Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
1.1. Ботаническое описание растений рода Brassica 8
1.2. Представления об адаптации растений к неблагоприятным факторам 9
1.3. Особенности адаптации галофитов и гликофитов 10
1.3.1. Рост и развитие растений при засолении 14
1.3.2. Водный статус растений при засолении 17
1.3.3. Осмотический потенциал растительных тканей 17
1.4. Аккумуляция осмотически активных веществ в растительных тканях при засолении 20
1.4.1. Накопление неорганических ионов 20
1.4.2. Накопление осмолитов 24
1.4.3. Осморегуляторная роль пролина 26
1.4.4. Биологическая роль пролина 27
1.4.5. Биосинтез и катаболизм пролина 31
1.4.6. Регуляция активности ферментов биосинтеза пролина в норме и при стрессе 32
1.5. Увеличение солеустойчивости видов рода Brassica с помощью генной инженерии 36
1.5.1. Трансгенные растения с повышенным содержанием пролина 37
1.5.2 Повышение содержания пролина у трансформантов, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы 41
ГЛАВА 2. Объект и методы исследований 43
ГЛАВА 3. Результаты и их обсуждение 57
3.1. Действие засоления на растения рапса 57
3.1.1. Динамика роста растений при действии засоления 58
3.1.2. Влияние различных концентраций NaCl на осмотический потенциал тканей листа 60
3.1.3. Водный статус растений при действии засоления 61
3.1.4. Влияние различных концентраций NaCl на поглощение неорганических ионов 62
3.1.5. Аккумуляция свободного пролина в листьях растений рапса при действии засоления 65
3.1.6. Влияние различных концентраций NaCl на активность ПДГ 67
3.2. Получение трансгенных растений рапса, экспрессирующих фрагмент гена ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации 70
3.2.1. Влияние различных штаммов агробактерий на эффективность трансформации 71
3.2.2. Доказательства трансгенности растений-трансформантов 72
3.2.3. Влияние NaCl на активность ПДГ в листьях трансформированных растений рапса 75
3.2.4. Влияние NaCl на содержание пролина в листьях трансформированных растений рапса 77
3.3. Солеустойчивость полученных трансгенных растений 79
3.3.1. Влияние NaCl на осмотический потенциал листьев рапса 79
3.3.2. Влияние NaCl на содержание Na+ и К+ в листьях растений рапса...81
3.3.3. Влияние NaCl на накопление биомассы растениями рапса 83
Заключение 86
Выводы 88
Список литературы 90
- Особенности адаптации галофитов и гликофитов
- Повышение содержания пролина у трансформантов, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы
- Влияние различных концентраций NaCl на поглощение неорганических ионов
- Влияние NaCl на активность ПДГ в листьях трансформированных растений рапса
Введение к работе
На земном шаре около четверти почв сельскохозяйственного назначения в той или иной мере засолены [Строганов, 1976] и по прогнозам ожидается, что к 2050 году значительному засолению может быть подвергнуто более 50% возделываемых территорий [Ashraf, 1994]. В условиях избыточного засоления ингибируется рост и развитие растений, нарушается водный статус и ионный гомеостаз, наблюдается торможение процессов фотосинтеза и дыхания, падает продуктивность сельскохозяйственных культур [Flowers, 2004].
Одним из путей использования засоленных территорий в интересах аграрного производства и биотехнологии является создание и выращивание солеустойчивых сортов растений, которые способны поддерживать низкий водный потенциал клеточного содержимого, тем самым сохраняя водопоглотительную деятельность клеток корня при высоком содержании солей в почвенном растворе [Ashraf, Harris, 2004].
Эта задача, как правило, решается за счет интенсивной аккумуляции в клетках растений неорганических ионов, которые локализуются в вакуоли. Однако накопление в вакуоли больших концентраций таких ионов может привести к нарушению осмотического равновесия между двумя основными компартментами клетки - вакуолью и цитоплазмой. Восстановление нарушенного внутриклеточного равновесия осуществляется, как правило, за счет синтеза и аккумуляции в цитоплазме совместимых осмолитов таких как свободные аминокислоты, бетаины и сахароспирты.
Универсальным органическим протекторным соединением в растительном мире является пролин (Про), который может действовать в качестве осмолита, антиоксиданта и энергетического субстрата, источника восстановительных эквивалентов, азота и углерода, а также регулятора
экспрессии генов осмотического ответа [Кузнецов, Шевякова, 1999; Kavi Kishor et al., 2005]. Кроме того, пролин проявляет функцию "химического шаперона", защищая тем самым нативную конформацига макромолекул и мембран при стрессе [Hamilton, Heckathorn, 2001].
Рапс является одним из важнейших масличных растений. Масло рапса содержит самое низкое количество вредных для здоровья насыщенных жирных кислот и широко используется в пищевых и технических целях. Работа по получению растений рапса с повышенной солеустоичивостью крайне актуальна, поскольку в настоящее время в мире остро стоит проблема использования засоленных территорий для с/х производства, а большинство культурных растений, в том числе и растения рапса, являются гликофитами. Создание солеустойчивых растений рапса будет способствовать значительному повышению урожайности этой важной сельскохозяйственной культуры и повышению эффективности использования засоленных территорий.
В настоящее время существует несколько подходов для повышения солеустойчивости растений: 1) методы классической (традиционной) селекции; 2) использование методов клеточной биологии и, в частности, методов клеточной селекции; 3) использование генно-инженерных подходов для введения чужеродных генов, то есть получение трансгенных растений, обладающих новыми свойствами.
Цель и задачи исследования. Целью работы было создание трансгенных растений рапса с повышенной солеустоичивостью и изучение их физиолого-молекулярных свойств.
Для достижения этой цели перед нами стояли следующие задачи!
1. Провести сравнительные исследования уровня и физиологических механизмов солеустойчивости растений различных по происхождению сортов рапса.
Получить генетически модифицированные растения рапса двух сортов, обладающие способностью к супераккумуляции Про и вследствие этого повышенной солеустоичивостыо, путем введение в растения фрагмента гена пролиндегидрогеназы (ПДГ) арабидопсиса в антисмысловой ориентации.
Исследовать регенерационную способность и способность к трансформации использованных сортов рапса и доказать трансгенность полученных растений-трансформантов физиологическими и молекулярными методами.
Оценить уровень солеустойчивости полученных трансгенных форм и выяснить причины их повышенной резистентности к NaCl.
Особенности адаптации галофитов и гликофитов
В зависимости от отношения к засолению почвы все растения условно могут быть разделены на две большие группы: галофиты и гликофиты. Галофитами называются растения засоленных местообитаний, легко приспосабливающиеся в процессе онтогенеза к высокому содержанию солей в почве (субстрате). Согласно Flowers et al. [1977], галофиты - это растения, способные выживать и завершать полный жизненный цикл при концентрации солей в питательном субстрате от 300 мМ и выше. Галофиты, в основном представлены дикорастущими формами [Захарин, 1990]. Гликофитами же называют растения пресных местообитаний с ограниченной способностью адаптироваться к засолению в процессе индивидуального развития [Генкель, 1954]. В группу гликофитов попадают практически все культурные растения, как крайне чувствительные к засолению среды, например, бобовые, так и сравнительно устойчивые, к которым относятся, например, ячмень, подсолнечник, хлопчатник, рапс. Гликофиты повреждаются даже в условиях, когда ЕСе составляет всего 3 dS/m, что равно осмотическому потенциалу менее -0,117 МПа (осмотический потенциал = -0.39 х Есе). Насыщенный же экстракт засоленной почвы составляет более чем 4 dS/m ( 40мМ NaCl).
Известные механизмы солеустойчивости можно условно разделить на 2 типа: I тип - механизмы устойчивости, связанные с процессами ионного транспорта по тканям и органам растений, т.е. на мембранном уровне [Stawarek, Rains, 1983; Cheeseman, Wickens, 1986; Cheeseman, 1988].
Анализ литературных данных позволяет выделить как минимум 3 группы растений по способам транспорта в них ионов. Это растения: 1) накапливающие соли внутри тканей; 2) растения, выводящие их во внешнюю среду, а также 3) растения, малопоглощающие соли [Greenway, Munns, 1980].
К первой группе растений относятся некоторые галофиты, которые могут накапливать огромное количество засоляющих ионов в клетке [до 7% от сухого веса], особенно в вакуолях [Bohnert et al., 1988; Andolfatto et al., 1994] и при этом сохранять нормальное функционирование [Soufi, Wallace, 1982]. Растения из другой группы галофитов (например, Diplachne fusca L.Beauv. и Avicennia marina L.) накапливают засоляющие ионы в специализированных клетках, органах или тканях, при помощи которых соль затем выделяется на поверхность надземных органов [Семихатова, 1993; Hill, Hill, 1976; Andolfatto et al., 1994]. Для вывода солей растения могут иметь также особые морфологические образования, расположенные на листьях и стеблях растений (солевые гланды или другие экскреторные органы) [Luttge, 1971; Flowers et al., 1977].
К 3-ей группе растений с механизмами солеустойчивости, связанными с процессами ионного транспорта по тканям и органам растений, относятся растения, отличающиеся уменьшенным поглощением солей клетками корня [Полевой, 1989]. II тип - механизмы солеустойчивости растений, запускающие реакции метаболизма, которые нейтрализуют неблагоприятное действие ионов. Эти реакции возникают как следствие индуцированных ионами нарушений в обмене веществ и направлены на восстановление нормальных функций [Greenway, Миппэ, 1980; Stawarek, Rains, 1983]. К этой группе механизмов относятся: а) устойчивость белков, в том числе белков рибосом, к денатурирующему действию электролитов и обезвоживанию. Этот механизм в полной мере представлен лишь у галобактерий [Хочачка, Семеро, 1977]. У высших растений, включая экстремальные галофиты и одноклеточные водоросли, он проявляется частично и не имеет определяющего значения. б) регуляция осмотического давления в клетках и тканях путем накопления осмотически активных ионов, как уже упоминалось ранее, и низкомолекулярных метаболитов [Stawarek, Rains, 1983; Yeo, 1998], прежде всего, полиаминов [Шевякова, 1983; Taylor, 1996] и бетаинов [Шевякова, 1981; Бабурина, Шевякова, 1988; Бабурина, Леонова, 1994], амино- или иминокислот, а также Сахаров или сахаро-спиртов [Шевякова и др., 1994; Jensen etal., 1994]. в) образование в растениях специфических стресс-белков, например, белка Lea-типа, или белков 26 кДа, известных как осмотин (osmotin) или гермин (germin). Эти белки участвуют в детоксикации и предотвращают повреждение биополимеров [Шемякин, Шерман, 1986; Шерман, 1987; Harrington, Aim, 1988; Кузнецов, Старостенко, 1994]. У гликофитов, так же, как и у галофитов, обнаруживаются как соленакапливающий, например, у подсолнечника, так и соленепроницаемый, например, у кукурузы, механизмы устойчивости. Однако эти механизмы устойчивости гликофитов несовершенны, поскольку они способны функционировать более или менее успешно лишь при слабом солевом воздействии [Захарин, 1990].
Было установлено, что большинство покрытосеменных галофитов накапливают ионы в листьях, тогда как у покрытосеменных гликофитов наблюдается лишь ограниченное поступление ионов в ассимилирующие органы. Среди гликофитов наиболее устойчивы к избытку солей те формы, у которых корни и стебли выполняют функции органов, аккумулирующих в себе ионы. У форм с низкой солеустойчивостью основная масса ионов поступает в надземные органы [Лапина, Строганов, 1979].
Лучшими осмотическими компонентами для гликофитов являются К+ и низкомолекулярные органические соединения (осмолиты), тогда как у галофитов тургор поддерживается в основном за счёт аккумуляции Na+ и СГ [Hellebust, 1976; Flowers et a 1., 1977]. Механизм осмотической адаптации растений к засолению среды, связанный с поглощением и транспортом ионов, практически сходен у галофитов и гликофитов [Лапина и др., 1980]. Однако скорости этой адаптации и адаптивный потенциал у галофитов в 4-20 раз выше, чем у гликофитов [Flowers et al., 1977].
Shannon с соавт. [1994] выдвинули идею о том, что реакция растений на засоление зависит от концентрации соли в тканях растения, солевого состава почвы, погодных и климатических условий. При этом негативное воздействие соли на растение в значительной степени определяется скоростью увеличения ее концентрации. В ряде работ было показано, что растение под действием постепенно возрастающих концентраций соли способно адаптироваться к более высокой степени засоления, по сравнению с адаптацией к внезапному действию соли. [Кузнецов, 1992; Levitt, 1980].
Повышение содержания пролина у трансформантов, несущих антисмысловой супрессор гена пролиндегидрогеназы
Манипуляции с антисмысловыми последовательностями РНК - один из самых последних инструментов, используемых физиологами, чтобы понять роль метаболита или метаболического пути в определенном биологическом процессе [Bourque, 1995]. Концепция вставки антисмысловой последовательности РНК в организм для контроля активности гена первоначально разрабатывалась на прокариотических организмах [Green et al., 1986], а затем была перенесена на растения [Ecker, Davis, 1986]. Антисмысловые конструкции могут влиять на уровень экспрессии целевого гена двумя путями. Первый механизм заключается в ингибировании трансляции целевой мРНК за счет комплементарных взаимодействий с антисмысловым транскриптом, синтезированным in vitro [Bourque, 1995]. Целевая и антисмысловая РНК комплементарны, так как они обычно транскрибируются от промотора в обратных направлениях на идентичных или подобных участках ДНК. Таким образом, трансляция гена подавляется из-за гибридизации с антисмысловой последовательностью, и экспрессия гена эффективно выключается [Day, 1989]. В стационарном состоянии наблюдается уменьшение уровня как целевой, так и антисмысловой РНК [Bird, Ray, 1991]. Второй возможный вариант влияния антисмысловой последовательности на активность целевого гена - это индукция генетического сайленсинга на посттранскрипционном или транскрипционном уровне. Считается, что появление двухцепочечных матриц может привести к тому, что они будут распознаваться комплексом RISC (RNA-induced silencing complex) и будет генерироваться специфическая нуклеазная активность, нацеленная на конкретную матрицу. Антисмысловая технология дала мощный толчок к достижению понимания функций белков, кодируемых определенными генами. Этот метод позволил изучить роль белков и генов, функция которых ранее была неизвестна.
Nanjo с соавт. [1999а] получили трансгенные растения Arabidopsis с антисмысловой последовательностью, кодирующей фермент ПДГ и наблюдали, что несколько трансгенных линий накапливали Про в больших количествах, чем нетрансгенные растения, указывая на ключевую роль ПДГ в деградации Про у Arabidopsis. Эти трансгенные линии арабидопса были более устойчивы к низким температурам и засолению, чем нетрансгенные растения, демонстрируя положительную корреляцию между накоплением Про и устойчивостью растения к стрессам.
В работе выполненной Кочетовым с соавт. [2004], растение табака Nicotiana tabacum сорта SRI трансформировали плазмидой, содержащей сконструированный антисмысловой супрессор гена ПДГ (фрагмент гена ПДГ арабидопсиса в антисмысловой ориентации, помещенный под контроль 35S промотора вируса мозаики цветной капусты). При исследовании полученных растений было показано, что трансформанты, несущие антисмысловой супрессор ПДГ, характеризуются увеличенным содержанием Про и повышенным осмотическим давлением клеточного сока. Уровень Про в трансформантах табака варьировал, тогда как осмотическое давление клеточного сока было стабильно, что, по-видимому, отражает сложный характер взаимосвязи между этими показателями.
Таким образом, как можно видеть из обзора литературы, получение трансгенных растений со встроенными в антисмысловой ориентации генами ферментов, разрушающих осмопротекторы, дает возможность создания устойчивых к действию абиотических факторов растений. Объектом исследования являлись растения Brassica napus L. Для опытов было выбраны два сорта рапса: Ольга и Вестар, шведской и канадской селекции, соответственно, обладающие высокой регенерационной способностью. Условия выращивания растений рапса Для опытов по сравнению солеустойчивости трансформированных растений дезинфицированные семена рапса поверхностно стерилизовали в течение 20 мин 1% раствором гипохлорита натрия, после чего их интенсивно промывали дистиллированной водой и высаживали в сосуды (по 10 штук) на среду Хогланда-Снайдерс с перлитом [Третьяков и др., 1990]. Маточные растворы для получения данной питательной среды включали: 1. макроэлементы (1,0 М KN03; 0,74 М КН2Р04; 0,41 М MgSO4x7H20); 2. микроэлементы (1,77 мМ MnS04x5H20; 8,87 мМ Н3В03; 0,31 мМ ZnS04x7H20; 0,32 мМ CuS04x5H20; 0,026 мМ (NH4)6Mo7O24x4H20); 3.0,42MCa(NO3)2x4H2O; 4. хелат железа (3,59 мМ FeS04x7H20; 3,63 мМ ЭДТА). При приготовлении маточных растворов отдельные компоненты добавляли в раствор в том порядке, в котором они перечислены выше. В случае маточного раствора хелата железа сначала растворяли отдельные компоненты в половинных объемах от конечного, а затем их сливали вместе и раствор приобретал характерный лимонный цвет. Для приготовления 1 л питательного раствора использовали следующие объемы маточных растворов: по 10 мл растворов (1) и (2), 1 мл раствора (3) и 4 мл раствора (4). Условия проведения вегетационного опыта Растения выращивали в условиях фитотрона при температуре 25С, относительной влажности воздуха 60% и 16-часовом световом периоде при интенсивности освещения 3.5 кЛк. Растения через день поливали питательным раствором Хогланда-Снайдерс. Проведение засоления Спустя 20 дней, по достижении растениями стадии 3-4-х настоящих листьев, в сосуды, содержавшие опытные варианты обоих сортов рапса, был добавлен раствор NaCl до конечной концентрации соли от 50 до 400 мМ. Растения выращивали в условиях засоления в течение последующих 7 дней, после чего их срезали для определения свежей и сухой биомассы и оценки содержания воды. Измерение биомассы и содержания воды Биомассу и содержание воды в растительном материале проводили, используя гравиметрический метод. Сухую массу определяли после фиксации при 90С и высушивания (при 70С) до постоянного веса. Содержание воды (%) рассчитывали, исходя из разности свежей и сухой биомасс [Пустовой и др., 1995].
Влияние различных концентраций NaCl на поглощение неорганических ионов
РНК выделяли фенольным методом, предложенным Westhoff et al., [1981]. Навеску растительной ткани (2-4 г) растирали в фарфоровой ступке с жидким азотом, избегая размораживания материала. Материал, растертый до консистенции пудры, переносили в пластиковую пробирку, содержащую буферную смесь следующего состава: 1,5 мл 500 мМ Трис/НС1, 1,5 мл 150 мМ NaCl, 750 мкл 100 мМ ЭДТА, 300 мг СДС, 1 мл Н-лауроилсаркозин, 150 мкл Р-меркаптоэтанол 1/100, 10,1 мл бидистиллированной воды, 2,0 г PVP (поливинилпирролидон), 7,5 мл насыщенного фенола (60 мл перегнанного фенола; 20,1 мл диет, воды; 0,9 мл 5 М NaOH; 120 мкл Р-МЕ), 7,5 мл хлороформа.
Раствор Трис-HCl предварительно автоклавировали, растворы ЭДТА, NaCl и Н20 обрабатывали ингибитором РНКаз (диэтилпирокарбонатом - DEPC) и автоклавировали в течение часа.
Для более полной экстракции нуклеиновых кислот полученную смесь тщательно перемешивали и помещали на водяную баню t = 42С на 20 мин, периодически встряхивая. Затем переносили в стерильную стеклянную пробирку и центрифугировали при t = 4С 20 мин при 4000 об/мин на центрифуге К-23 (MLW, ГДР).
Для завершения депротеинизации надосадочную жидкость отбирали в стерильную стеклянную пробирку, содержащую 7,5 мл насыщенного фенола и 7,5 мл хлороформа и центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Верхнюю фракцию переносили в стерильную пробирку, содержащую 15 мл хлороформа и центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Центрифугирование с хлороформом проводили дважды для удаления остатков фенола. Для осаждения нуклеиновых кислот верхнюю фракцию отбирали в стерильную стеклянную пробирку и добавляли 1/10 объема ЗМ ацетата натрия (pH 5,0) и 2,5 объема 96% этилового спирта. Полученную смесь хорошо перемешивали и помещали на-20С примерно на 12 часов. Все переносы делали на водяной бане, избегая нагревания растворов. Для полного осаждения нуклеиновых кислот полученную смесь центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, а осадок ресуспендировали в 4 мл холодного 70% этилового спирта. Повторяли центрифугирование и снова ресуспендировали осадок в 4 мл холодного 70% этилового спирта и еще раз центрифугировали. Надосадочігую жидкость удаляли, осадок высушивали на воздухе и растворяли в 4 мл холодной ( 5С) бидистиллированной воды, предварительно обработанной ингибитором РНКаз и автоклавированной, к раствору добавляли 1,8 мл 9,6 М хлористого лития для осаждения РНК. Смесь выдерживали на ледяной бане в течение 12 часов, затем центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Осторожно сливали водную фазу, осадок РНК ресуспендировали в 4 мл холодного 70% этилового спирта и центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин. Промывание спиртом повторяли трижды для удаления остатков хлористого лития. Полученный осадок высушивали воздухом, растворяли на ледяной бане в 300 мкл бидистиллированной воды, свободной от РНКаз и хранили на - 70С. Концентрацию и чистоту полученной РНК измеряли на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 260 (максимум поглощения нуклеиновых кислот) и 280 (максимум поглощения белков) нм Для удаления следов ДНК 60 мкг РНК обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКаз, в присутствии ингибитора РНКаз. Для этого рассчитывали объем пробы, содержащий 60 мкг РНК. В эппендорф вносили бидистиллированную воду, свободную от РНКаз, из расчета VH20 + VPHK = 79 мкл, 10 мкл 10Х буфера для ДНКазы, 1,5 мкл ингибитора РНКаз (Fermentas), смесь перемешивали и вносили рассчитанный объем РНК и 10 мкл ДНКазы I. Все операции проводили на ледяной бане. Полученную смесь 0,5 часа выдерживали при 37С. Затем проводили депротеинизацию для освобождения от ДНКазы (2-кратная обработка фенолом с хлороформом - 1:1, 2-кратная обработка хлороформом). Надосадочную жидкость отбирали в стерильный эппендорф и добавляли 1/10 объема З М ацетата натрия (рН 5,0) и 2,5 объема 96% этилового спирта. Смесь хорошо перемешивали и ставили на 1 час на -70С. Далее смесь центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин, сливали надосадочную жидкость и трижды промывали осадок 500 мкл 80% этилового спирта. Спирт выливали, а полученный осадок высушивали на воздухе. Затем на холоду осадок растворяли в 30 мкл бидистиллированной воды, свободной от РНКаз и хранили на -70С. 5 мкл раствора использовали для определения концентрации РНК на СФ-46. Затем 5 мкг РНК использовали для проведения электрофореза в агарозном геле, результаты которого позволяли оценить степень разрушенности РНК. Для ПЦР использовали ДНК-амплификатор "Терцик" фирмы "ДНК-технология" (Россия). Использовали следующие праймеры, комплементарные участку промотора 35S ВМЦК и фрагменту ПДГ: Праймер (+) 5 gagatgttggtctagatttggcagc 3 Праймер (-) 5 gatacagtctcagaagacca 3 . Праймеры были изготовлены в фирме Литех, (Москва). Суммарный объем реакционной смеси составлял 20 мкл. Реакционный буфер (10 mM Tris-HCl, рН 8.3, 50 тМ КС1, 25 тМ MgCl2), содержал дезокситрифосфаты в конечной концентрации 0.25 тМ, олигонуклеотиды - 1пМ и 2 ед. Taq-полимеразы; матричная ДНК добавлялась в количестве до 2 мкг. Сверху в реакционные пробирки наслаивали 30 мкл минерального масла. Реакция проходила в следующих условиях: смесь прогревали 4 мин при 94С, после чего проводили 30 циклов амплификации (1 мин 94С, 1 мин 58С, 1 мин 72С). ПЦР продукты были исследованы методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле, содержащем краситель бромистый этидий.
Влияние NaCl на активность ПДГ в листьях трансформированных растений рапса
Как уже упоминалось ранее, одним из способов увеличения содержания Про является снижение скорости его деградации за счет введения антисмысловых супрессоров генов ферментов, разрушающих Про, в частности, ПДГ. При измерении содержания свободного Про результаты трансгеноза ярче всего проявились в растениях, выращенных на солесодержащих средах. Как видно из табл.13, в растениях сорта Ольга (линия 0-R-52) количество свободного Про при внесении 200 мМ NaCl возрастало примерно в 9-10 раз (88.4 мкмоль/г см.); в растениях сорта Вестар (линия W-R-22) - в 6 раз (67.2 мкмоль/г см.). Несколько меньше Про было в растениях линии O-F-43 сорта Ольга (70.4 мкмоль/г см.) и линии W-F-32 сорта Вестар (55.2 мкмоль/г см.). Тогда как у нетрапсформированных растений обоих сортов его содержание под воздействием увеличенных концентраций соли увеличивалось только в 2 раза.
Похожие результаты по увеличению содержания Про были получены и в работе Кочетова с соавт. [2004], где растения Nicotiana tabacum SRI и арабидопсиса после введения в них антисмыслового супрессора гена ПДГ характеризовались увеличенным содержанием Про и повышенным осмотическим давлением клеточного сока даже без внесения соли. Также эти растения проявляли повышенную устойчивость к засолению и токсическим аналогам Про [Колодяжная и др., 2006]. В работе, выполненной Nanjo с соавт. [1999 а] на растениях арабидопсиса, трансформированных супрессором гена ПДГ, было показано, что трансгенные растения проявляли устойчивость к холодовому и солевому стрессам, накапливая Про в больших количествах, чем нетрансгенные. Однако в работе Mani с соавт. [2002] растения арабидопсиса, также экспрессирующие антисмысловой супрессор гена ПДГ, не обладали повышенной устойчивостью к засолению. Таким образом, для исследования физиолого-биохимических последствий супрессии ПДГ необходимы дальнейшие исследования. Суперэкспрессия гена пролин-5-карбоксилат синтетазы у трансгенных растений пшеницы вызывала увеличение содержания Про и повышала солеустойчивость [Sawahel, Hassan, 2002]. Водоросли Chlamydomonas, с встроенным геном пролин-5-карбоксилат синтетазы имели на 80 % более высокий уровень свободного Про по сравнению с нетрансгенными, и были более устойчивы к действию тяжелых металлов [Siripomadulsil et al., 2002]. Суперэкспрессия гена орнитин-д-аминотрансферазы в растениях риса в 5-15 раза увеличивала содержание Про при осмотическом стрессе и способствовала сохранению урожая в стрессорных условиях [Han, Hwang, 2003]. В работе Roosens с соавт. [2002], встраивание этого гена в растения табака также увеличивало синтез Про и осмоустойчивость трансгенных растений. Совокупность этих данных однозначно доказывает, что полученные нами растения являются трансгенными и содержат чужеродный ген ПДГ в антисмысловой ориентации. Это приводит к ингибированию экспрессии гена ПДГ самого растения и снижению интенсивности деградации пролина, следствием чего является его большая аккумуляция. На последнем этапе работы нам предстояло проверить, являются ли полученные нами трансгенные растения более солеустойчивыми. Аргументом в пользу более высокой солеустойчивости является способность трансгенных растений поддерживать осмотический потенциал клеток корня на более низком уровне по сравнению с исходными контрольными растениями (рис.11). Из рисунка видно, что при добавлении соли осмотический потенциал уменьшался значительно скорее в листьях трансформированных растений, чем в листьях контрольных. У линий сорта Ольга его значения составили -2.31 МПа для линии 0-R-52 и -1.61 МПа для линии O-F-43, что значительно ниже, чем у контрольных растений (-1.2 МПа). У линий сорта Вестар аналогичные показатели составили -2.27 МПа для линии B-R-22 и -1.51 МПа для линии B-F-32, у нетрансформированных растений значение осмотического потенциала составило -1.1 МПа. Т.е. водообеспечение трансгенных растений было значительно выше, чем контрольных. Особенно сильно этот эффект проявился для линий R. Похожие результаты наблюдали и Кочетов с соавт. [2004], где трансформированные растения табака (6-10 недель), несущие антисмысловой супрессор ПДГ, имели более низкое осмотическое давление клеточного сока ( 1.129 - -2.884 МПа), чем контрольные растения (-0.793 МПа). Однако содержание Про по данным этих авторов слабо коррелировало со значением осмотического давления клеточного сока (г = 0.30) [Kochetov et al., 2004]. Влияние NaCl на содержание Na+ и К+ в листьях растений рапса Мы предположили, что одним из факторов более значительного снижения осмотического потенциала в трансгенных растениях было усиленное поглощение ионов этими растениями. Из таблицы. 14 видно, что при засолении 200 мМ NaCl содержание ионов Na+ в трансгенных растениях обоих сортов увеличивалось сильнее, чем в нетрансформированных растениях. При этом оно было несколько выше у растений обоих сортов, трансформированных конструкцией R, - 70.4 мкэкв/г см. для линии 0-R-52 сорта Ольга и 60.1мкэкв/г см. для линии B-R-22 сорта Вестар. Аналогичные значения были и у растений, трансформированных конструкцией F,: 61.9 мкэкв/г см. у линии 0-F-43 сорта Ольга и 52.6 мкэкв/г см. у линии B-F-32 сорта Вестар.
