Введение к работе
Актуальность. Защита растений от фитопатогенов является актуальной задачей современной физиологии и биотехнологии растений. В настоящее время в сельском хозяйстве для этого используются различные комплексные подходы, такие как химические средства защиты, микробиологические методы, методы традиционной селекции, а также методы генной инженерии.
Одним из перспективных направлений в области повышения устойчивости растений к патогенам является трансформация растений генами, экспресирующими антимикробные пептиды и получение устойчивых к фитопатогенам трансгенных растений (Epple et.al., 1997; Liang et.al., 2000). Наличие селективных маркерных генов в трансгенных растениях может представлять потенциальную биологическую опасность, связанную с возможностью неконтролируемого переноса этих генов другим растениям и микроорганизмам. Существующие методы удаления селективных маркеров довольно трудоемки, поэтому разработка эффективных подходов получения безмаркерных растений представляет собой важную задачу биотехнологии растений.
В настоящее время для защиты растений от патогенов часто используются биопрепараты на основе микроорганизмов Bacillus, Azotobacter, Arthrobacter, Pseudomanas, Streptomyces, Frankia. Многие из этих микроорганизмов обитают в ризосфере растений и способны синтезировать регуляторы роста растений, улучшать фосфорное питание растений, фиксировать атмосферный азот, индуцировать резистентность к фитопатогенам. Применение этих методов защиты растений эффективно, но имеет ряд недостатков. Обработка растений микробиологическими препаратами приводит к кратковременным положительным эффектам и требует нескольких обработок растений в период вегетации, поскольку такие микроорганизмы не способны устанавливать прочную ассоциативную связь с растениями. Наиболее удачным подходом к решению этой проблемы является применение комбинированного метода клонального микроразмножения растений и бактериальной колонизации растений полезными микроорганизмами in vitro, которые устанавливают прочную ассоциативную связь с растением и способствуют повышению его иммунитета.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является разработка методов защиты растений сахарной свеклы и капусты белокочанной от микробных фитопатогенов. Для этого были поставлены следующие задачи:
-
Отработать методы культивирования in vitro перспективных отечественных линий сахарной свеклы и капусты белокочанной. Оценить регенерационный потенциал различных типов эксплантов.
-
Провести генетическую трансформацию сахарной свеклы и капусты белокочанной искусственным геном антимикробного пептида цекропина PI (cecPl).
-
Разработать метод получения трансгенных растений, не содержащих селективных генов устойчивости к антибиотикам.
-
Подобрать условия и провести колонизацию растений сахарной свеклы и капусты белокочанной in vitro бактериями Methylovorus mays и Pseudomonas aureofaciens.
5. Исследовать влияние ассоциативных бактерий М. mays и P. aureofaciens на
морфогенез растений и повышение их устойчивости к фитопатогенам.
Научная новизна. Изучен регенерационный потенциал 4 линий сахарной свеклы (325, 328, 330, 332) и 2 сортов капусты белокочанной (Зимовка 1474, Слава 1305) и отобраны линии и сорта с высокими регенерационными характеристиками. Оптимизирован метод трансформации растений с помощью агроинфильтрации семян. Получены трансгенные растения сахарной свеклы и капусты белокочанной, экспрессирующие антимикробный пептид цекропин Р1.
Разработан метод получения и отбора безмаркерных трансгенных растений, основанный на анализе антимикробной активности экстрактов этих растений. Получены биобезопасные безмаркерные растения капусты белокочанной нового поколения. Растения сахарной свеклы и капусты белокочанной с геном cecPl проявляли повышенную устойчивость к бактериальным и грибным фитопатогенам Ervinia carotovora, Pseudomonas syringae, Sclerotinium sclerotiorum.
Влияние полезных микроорганизмов на развитие сахарной свеклы и капусты исследовали с помощью метода колонизации растений in vitro ассоциативными микроорганизмами в сочетании с клональным микроразмножением. Показано, что колонизация растений бактериями M.mays и P.aureofaciens, стимулировала рост и морфогенез растений, благоприятно влияла на адаптационные свойства к условиям in vivo и повышала устойчивость растений к фитопатогенам и ксенобиотикам.
Практическая значимость. Использование трансгенных растений сахарной свеклы и капусты белокочанной с геном цекропина Р1 перспективно для повышения урожайности данных культур за счет усиления устойчивости растений к ряду грибных и бактериальных фитопатогенов. Создание безмаркерных трансгенных растений дает возможность избежать риска неконтролируемого переноса селективных генов другим растениям.
Метод колонизации растений in vitro полезными ассоциативными бактериями М. mays и P.aureofaciens в сочетании с микроклональным размножением позволит получить растения с высокой адаптационной способностью к условиям открытого грунта и с улучшенными физиологическими параметрами - корнеобразованием, скоростью роста, фотосинтетической активностью и повышенной устойчивостью к болезням.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), VI чтениях, посвященных памяти
академика Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2002), VI, IX, XIII, XIV, XV Пущинских школах-конференциях молодых ученых (Путино, 2002, 2005, 2009, 2010, 2011), Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), II Международных научно-практической конференциях «Актуальные проблемы биоэкологии» (Москва, 2008, 2010), Всероссийской конференции «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009» (Пущино, 2009), Научном симпозиуме «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Международной конференции «Человек и окружающая среда: друзья или враги?» (Пущино, 2011), VII Съезде общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, в том числе 7 статей в рецензируемых журналах, 1 патент на изобретение, 6 статей в сборниках.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения и выводов и списка литературы. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, включая 11 таблиц, 41 рисунок; библиография содержит 261 ссылку.
