Введение к работе
Актуальности проблемы. К настоящему времени остро стоит проблема создания культурных растении с улучшенными питательными свойствами, устойчивых к действию различных природных факторов, в том числе и патогенов.
Одной из важных сельскохозяйственных культур является рапс (Hrassica napus L.var./iu/w.v), который наряду с подсолнечником, соей и хлопком служит источником как пищевого, так и технического масла. Кроме того, рапс - ценная кормовая культура, содержащая большое количество легкоусвояемых белков. От других масличных растении рапс выгодно отличается способностью расти в зонах умеренного климата, где у других подобных сельскохозяйственных культур семена не вызревают.
Важность этой культуры настоятельно требует создания новых сор-зон, устойчивых к действию различных патогенных факторов и, в частности, насекомых. В современном сельском хозяйстве для уничтожения насекомых в качестве альтернативы химическим средствам используются биологические инсектициды - белки, вырабатываемые бактерией Bacillus tlmringiensis (дельта-эндотокспны). Эти соединения являются высоко специфичными для насекомых и совершенно безвредны для человека и теплокровных животных. Коммерческое использование этих препаратов оіраничепо их высокой стоимостью, а также нх нестабильностью в полевых условиях.
Важной задачей является создание сельскохозяйственных растений и, в частности, рапса, самих вырабатывающих эти белки.. Широкие возможности в защите растений открывает генетическая инженерия, методы которой позволяют включать чужеродные гены в геном растений. Для трансформации растении наиболее широкое распространение получили векторы, сконструированные на основе природной системы переноса генов почвенной бактерии Agrobacteriwn tumefaciens.
В нашей стране работы по получению трансгенных растений рапса были начаты в нескольких научных центрах, однако, к настоящему времени все они свернуты. За рубежом такие исследования активно проводятся в ряде крупных фирм, патентующих свои методы, что делает их практически недоступными. С другой стороны, многочисленные литературные данные достаточно противоречивы,' что также не позволяет воспользоваться разработанными в них методами трансформации растений. Все это делает актуальным разработки надежных и воспроизводимых методов регенерации и трансформации растений рапса доступных не только
для широкого круга исследователей, но и для специалистов с/х производства
Цели и задач» исследования. Целью настоящей работы являлось получение устойчивых к насекомым трансгенных растении рапса, способными экспрессировать чужеродные гены дельта-эндотоксина.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать методы регенерации рапса для получения высокой частоты регенерации побегов;
исследовать различные сорта рапса с целью изучения их способности к регенерации и трансформации;
подобрать условия трансформации эксплантов;
доказать включение переносимого гена в геном растения;
показать экспрессию введенных функциональных генов в трансгенных растениях;
доказать наследуемость встроенных генов у самоопыленных растений и у их гибридов с нетрансгенамн;
показать возможность клонального размножения полученных форм растений.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований разработаны методы регенерации рапса, позволяющие с высокой эффективностью получать побеги па эксплантах, полученных из различных органов растений разнообразных генотипов. Впервые в мире показана возможность использования фитогормона абсцпзовой кислоты (АБК) для резкого повышения эффективности побегообразования у рапса и доказана универсальность использования ее в качестве индуктора побегообразования для эксплантов семядолей проростков. Впервые в нашей стране получены трансгенные растения ярового рапса, несущие гены дельта-эндотоксина и nptll. С помощью блот-гнбридизацни РНК показано, что в трансгенных растениях происходила экспрессия введенных генов дельта-эндотоксина на уровне образования транскриптов. Впервые для В.парик при помощи нескольких методов доказана наследуемость иптродуцпро-ванных чужеродных генов вплоть до 2 поколения. Показано, что свойства полученных трапсгеппых форм растений сохраняются в процессе размножения при индукции побегообразования на эксплантах семядолей, что свидетельствовало о возможности их клонального размножения.
Практическое значение работы. Разработанные методы регенерации и трансформации позволяют создавать и размножать новые формы ярового рапса - ценнейшей масличной н кормовой культуры. Полученные
трансгенные растения могут служить материалом для различных селекционных программ.
Апробация работы. Основные положения работы доложены на II и III съездах Всероссийского общества физиологов растений (Минск, 1990 г. и Санкт-Петербург, 1993 г.), на II Международной конференции "Биология культивированных клеток растений и биотехнология" (Алма-Ата, 1993), на Международном симпозиуме "Физиология абсцизовоп кислоты" (Пущино-на-Оке, 1993), на II и III Российских симпозиумах "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино-на-Оке, 1993, 1994), па I, II и III Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (1991, 1992 и 1993 гт), на Росснско-Германском рабочем совещании по проблемам молекулярной биологии и биотехнологии растении (Москва, 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Структура диссертации. Днссертациоиая работа состоит из введения и пяти глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы.
Материалы диссертации изложены на^^странпцах машинописного текста, содержат 27 таблиц и 24 рисунка. Библиография содержит 223 источника, из которых зарубежной литературы - 208.
