляющиеся у маточного поголовья в нарушении репродуктивной функции, а у молодняка - в диарейных и респираторных синдромах. Исследование данного вопроса привело к заключению, что высокая частота инфекций сельскохозяйственных животных обусловлена постоянным присутствием неблагоприятных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов.
Широкое и бессистемное применение антибиотиков, нитрофуранов, сульфамидных препаратов (без учета чувствительности к ним микроорганизмов, циркулирующих в хозяйствах) не всегда дает положительный результат, и приводит, как правило, лишь к угнетению иммунного ответа у животных. В связи с этим, становится актуальным применение препаратов, обладающих свойствами иммуномодуляторов, обладающих противовирусным и антибактериальным действием.
В настоящее время большие надежды связывают с препаратами
интерферонов, являющихся неспецифическими средствами защиты организма
от вирусных инфекций. Для интерферонов характерными являются
противовирусные, иммуностимулирующие, антибактериальные и
антиканцерагенные свойства.
Таким образом, растения-продуценты у-интерферона могут стать эффективными и легкоприменимыми на практике иммуномодуляторами, применяемыми при инфекционных заболеваниях и иммунодефицитах других этиологии.
Цели и задачи работы. Цель данной работы состояла в получении трансгенных линий табака и гороха, стабильно наследующих и экспрессирующих гетерологичный ген у-интерферона. В соответствии с^этим в работе были поставлены следующие задачи:
1. Получение линий трансгенных растений табака — продуцентов у-
интерферона, характеризующихся стабильным наследованием и высоким
уровнем экспрессии гетерологичного гена:
a. анализ наследования гетерологичного гена IFNG (ген кодирующий
бычий у-интерферон) у трансгенных растений табака (Т0-Т3);
b. анализ уровня и стабильности экспресиии гена IFNG у независимых
трансформантов табака в ряду поколений Т0-Т3;
c. анализ трансгенных растений табака на наличие гетерологичного
белка у-интерферона.
Изучение индукции иммунного ответа у мышей при пероральном введении растительных экстрактов табака, содержащих у-интерферон, включающее анализ формулы крови и анализ общего титра Ig (иммуноглобулинов).
Подбор оптимальных методов для получения трансгенных линий гороха, стабильно наследующих и экспрессирующих ген IFNG
a. изучение способности к регенерации и трансформации сортов;
b. подбор методов для укоренения регенерантов гороха;
c. анализ трансгенных растений гороха на наличие и экспрессию гена
IFNG в поколенях Т0-Т4.
Научная новизна. В ходе выполнения данной работы впервые были получены трансгенные линии табака и гороха, синтезирующие бычий у-интерферон и характеризующиеся стабильным наследованием и экспрессией гетерологичного гена IFNG в ряду поколений Т0-Т3 и Т0-Т4, соответственно. Для трансгенных растений табака показана изменчивость экспрессии гена IFNG у линий InterB и Inter311. Показано наличие гетерологичного белка у-интерферона в трансгенных растениях табака и гороха. Показана индукция иммунного ответа у мышей в результате перорального введения растительных экстрактов табака, содержащих бычий у-интерферон.
Впервые предложена методика трансформации гороха in vitro, позволяющая получать трансгенные растения через 4 месяца:
a. подобраны условия регенерации и укоренения при
агробактериальной трансформации гороха in vitro;
b. впервые использован метод опудривания ИМК (индолил-масляной
кислотой) для укоренения регенерантов гороха.
Практическая ценность. Показано, что сконструированный
агробактериальный вектор, содержащий ген бычьего у-интерферона под
контролем конститутивного промотора 35S, может быть использован для
получения растений-продуцентов бычьего у-интерферона. Трансгенные линии табака и гороха, синтезирующие у-интерферон, могут быть использованы в качестве иммуномодуляторных средств в ветеринарии. Разработанная методика агробактериальной трансформации гороха in vitro, может быть использована для получения разнообразных продуцентов на основе данной культуры, а также для изучения молекулярной генетики гороха.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на следующих конференциях, симпозиумах и конгрессах: Ш-й съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: Москва, 25-27 октября 2005 г.; вторая международная научно-практическая конференция "Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности": Санкт-Петербург, 7-9 января 2006; 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых: "Биология — наука XXI века". Пущино, 17-21 апреля 2006; Международная научная школа - конференция молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях". Звенигород, 7-12 декабря 2008; V-й Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, 16-20 марта 2009.
Кроме того, материалы диссертационной работы были представлены на международной биотехнологической выставке в Германии - Biotechnology exhibition: "Biotechnica". Ганновер, 9-11 октября 2007.
Материалы диссертационной работы представлены в виде устных докладов на отчетных семинарах лаборатории генной и клеточной инженерии растений СПбГУ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводы, список литературы (372 источников). Работа изложена на 179 страницах и содержит 40 рисунков и 33 таблиц.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 6 тезисов: 1. Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л.А. Модификация методов агробактериальной трансформации in vitro и in vivo для получения трансгенных растений моркови и гороха. // Вестник биотехнологии и
физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. М.: 2005. Т.1.
№1. с.37-46.
Дудник Е.Э., Савельева Н.В., Лутова Л.А. Создание растений -биопродуцентов бычьего интерферона-гамма. // Материалы III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. М.: 25-27 октября, 2005. с. 108-109.
Дудник Е.Э., Савельева Н.В., Лутова Л.А. Получение трансгенных растений табака {Nicotiana t'abacum L.) с гетерологичными генами nptll и IFN-y. //Сборник трудов второй международной научно-практической конференции "Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование". СПб: 07-09 января, 2006. с. 235-236.
Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л.А. Анализ наследования гетерологичного гена интерферон-гамма (IFN-y) у трансгенных растений W. tabacum L. //Сборник тезисов "Биология - наука XXI века. 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых". Пущино: 17-21 апреля, 2006. Стр. 368.
Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л.А. Создание и анализ трансгенных растений - продуцентов бычьего гамма-интерферона. //Сборник статей. "Биотехнология будущего". Международная школа-конференция молодых ученых. в рамках Международного Симпозиума «ЕС — Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной Программе». Санкт-Петербург. 5-9 июня. 2006. с. 79-80.
Лупышева Ю., Дунаева С, Пендинен Г., Новикова Л., Савельева Н., Лутова Л., Гавриленко Т. Регенерации и трансформация сортов малины и ежевики в культуре in vitro. Вестник СПбГУ, Серия 3 — Биология, Выпуск 2. — 2008. с. 28 - 35.
Дудник Е., Курдюков И., Савельева Н., Емельянов В., Лутова Л. Трансгенные растения - продуценты у-интерферона быка. Международная научная школа — конференция молодых ученых "Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях" - 7 - 12 декабря 2008, Звенигород, Россия. С. 25.
Савельева Н.В., Дудник Е.Э., Лутова Л.А., Трансгенные растения с геном интерферона- у (IFNG) как иммуностимуляторы для крупного рогатого скота. Сборник трудов БиНИИ СПбГУ №54, 2008. с. 25-30.
Савельева Н., Курдюков И., Дудник Е., Емельянов В., Падкина М., Лутова Л. Растения-продуценты бычьего гамма-интерферона для профилактики туберкулеза и лейкемии крупного рогатого скота. Вестник СПбГУ. Серия 3. 2009. (в печати).
Савельева Н.В., Курдюков И.Д., Дудник Е.Э., Емельянов В.В., Лутова Л.А. Создание растительных продуцентов бычьего у-интерферона. Пятый Московский международный когресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" - 16-20 марта 2009, Москва, Россия. С. 348
Благодарности. В разные периоды работа была поддержана следующими грантами: РНП-608 и РФФИ 08-04-13744-офи_ц, CRDF-ST-012-0, NWO-РФФИ.
Автор выражает искренную благодарность и признательность своему научному руководителю д.б.н., проф. Лутовой Людмиле Алексеевне за предоставленную возможность выполнить данную диссертационную работу на базе лаборатории генной и клеточной инженерии растений СПбГУ, за оказание всесторонней помощи и поддержки на разных этапах ее выполнения.
Кроме того, автор приносит свою благодарность сотрудникам лаборатории генной и клеточной инженерии растений СПбГУ Емельянову Владиславу Владимировичу, помогавшему проводить белковый анализ трансгенных растений и опыты по тестированию трансгенных растений на мышах, Матвеевой Татьяне Валерьевне за консультации по методу ГЩР-анализа в реальном времени, Ходжайовой Лоле Тельмановне за предоставленный вектор и семена трансгенных растений табака.
Автор признателен сотрудникам лаборатории биохимической генетики СПбГУ Смирнову М.Н., Падкиной М.В., Самбук Е.В. и Градобоевой А.Е. за предоставленный ген бычьего у-интерферона, консультации по молекулярному клонированию и Вестерн-блот-анализу.
Преимущества растительных систем
Применение растительных систем в качестве продуцентов разнообразных веществ в фармацевтической промышленности является одним из актуальных направлений метаболической инженерии, направленной на реализацию трансгенной клеткой новых биохимических реакций (Рукавцева Е.Б. и др., 2006).
Вследствие эукариотической организации генома, растения являются одним из наиболее привлекательных объектов для этой области биотехнологии. Обладая богатым природным биохимическим потенциалом, растения могут быть великолепными источниками разнообразных веществ: Сахаров, ароматических соединений, жирных кислот, стероидных соединений и других биологически активных веществ, многие из которых сами по себе представляют большую ценность для фармакологии и медицины (Рукавцева Е.Б. и др., 2006). Универсальность аппарата транскрипции и трансляции растений позволяет использовать их не только для накопления гомологичных соединений, синтезируемых данным видом растения, но и для синтеза гетерологичных соединений как бактериального, так и животного происхождения (Глеба Ю.Ю., 1998). Это особенно актуально при создании продуцентов биологически активных веществ животного происхождения (белков, антител и т.д.), для которых необходимы процессы созревания и правильной укладки (Thomas B.R. et al., 2002). Известно, что уже к 1982 году более 95 используемых в медицине белков были разрешены к производству с использованием клеточных культур бактерий, дрожжей, насекомых и млекопитающих. Однако, оказалось, что такие системы имели ряд недостатков. Например, в клетках прокариот не происходила посттрансляционная модификация и правильная укладка полипептидных цепей многих эукариотических белков. И, хотя клетки дрожжей, насекомых и млекопитающих были лишены подобных недостатков, их использование в качестве биопродуцентов ограничивалось скоростью роста, трудностью очистки целевого продукта и, соответственно, его высокой себестоимостью. Напротив, растения-продуценты, подобно животным клеткам, были способны вырабатывать активные формы сложных белков с соответствующей посттрансляционной модификацией, например, гликозилированием и укладкой белков, в большинстве случаев сходных с таковыми в клетках млекопитающих (Thomas B.R. et al., 2002).
Важным аспектом растительной биотехнологии является абсолютная биобезопасность использования целевых соединений человеком, получаемых с помощью трансгенных растений. В отличие от культур клеток дрожжей, насекомых и млекопитающих, синтез гетерологичных веществ в растениях исключает риск заражения вирусными патогенами, прионами и эндотоксинами, опасными для млекопитающих (Hellwig S. et al., 2004). Поэтому, получение белков с помощью растительных систем является перспективным направлением.
В настоящее время растения-продуценты считают одним из наиболее дешевых источников получения промышленных веществ, антител, "съедобных" вакцин и фармакологических белков, а так же биополимеров (Yuan L. et al., 1997). Оказалось, что растения являются не только экономически выгодной и безопасной альтернативой для продукции различных веществ по сравнению с микроорганизмами и животными, но и еще удобным естественными резервуарами для "хранения" наработанного рекомбинантного соединения. Кроме того, растения оказались удобным материалом, из которого сравнительно легко выделять целевые продукты. Легкость выделения и очистки рекомбинантного соединения из растительной системы была продемонстрирована на примере работы по получению нейрогормона животных лейэнкефалина. Последовательность гена этого гормона была встроена в ген 2S альбумина — запасного белка семян Arabidopsis thaliana. В результате экспрессии модифицированного гена 2S альбумина были получены семена Arabidopsis thaliana с высоким содержанием рекомбинантного белка. Целевой пептид можно было легко выделить из рекомбинантного белка с помощью протеолитического расщепления, и, кроме того, продукт мог долго храниться в естественном резервуаре - семени (Vandekerckhove J. et al., 1989).
Необходимо отметить также, что экономическая выгода использования растительных систем в качестве биореакторов фармакологических соединений заключается в возможности получения большой биомассы трансгенных тканей на сравнительно небольшом участке земли и при сравнительно небольших трудо- и деньгозатратах, что является важным преимуществом для промышленного производства. Кроме того, разработка методов работы с культурами растительных клеток теперь позволяет выращивать растительную
биомассу в необходимых количествах в условиях in vitro. Возможность нарабатывать большие растительные массы в биореакторах стала значимым этапом развития биотехнологии растений, так как часто продуцентами важных лекарственных веществ являются редкие, занесенные в «Красную книгу» тропические и эндемические растения, которые недоступны для агротехнического производства в умеренных климатических зонах большинства развитых стран мира (Рукавцева Е.Б. и др., 2006). Ярким примером таких растений может послужить женьшень, многолетнее травянистое, лекарственное растение сем. Аралиевых. Данный вид является реликтом широколиственно-хвойных лесов Северо-Восточного Китая, Северной Кореи и Дальнего Востока. В медицинской практике используют корни, содержащие тритерпеновые гликозиды, провитамин А, витамины группы В, Е и F. В природе данный вид растет очень медленно, образовывая 50-80 г корни в течение 5-6 лет. Разработка методов культуры тканей стало позволила получать корневую биомассу женьшеня, пригодную для выделения ценных лекарственных соединений, за 1 месяц (Малышев А.А., 1986).
С момента публикации в 1983 г. первых работ, посвященных получению трансгенных растений табака (Herrera-Estrella L. et al., 1983; Barton К. et al., 1983), генная инженерия растений прошла стремительный путь развития и в настоящее время трансгенные растения оказывают заметное влияние на фармацевтическую промышленность. В данный момент количество фармакологических соединений, синтезируемых в растениях, составляет сотни, и с каждым годом к списку прибавляются новые. Однако, прежде чем перейти к современному состоянию фармацевтической биотехнологии растений, необходимо упомянуть и об одном из первых этапах развития растительной биотехнологии — созданию растений с улучшенными лечебно-диетическими свойствами. Одна из первых работ в этом направлении - это создание сорта "золотого риса", зерна которого богаты витамином А. Данный сорт риса был получен с помощью методов генной инженерии путем введения гена фитоин-синтетазы нарцисса - ключевого фермента, участвующего в биосинтезе р-каротина (провитамина А). Таким образом, употребляя этот сорт риса в пищу, люди могут устранить дефицит витамина А в организме без применения лекарственных препаратов (Burkhardt Р.К. et al., 1997).
Вопросы, возникающие при создании трансгенных растений — продуцентов фармакологически значимых белков
Производство различных продуцентов основано на технологии трансформации - введения в геном продуцента нового гена. Необходимым условием производства чужеродного белка в растениях является стабильность экзогенной ДНК в геноме растения, наследование чужеродного гена в ряду поколений и уровень его экспрессии.
Ввести чужеродную ДНК в растения можно различными способами. Разработанные в настоящее время методы трансформации можно разделить на две группы: методы прямого и методы непрямого переноса чужеродных генов.
Методы прямого переноса чужеродных генов в клетку растения достаточно разнообразны, многие из них были взяты из практики работы с клетками бактерий и животных (Рыбчин В.Н, 1999). Они включают микроинъекции (Neuhaus G. et al., 1987), бомбардировку микрочастицами или баллистический метод (Klein Т. et al., 1987); электропорацию (Fromm Е.М. et al., 1985); обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом и др (Дрейпер Дж. и др., 1991) (табл. 4).
При применении методов прямого переноса используют очищенную плазмидную ДНК, в которой содержатся генетические конструкции с целевыми генами (Турчинович А.А. и др., 2004). В каждом случае, ДНК, кодирующая белок, ассоциирована с промотором обеспечивающим экспрессию либо во всем организме, либо в специфической ткани или на определенной стадии развития растения. Чужеродные гены, как правило, стабильно интегрируются в геном растения и передаются потомкам в последующих поколениях согласно законам Менделя (Дейнеко Е.В., 2004).
Коротко опишем некоторые методы, которые наиболее часто используются для трансформации растений.
Микроинъекции. Метод микроинъекций ДНК стал возможен с появлением прибора для изготовления микропипеток диаметром 0,1-0,5 мкм и микроманипулятора. Он был разработан в начале 70-х годов Андерсоном и Диакумакосом (Diacumakos E.G. et al., 1970; Anderson W.F. et al., 1980). Применение этого метода для введения вектора pBR322, содержащего фрагмент вируса герпеса с геном тимидинкиназы (ТК), оказалось успешным. Было показано, что ген ТК проник в ядра инъецированных ТК"-клеткок и нормально в них реплицировался (Рыбчин В.Н., 1999).
Дальнейшее усовершенствование этого метода, используя хорошее оборудование, позволило за 1 час инъецировать 500-1000 клеток, причем в лучших экспериментах в 50% клеток наблюдается стабильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Преимущество описываемого метода заключается также в том, что он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления (Рыбчин В.Н., 1999).
Электропорация. Настоящий метод основан на создании пор в бислойной липидной мембране (БЛМ) под воздействием электрического поля. Теория электропорации объясняет механизм образования и развития пор в жидких липидных бислоях с помощью перераспределения напряжения на мембране в момент воздействия электрического поля (Weaver J.C., 1993; Weaver J.C. et al., 1996; Glaser R.W. et al., 1988). Строение и состав БЛМ определяют ее физические свойства. При воздействии импульсами электрического поля (напряженностью от нескольких сотен до нескольких тысяч вольт/см и длительностью от десятков микросекунд до десятков миллисекунд) можно вызвать резкий рост проводимости подобных систем, в данном случае БЛМ (Kinosita К.Jr. et al., 1977). Предполагается, что в момент резкого увеличения проводимости в БЛМ возникает локальная перестройка структуры, приводящая к появлению сквозного водного канала. При этом возможны две основных конфигурации поры — гидрофильная и гидрофобная. В гидрофобной поре стенки поры выстланы липидными "хвостами", а в гидрофильной поре — фосфолипидными "головами". При определенных физических условиях энергетически выгодной становится либо гидрофобная, либо гидрофильная поры. Изучение стабильности БЛМ при воздействии электрического поля показало также, что электрический пробой БЛМ определенного состава может быть обратимым (Abidor I.G. et al., 1978). Так, после электрообработки резкое увеличение проводимости БЛМ снижалось до нормальных значений за время от нескольких секунд до нескольких минут в результате восстановления исходного строения бислоя (Weaver J. С. et al., 1996). Кроме того, было выдвинуто предположение, что скорость зарастания пор не зависит от приложенного электрического поля и от плотности пор на бислое. Это предположение было подкреплено экспериментально (Weaver J. С. et al., 1996). Таким образом, для применения данной теории на практике достаточно приложить к электродам разность потенциалов порядка сотен милливольт, чтобы вызвать электропорацию бислоя.
В конце 1990х годов удалось с помощью высокоточных измерений проводимости мембран зарегистрировать появление одиночных электропор в БЛМ (Melikov К.С. et al., 2001), обратимость которых также была продемонстрирована (Abidor I.G. et al., 1978). Средний диаметр таких пор составил примерно 0.5 нм.
В дальнейшем были проведены исследования цитоплазматических мембран и возникновение пор в данных системах под действием электрообработки, что было детектировано с помощью электронной микроскопии (Chang D.C. et al., 1990). Однако, несмотря на хорошо разработанную теорию и эксперименты с БЛМ при воздействии электрического поля на клеточную мембрану возникли некоторые осложнения вследствие более сложной организации этой структуры в сравнении с БЛМ. Основные барьерные функции клеточной мембраны выполняются фосфолипидным бислоем, который пронизан белками, выполняющими роль селективных каналов или активных насосов для ионов и метаболитов. Таким образом, рост электропроводности при применении электрического поля может быть вызван изменениями не только в липидном бислое, но и в белках. Поэтому достаточно сложно контролировать напряжение, прикладываемое непосредственно к клеточной мембране.
Условия культивирования агробактериального штамма
Горох. Из литературы известно, что культура гороха обладает природной устойчивостью к Km. Вероятно, вследствие этого, в литературе не существует единого мнения, какую концентрацию этого антибиотика следует использовать в качестве сублетальной. Таким образом, был осуществлен подбор сублетальной концентрации Km для гороха сортов Адагумский и Амброзия. Для определения сублетальной концентрации антибиотика были использованы среды В5, содержащие Km в концентрациях 50 мг/л, 75 мг/л, 100 мг/л и 120 мг/л. Учет выживаемости проводили через четыре недели.
Штамм Agrobacterium tumefaciens
Трансформация растительного материала была осуществлена с помощью штамма Agrobacterium tumefaciens ЕНА105. Штамм ЕНА105 содержит бинарный вектор, состоящий из хелперной (vir-регион) и векторной (pART27) плазмид. Векторная плазмида pART27 получена нами при участии Ходжайовой Л.Т. и Градобоевой А.Е. на основе первичного клонирующего вектора pART7 (Gleave P., 1992). Она содержит RK2 - репликон, ответственный за поддержание плазмиды в Agrobacterium tumefaciens, ColEl - ответственный за обеспечение высококопийности в Esherihia coli, ген устойчивости к спектиномицину/стрептомицину (Sp/Str) в качестве бактериального селективного маркера, а также Т-ДНК, которая встроена в полилинкер lacZ . Т ДНК область содержит гетерологичный ген у-интерферона быка под контролем промотора 35S CaMV и растительный селективный маркер - ген устойчивости к канамицину (Km), кодирующий неомицинфосфотрансферазу II, находящийся под контролем промотора нопалинсинтазы (рис. 12). IFNG pNOS-NPT II-3 ocs Ori ColEl RK2 & Рисунок 12. Схема агробактериалыгого вектора, использованного для трансформации табака и гороха Ген у-интерферона быка был любезно предоставлен сотрудниками лаборатории биохимической генетики Санкт-Петербургского государственного университета Смирновым М.Н., Падкиной М.В. и Самбук Е.В.
Условия культивирования агробактериального штамма
Для выращивания агробактерии использовали среды LB (Луриа-Бертани) (Дрейпер и др., 1991) (табл. 9), жидкая и твердая, с добавлением агара 20 г/л, а также селективных агентов - канамицина (100 мг/л), стрептомицина (250 мг/л) и римфапицина (100 мг/л). Таблица 9. Состав среды LB Состав Концентрация (г/л) Триптон 10 Дрожжевой экстракт 5
NaCl 10 Культивирование агробактерии осуществляли на чашках Петри, содержащих твердую среду LB с добавлением необходимых антибиотиков, в темноте при температуре 25С.
Для приготовления ночной культуры агробактерии использовали жидкую среду LB с добавлением селективных агентов. Культуру выращивали на шеикере в течение 12-15 часов в темноте при температуре 25С. 11.3. Методы агробактериальной трансформации II.3.1. Метод трансформации листовых дисков табака in vitro
Агробактериальную трансформацию табака проводили по стандартной методике трансформации с использованием листовых дисков (Дрейпер Дж. и др., 1991). Схема эксперимента представлена на рис. 13.
Для проведения трансформации на листовые диски табака наносили надрезы (15-20 на листовой диск), а затем помещали их в ночную культуру агробактерии и культивировали в течение 1-2 часов на шеикере при температуре 18-20С. После этого листовые диски подсушивали в ламинаре и переносили на среду MS0, покрытую фильтром и содержащую гормоны для индукции каллусообразования (0,5 мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП) и селективный агент Km (100 мг/л). Через 2 дня экспланты переносили на свежую среду MS0 (0,5 мг/л НУК + 0,5 мг/л БАП + Km 100 мг/л), также содержащую О (300 мг/л) - антибиотик, необходимый для элиминации агробактерий. Каллусообразование наблюдали через 2-3 недели. После получения предположительно трансгенных каллусов, их переносили на среду MSO (Km 100 мг/л + 300 мг/л С1) для индукции регенерации. После того как регенеранты достигали 1,5-2 см, их отделяли от материнского каллуса и помещали в отдельные чашки, содержащие MSO (Km 100 мг/л + 300 мг/л С1). Через 5-7 дней регенеранты укоренялись. Полученные регенеранты были проверены методом ПЦР-анализа для подтверждения их трансгенной природы. Метод агробактериальной трансформации незрелых зародышей гороха in vitro подробно описан в литературе (Schroeder Н.Е. et al., 1993). Для проведения эксперимента стерильные семена гороха проращивали на влажном фильтре в течение 4 дней. После этого зародыши гороха отделяли от семядолей, удаляли корень и верхнюю часть проростка, оставляя небольшой участок, содержащий апикальные меристемы (рис. 14).
Анализ уровня и стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака (То-Т3)
Анализ уровня и стабильности экспрессии гена у-интерферона у трансгенных растений табака в ряду поколений был выполнен с помощью двух методов: ОТ-ПЦР-анализа и ПЦР-анализа в реальном времени
Экспрессию гетерологичного гена IFNG у трансгенных растений табака (Ті) семей InterA, InterB, Inter311, Inter605 и Inter623 выявляли методом ОТ-ПЦР-анализа. Кроме того, для подтверждения наличия белка у-интерферона несколько растений поколения Ті были проанализированы методом Вестерн-блот-гибридизации. На уровне поколения Т2 мы продолжили анализ стабильности экспрессии только для потомков двух исходных транс формантов InterB и Inter311, для которых также был проведен ОТ-ПЦР-анализ. Помимо этого, для оценки уровня экспрессии гена IFNG некоторые растения были проанализированы ПЦР-анализом в реальном времени. Наконец, растения поколения Тз (потомки растений InterB и Inter311) были также проанализированы методами ОТ-ПЦР-анализом, ПЦР-анализом в реальном времени, а наличие у-интерферона в растениях (Т3) было подтверждено методом Вестерн-блот гибридизации.
Для выявления и изучения стабильности экспрессии гетерологичного гена у-интерферона мы провели ОТ-ПЦР-анализ трансгенных растений (ТГТ3), которые являлись потомками пяти исходных трансформантов: InterA, InterB, Inter311, Inter605 и Inter623. Чистота проб РНК, выделенных из анализируемых растений, была проверена методом ПЦР с праймерами к гену IFNG. РНК пробы, с положительным результатом, были выбракованы как содержащие примесь тотальной ДНК. Из таких растений снова выделяли РНК и проводили повторное тестирование на присутствие тотальной ДНК. Пробы РНК, удовлетворявшие по качеству (т.е. не содержащие тотальную ДНК), использовали для получения кДНК с помощью реакции обратной транскрипции (рис. 15).
Поскольку пробы кДНК были выровнены для проведения ОТ-ГЩР-анализа, мы провели предварительную оценку уровня экспрессии гена IFNG. Так, мы предположили, что в растениях InterB.1, InterB.6, InterB.13 и InterB.24 (у которых выявлены продукты с высокой интенсивностью свечения) уровень экспрессии гетерологичного гена IFNG был выше, чем у растений InterB.2, InterB.4, InterB.5, InterB.8 и InterB.21 (рис. 17). В дальнейшем эти данные были подтверждены методом ГЩР-анализа в реальном времени.
Аналогичные результаты были получены и для семей Inter311, Inter605 и Inter623, в которых также была выявлена изменчивость по экспрессии гетерологичного гена (табл. 26). экспрессии гена IFNG более, чем для половины растений. Одной из вероятных причин этого может быть потеря экспрессии гетерологичного гена в гомозиготе. С другой стороны, высокий процент растений с отсутствием экспрессии гетерологичного гена может быть связан с местом встраивания трансгена. Подобные случаи были описаны в литературе (Neuhuber et al., 1994). Нельзя исключать также вероятность изменения аллельного состояния гена IFNG, т.к. известно, что один и тот же ген может изменяться и быть представленным в геноме растения несколькими состояниями. В классической генетике описано достаточно много примеров множественного аллелизма генов у разных видов растений. Таким образом, в исследуемых нами семьях InterB, Inter605, Inter311 и Inter623 после самоопыления могло произойти изменение исходного состояния гена IFNG. Такое изменение в терминах классической генетики следует рассматривать как мутацию, т.е. переход гена от «дикого типа» к мутантному. В данном случае «дикий тип» был идентифицирован как растения с наличием экспрессии гена IFNG, а мутантный - растения с отсутствием экспрессии этого гена. Если данное событие имело место в случае наших трансгенных растений, то мы можем столкнуться с восстановлением «дикого типа» в результате обратных мутаций, т.е. в нашем случае восстановление экспрессии гена IFNG а растений следующих поколений.
Как правило, инактивация трансгена характерна для растений с множественными инсерциями Т-ДНК. Так, явление инактивации экспрессии тесно сцепленных копий трансгенов было впервые описано в 1991 году (Scheid et al., 1991). Авторы продемонстрировали корреляцию потери устойчивости к антибиотику гигромицину со встраиванием множественных копий трансгена в один локус растительного генома у трансгенных растений. В другой работе целенаправленно была получена серия аллелей с различным числом копий гена устойчивости к антибиотику (Assaad et al., 1993). У растений с дупликациями перенесенных генов наблюдали их инактивирование. Это явление получило специальное название: RIGS (repeat-induced gene silencing) — замолкание гена, индуцируемое наличием тандемно повторенных фрагментов ДНК в районе расположения анализируемого гена. Данное явление было обнаружено у петунии, у которой были продемонстрированы инвертированные повторы Т-ДНК, содержащей ген халконсинтетазы, что приводило к посттранскрипционной инактивации гомологичного гена петунии (Stam et al., 1998). К настоящему времени известно большое количество работ, в которых проводили исследования влияния различных дуплицированных Т-ДНК фрагментов на проявление и стабильность экспрессии перенесенных генов (ten Lohuis- et al., 1995; Papp et al., 1996; Matzke et al., 2000): Однако анализ наследования гена IFNG в семье InterA показал наличие одной копии трансгена в геноме исходного трансформанта (табл. 24). Таким образом, предположение о потери экспрессии гена IFNG, вызванное множественными инсерциями, является несостоятельным и связано с другими причинами.
Феноменологические случаи «замолкания» чужеродных генов среди потомков первого поколения трансгенных растений описаны для разных видов растений: табака, петунии, Arabidopsis thaliana и др. (Schmidt, Willmizer, 1988; Scheid et al., 1991; Meyer, Heidmann, 1994). Известно, что у растений табака частота инактивирования трансгенов изменялась от 8% до 36% (Herber-Bors et al, 1988), а у A. thaliana от 10% до 50% (Schmidt, Willmizer, 1988; Scheid et al., 1991) при анализе четырех независимых популяций. Подобные результаты могут быть объяснены химерностью растительных тканей у исходных трансформантов, возникновением микроделеций и мутаций по районам Т-ДНК, встраиванием инсерций в гиперметилированные участки генома и др. Так, например, Шмюллинг и Шелл (Schmulling, Schell, 1993) показали, что у . растений табака возможно образование химер — растений с двумя типами клеток: с интеграцией трансгена в ядерную ДНК и без нее. С другой стороны, : известно, что встраивание чужеродных генов в слабо или сильно її метилированные районы также приводит к инактивированию трансгенов 115 (Furner et al., 1998; Jones et aL, 1998). Возможно, что подобное произошло и в нашем случае: либо инсерция Т-ДНК в исходном трансформанте InterA (Т0) произошла в гиперметелированныи участок растительного генома, либо растение InterA (То) представляло собой химеру. Оба возможных события могли привести к полной инактивации гена IFNG у растений поколения Ть которое мы и наблюдали при анализе экспрессии гена IFNG в семье InterA.
Итак, проанализировав пять семей трансгенных растений поколения Т], мы показали наличие экспрессии гетерологичного гена IFNG у половины растений в семьях InterB, ІпіегЗП, Inter605 и Inter623. Кроме того, среди растений, экспрессирующих IFNG ген, была выявлена изменчивость уровня экспрессии гетерологичного гена. Анализ экспрессии IFNG гена у растений семьи InterA продемонстрировал отсутствие активности данного гена среди всех проанализированных растений. По результатам анализа семья InterA была исключена из последующей работы.
