Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Гибриды соматических клеток и их выделение 11
1.2. Сегрегация хромосом в гибридах соматических клеток 14
1.2.1. Предполагаемые механизмы сегрегации хромосом в гибридах соматических клеток 16
1.3. Гибридные клетки, полученные от слияния эмбриональных стволовых и соматических клеток 21
1.3.1. Сегрегация хромосом в клеточных гибридах, полученных слиянием эмбриональных стволовых и соматических клеток 25
1.4. Цитогенетические методы идентификации родительских хромосом в клеточных гибридах 28
1.4.1. Дифференциальное окрашивание хромосом 28
1.4.2. Методы in situ гибридизации 29
1.4.3. Исследование клеточных гибридов и химерных мышей с помощью цитогенетических методов 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 34
2.1. Материалы 34
2.1.1. Клеточные линии...: 34
2.1.2. ДНК пробы 35
2.2. МЕТОДЫ 35
2.2.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом 35
2.2.3. QFD - дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 36
2.2.4. Бнотинилирование зондов 36
2.2.5. FISH с видоспецифичными зондами, мечеными биотином 37
2.2.6. FISH с геномной ДНК М. caroli 38
2.2.7. Двухцветная FISH с видоспецифичным и хромосомо-спсцифичным зондами 39
2.2.8. FISH с хромосомо-специфичным зондом на Y-хромосому 40
2.2.9. Микроскопирование и обработка изображений 40
ГЛАВА 3. Результаты 41
3.1. Анализ кариотипаэс клеток родительской линии нм-1 41
3.2. Исследование динамики числа хромосом в клеточных гибридах типа эс-эс 47
3.3. Цитогенетический анализ клонов межвидовых гибридных клеток 51
3.3.1. Распределение числа хромосом в клетках гибридных клонов 51
3.3.2. Анализ соотношения хромосом М. musculus и М. caroli в гибридных клетках 55
3.3.3 Исследование сегрегации гомеологов хромосом 1, 17 и X в клонах гибридных клеток 62
3.3.3.1. Сегрегация Х-хромосом 62
3.3.3.2. Сегрегация гомеологов хромосомы I 67
3.3.3.3. Сегрегация гомеологов хромосомы 17 72
3.3.4. Анализ элиминации Y-хромосомы М. musculus в гибридных клетках 75
3.3.5. Хромосомные перестройки в клонах гибридных клеток серии НМС 77
ГЛАВА 4. Обсуждение 80
Выводы 90
Список литературы 92
Приложение 105
- Предполагаемые механизмы сегрегации хромосом в гибридах соматических клеток
- Цитогенетические методы идентификации родительских хромосом в клеточных гибридах
- Двухцветная FISH с видоспецифичным и хромосомо-спсцифичным зондами
- Исследование сегрегации гомеологов хромосом 1, 17 и X в клонах гибридных клеток
Введение к работе
Актуальность. Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки обладают плюрипотентными и даже тотипотентными свойствами, которые сохраняются при длительном культивировании in vitro (Hogan et al, 1994; Smith, 2001; Hubner et al, 2003; Toyooka et al, 2003; Geijsen et al., 2004). Потенциал ЭС клеток наиболее полно раскрывается при их комбинировании с эмбрионами ранних стадий развития (морулы, бластоцисти). В этом случае ЭС клетки способны участвовать в формировании химер, причем, вклад ЭС клеток прослеживается во всех соматических тканях и в зародышевом пути (Robertson, Bradley, 1986; Robertson, 1987; Allan, 1987; Joyner, 1993; Hogan et al., 1994). По существу, ЭС клетки позволили установить «мост» между методами изучения развития in vivo и in vitro, существенно расширяя возможности исследования процессов дифференцировки и репрограммирования геномов дифференцированных клеток.
Впервые попытка использовать высокий потенциал ЭС клеток для репрограммирования генома дифференцированных клеток была реализована в экспериментах по гибридизации ЭС клеток мыши со спленоцитами взрослых животных (Матвеева и др., 1996). Гибриды типа ЭС-спленоцит сохраняли плюрипотснтность на высоком уровне, вплоть до способности генерировать химерных животных (Matveeva ct al, 1998). Высокие плюрипотентные свойства были также выявлены в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС клеток мыши с тимоцитами (Tada et al, 2001; 2003) или незрелыми клетками-предшественниками гематопоэза или нейроіенеза (Terada et al, 2002; Ying et al., 2002). Эти эксперименты показали, что потенциал ЭС клеток сохраняется в геноме гибридных клеток и способствует восстановлению плюрипотентности генома дифференцированных клеток.
Однако при изучении механизмов репрограммирования необходимо знать реальное соотношение родительских геномов в гибридных клетках и об изменениях их кариотипа в процессе культивирования in vitro. Между тем, до настоящего времени не были проведены детальные цитогенетические исследования гибридов, полученных от слияния ЭС и дифференцированных клеток Имеются лишь огрывочные, к тому же противоречивые, данные по сегрегации хромосом в гибридных клетках типа ЭС-дифференцированная клетка. Согласно данным одних авторов (Tada et al., 2001; 2003; Terada et al., 2002; Ying et al, 2002), гибридные клетки мыши типа ЭС-дифференцированная клетка сохраняют тстрагатоидный набор хромосом, формирующийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. Однако по данным других авторов при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭС-спленоцит была выявлена отчетливая преимущественная элиминация только хромосом спленоцитов (Matveeva et al, 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2001). Сегрегацию хромосом в гибридных клетках, образовавшихся in vivo or слияния незрелых клеток-предшественников гематопоэза с клетками печени, описали Вассилопоулус и Ванг с соавторами (Vassilopoulos et al, 2003; Wang et al, 2003). Важно также подчеркнуть, что в последнее время все большее внимание исследователей привлекает спонтанное слияние клеток in vivo, то есть
мкх нлцаояддьлля J
образование гибридных клеток в разных органах и тканях взрослого животного. Биологические свойства и кариотипы таких гибридных клеток мало исследованы, хотя и представляют несомненный интерес как для специалистов в области канцерогенеза, так и для тех, кто исследует потенции стволовых клеток in vivo (Alvarez-Dolado et al, 2003; Speers et a!, 2003; Vassilopoulos, Rusell, 2003; Que et al, 2004; Mortensen et al., 2004). Следует отметить, что применение цитогенетических методов для идентификации хромосом у внутривидовых и межвидовых гибридов, полученных от близких видов, затруднено из-за морфологического сходства гомологичных хромосом.
Таким образом, не вызывает сомнений актуальность цитогенетического исследования гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка для установления соотношения родительских хромосом в гибридном геноме и их эволюции при культивировании in vitro Знание о реальном соотношении родительских хромосом абсолютно необходимо как для оценки плюрипотентности генома гибридных клеток, так и для исследования механизмов репрограммирования хромосом дифференцированных клеток.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является цигогенетический анализ хромосомного состава набора клонов межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток Mus musculus со спленоцитами Mus caroli Выбор азиатской мыши М caroli был обусловлен несколькими соображениями, во-первых, М. musculus и М caroli являются близкими видами со сходным онтогенезом относительно временных параметров, о чем свидетельствует возможность получения полноценных химер посредством агрегации 8-клеточных эмбрионов обоих видов; во-вторых, межвидовые іибридьі, полученные от скрещивания М. musculus и М caroli, развиваются нормально, хотя и стерильны (Rossant, Frels, 1980; Rossant, Chapman, 1983); в-третьих, M musculus и М caroli имеют сходные, если не идентичные, карної ипы по числу и морфологии хромосом; в-четвертых, имеется зонд, который позволяет дискриминировать центромеры хромосом М musculus и М caroli в гибридном геноме (Siracusa et al., 1983).
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать кариотип ЭС клеток родительской линии НМ-1 в ходе длительного культивирования т vitro.
-
Изучить хромосомный состав 6-ти клонов гибридных клеток серии D3T, полученных от слияния двух линий плюриногентных ЭС клеток, D3 и TgTP6 3, для оценки изменений тетраплоидного кариотипа при длительном культивировании in vitro.
-
Провести детальный цитогенетический анализ 20-ти клонов межвидовых гибридных клеток, полученных от слияния ЭС клеток М musculus со спленоцитами взрослой самки азиатской мыши М caroli Данный анализ включал:
а) подсчет хромосом в гибридных клетках индивидуальных клонов;
б) оценку количественного соотношения родительских хромосом в
геноме гибридных клеток;
в) оценку количественных соотношений гомеологов хромосом 1, 17 и X М musculus и М caroli в геноме гибридных клонов.
Научная новизна и практическая значимость
-
Данная работа представляет собой первое детальное цитогенетическое исследование количественного соотношения родительских хромосом гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток со спленоцитами взрослого животного.
-
Установлено, что в большинстве клонов (90%) межвидовых іибридльїх клеток ЭС-спленоцит наблюдается сегрегация хромосом, вплогь до образования гибридных клеток с околодиплоидным набором хромосом.
-
Установлено, что примерно в 50% клонов имела место односторонняя элиминация только хромосом М caroli.
4 Впервые выявлена двусторонняя сегрегация родительских
хромосом, хотя и с заметным преобладанием сегрегации хромосом М caroli.
-
Впервые выявлена «скрытая» сегрегация соматического партнера (М caroli), в результате чего около 20% гибридных клонов с околотетраплоидным набором хромосом содержали либо единичные хромосомы М. caroli, либо ограниченное их количество (не более 10).
-
Установлена предпочтительная сегрегация гомологов хромосом 1, 17 и X М caroli в большинстве исследованных клонов. Важно отметить, что во многих клонах ирисутсівовали гибридные клетки без Х-хромосомы М caroli, несмотря на то, что она несет селективный маркер.
Описанную двустороннюю сегрегацию родительских хромосом и особенно явление сокрытой» сегрегации хромосом соматического партнера следует учитывать при оценке потенциала гибридного генома и в экспериментах, связанных с изучением механизмов репрограммирования.
Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 1-ом съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на 3-ем съезде ВОГиС (Москва, 2004), на международной конференции «Биология клетки в кульгуре» (Санкт-Петербург, 2004).
Материалы диссертации изложены в 2 статьях, опубликованных в отечественном и международном журналах.
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 7 таблиц.
Предполагаемые механизмы сегрегации хромосом в гибридах соматических клеток
При изучении соматических гибридных клеток, были высказаны некоторые гипотезы сегрегации хромосом:
1) Различие в плоидности родительских клеток может являться причиной сегрегации хромосом партнера с низкой плоидностью. В 1971 появилась работа, в которой было показано, что в гибридах человек - мышь (4п-2п) сохраняется большинство хромосом человека, тогда как в гибридах с соотношением геномов 2п-2п наблюдалась элиминация хромосом человека (Jami, Grand champ, 1971). Однако по данным Шелл и Речштейнера (Schall, Rechsteiner, 1978) в гибридах человек - мышь с соотношением геномов 4п-2п и 2п-2п не отмечено различия в скорости или в направлении сегрегации хромосом человека. Согласно данным Грейвс (Graves, 1984), в гибридах мышь-хомячок (4п-2п) сохраняются лишь единичные хромосомы хомячка, в отличие от гибридов типа мышь-хомячок (2п-4п), где наблюдается потеря наоборот хромосом мыши. Интерпретация этих данных осложняется тем, что в исследованных гибридах не ясно соотношение хромосом при слиянии, поскольку гибридные клетки, содержащие 2 набора генома мыши и 1 набор генома человека, могут возникать как от слияния трех диплоидных клеток, двух клеток мыши и одной человека, так и от слияния одной клетки с диплоидным набором, с клеткой с тетраштоидным набором хромосом. Теоретически возможен и третий механизм возникновения гибридных клеток такого рода как результат эндоредушшкации. Гибридные клетки, содержащие 2 набора одного родителя и 1 набор другого и даже в соотношении 6п-4п хромосом, описаны несколькими независимыми группами исследователей (Matsuya et al., 1968; Nabholz et al., 1969; Koyama ct al., 1970; Ricciuti, Ruddle, 1971; Jami et ah, 1971; Marin, Pugliatti-Crippa, 1972; Labella et al., 1973). Грейвс (Graves, 1984) предполагает, что уровень сегрегации и её направление в таких гибридных клетках зависит от плоидности генома партнеров по слиянию и обусловливается либо ядерными, либо цитоплазматическими неидентифицированными факторами.
Интересно отметить, что описаны исключения от упоминавшегося выше утверждения о том что, в гибридных клетках мыши и человека происходит утрата хромосом человека (Weiss, Green, 1967; Migeon, Miller, 1968; Nabholz et al., 1969; Ruddle et al., 1970). Так Джами и соавторы (Jami et al., 1971) исследовали серию гибридных клеток мыши и человека, В одной из линий этих клеток сохранялись почти все хромосомы человека, а набор мышиных хромосом был резко уменьшен. Такая же сегрегация хромосом мыши в гибридах между диплоидными клетками мыши и клетками трансформированной линии человека показана в работе Минна и Кун (Minna, Coon, 1974). Некоторые, но не все, гибриды между диплоидными клетками мыши и крысы и околодиплоидными НТ-1080 линиями фибросарком человека показали сегрегацию хромосом мыши и крысы (Сгосе, 1976; D Ancona, Сгосе, 1979). Как считают авторы, причиной сегрегации является доминантность трансформированной линии над нормальной родительской линией. Причина сегрегации может быть связана также с исходным соотношением хромосом, поскольку большинство клеток трансформированных линий человека и мыши имеют околотетраплоидный набор хромосом.
Таким образом, корреляция между сегрегацией хромосом и исходным соотношением хромосом в межвидовых гибридных клетках может быть фактором, влияющим на направление сегрегации хромосом (Graves, 1984).
2) Сегрегация хромосом в гибридных клетках может зависеть от длительности клеточных циклов родительских клеток (Рингерц, Сэвидж, 1979).
Ранее предполагали, что геном быстро делящейся родительской клетки доминирует в гибридных клетках и, как следствие, его хромосомы предпочтительно сохраняются. Такая корреляция была отмечена в гибридных клетках, полученных слиянием медленно делящихся и быстро делящихся клеток (Као, Puck, 1970). Согласно предположению Миджен и Грина (Migeon, 1968; Green, 1969), во время первых делений гибридных клеток, два родительских набора начинают синтез ДНК синхронно, но заканчивают асинхронно, что может вызвать преждевременную конденсацию хромосом одного родительского набора в гибридной клетке (Graves, 1972а), Хромосомы с незавершенной репликацией могут повреждаться и теряться в последующих митозах (Migeon, 1968). Эта гипотеза предполагает, что хромосомы родительской клетки с длинной S-фазой должны сегрегировать предпочтительно. Опубликованные данные (в большинстве случаев на гибридных клетках мышь или китайский хомячок-человек) в основном согласуются с гипотезой, что хромосомы быстро делящийся родительской клетки предпочтительно сохраняются в гибридных клетках (Weiss, Green, 1967; Labella et al., 1973). Однако были найдены и исключения (Graves, 1972b; Labella etal., 1976).
Позднее этот вопрос исследовался Грейвс и Ригли (Graves, Wrigley, 1986) путем анализа параметров клеточного цикла родительских клеток мыши, китайского хомячка, утконоса и в гибридных клетках утконос-мышь и утконос-китайский хомячок. В результате исследований авторы не нашли никакой корреляции между направлением сегрегации и относительной продолжительностью клеточного цикла родительских клеток. Более того, в некоторых случаях, хромосомы медленно делящихся родительских клеток мыши зачастую сохранялись предпочтительно в гибридных клетках мышь - китайский хомячок (Graves, Wrigley, 1986).
3) Предполагается также, что сегрегация хромосом в межвидовых гибридных клетках может зависеть от происхождения веретена деления гибридных клеток. Возможно, что хромосомы каждого вида имеют различную способность связывания с веретеном, то есть, не исключено, что это связывание носит видоспецифический характер (Рингерц, Сэвидж, 1979; Graves, Zelesco, 1988). Для выяснения роли белков веретена в сегрегации родительских хромосом были исследованы клеточные гибриды китайский хомячок-мышь, в которых была возможность избирательно влиять на экспрессию колцемид-чувствительного р-тубулина хомячка, одного из белков веретена. Авторы (Graves, Zelesco, 1988) исходили из предположения, что селективное подавление экспрессии тубулина китайского хомячка приведет к тому, что веретено гибридных клеток будет представлено только тубулином мыши, что в свою очередь может повлиять на предпочтительное сохранение хромосомы мыши. Однако было показано, что репрессия тубулина хомячка (с помощью видоспецифических антител) не влияет на направление сегрегации хромосом в исследованных гибридных клонах. Некоторые из них теряли в основном хромосомы мыши, тогда как другие теряли хромосомы хомячка.
Цитогенетические методы идентификации родительских хромосом в клеточных гибридах
Для цитогенетического исследования хромосомного состава гибридных клеток используются различные методы окрашивания хромосом, включающие рутинную и дифференциальную окраску хромосом, и методы молекулярной цитогенетики, основанные на гибридизации in situ с использованием разного рода зондов как индивидуальных, так и в различных комбинациях. Рутинное окрашивание используется для анализа общей морфологии хромосом. В настоящее время такой подход относительно редко используется в цитогенетических исследованиях кариотипа млекопитающих. Идентификация индивидуальных хромосом в кариотипах млекопитающих стала возможной благодаря разработке методов дифференциальной окраски, в результате которой каждая хромосома приобретает свой неповторимый индивидуальный рисунок и, следовательно, узнаваема. Q- дифференциальное окрашивание (QFQ- Q bands by fluorescence using quinacrine). Впервые Касперссон с сотрудниками показали, что после окраски хромосом АТ-специфичным флуорохромом (акрихином), в них выявляются сильно и слабо окрашенные сегменты, которые получили название Q-положительных и Q-отрицательных сегментов (Caspersson et al., 1968, 1971).
G- дифференциальная окраска (GTG — bands by trypsin using Giemsa). Наиболее распространенным способом идентификации хромосом в гибридах соматических клеток является G-окрашивание хромосом красителем Гимза после обработки препаратов метафазных хромосом трипсином (Seabright, 1971). Характер чередования сильно и слабо окрашенных бэндов сходен с рисунком Q-дифференциальной окраски. В ряде случаев G-дифференциальная исчерчен ность позволяет не только идентифицировать хромосомы в клеточных гибридах, но и выявлять в них хромосомные перестройки. Однако даже высокого уровня разрешения (Yunis, 1976) часто бывает недостаточно, чтобы выявить перестроенный район размером меньше среднего размера G-сегмента. По составу и свойствам G-позитивные и G-негативные районы различаются, для G-позитивных сегментов характерна поздняя репликация, ранняя конденсация, обогащен ность AT основаниями и длинными диспергированными повторенными последовательностями. Для G-негативных бэндов свойственна, наоборот, ранняя репликация, поздняя конденсация, обогащенность ГЦ основаниями и короткими диспергированными повторенными последовательностями. R- дифференциальное окрашивание (RHG — R bands by heating using Giemsa)-рисунок полос ревертирован по отношению G- или Q-сегментам. Выявляется при предобработке цитологических препаратов хромосом в различных солевых растворах при высокой температуре (Dutrillaux, Lejeune, 1971), с последующей обработкой красителем Гимза, либо флуоресцентным красителем акридином оранжевым.
С- дифференциальное окрашивание (CBG - С - bands by barium hydroxide using Giemsa). При этом способе окраски хромосом препараты кратковременно обрабатываются растворами NaOH или Ва(ОН)г, затем инкубируются в 2xSSC буфере (Arrighi, Hsu, 1971; Sumner, 1972), после чего окрашиваются красителем Гимза. Такой способ окраски выявляет конститутивный гетерохроматин, QFD-диференциальное окрашивание (Q- bands by fluorescence using DAPI). DAPI (4\6- diamidino-2-phenylindole) - флуоресцирующий краситель, интеркалирующий в ДНК, имеет сродство к AT- богатым районам (Mogens, 1990). QFD окрашивание хромосом имеет значительное сходство с GTG- окраской (Schnedl et al., 1980). Благодаря компьютерной обработке QFD-окрашенных хромосом с помощью специальной программы ISIS (In Situ Imaging System) компании MetaSystems GmbH, разрешение метода стало сравнимо с GTG- бэндингом.
Длительное время для изучения хромосомного состава межвидовых гибридных клеток наиболее популярно было использование G-окраски хромосом. Однако эти методы малопригодны для определения видовой принадлежности хромосом в межвидовых гибридных клетках близких видов.
Несомненным достижением цитогенетики явяется разработка метода in situ гибридизации меченой ДНК с метафазными хромосомами. В настоящее время для визуализации в цитологических структурах соответствующих последовательностей ДНК наиболее широко используется флуоресцентная in situ гибридизация (Fluorescence In Situ Hybridization - FISH).
Принцип FISH заключается в денатурации ДНК зонда и ДНК цитологического препарата с последующей совместной ренатурацией, обеспечивающей формирование дуплексов меченой ДНК зонда и ДНК препарата. Несвязанная с ДНК препарата меченая ДНК отмывается, после чего проводится детекция гибридизованного зонда под флуоресцентным микроскопом.
Первоначально в гибридизации in situ использовали радиоактивно-меченые зонды. Метод был достаточно трудоемким и имел невысокое разрешение. В настоящее время используются методы нерадиоактивного мечения и детекции, которые менее трудоемки и более безопасны. Зонды ДНК, используемые при гибридизации in situ, метят 2-мя основными способами: 1. Зонды ДНК метят непосредственно флуоресцирующими молекулами, конъюгированными с нуклеотидами. 2. Зонды ДНК метят репортерными молекулами (биотин, дигоксигенин и т.д.), которые затем детектируются с помощью других соединений, конъюгированных с флуорохромами (например, флуоресцеинизатиоцианатом- FITC или родамином). В настоящее время наиболее популярны ДНК зонды, меченные биотином и дигоксигенином (Pinkel et al., 1986). В зависимости от целей, в качестве ДНК зондов могут использоваться любые клонированные фрагменты ДНК, суммарная геномная ДНК, а также ДНК фракционированных целых хромосом или их отдельных районов. Имеет смысл, более подробно остановится на хромосомо-специфичных пробах. Как правило, для создания таких проб используются ДНК индивидуальных хромосом. Одним из способов выделения индивидуальных хромосом является фракционирование хромосом. В этом случае индивидуальные хромосомы выделяются из суспензии метафазных хромосом с помощью проточной цитофлуорометрии в комбинации с клеточным сортером (Scherthan et al., 1994; Ferguson-Smith, 1997). Технику проточной цитофлуорометрии для сортировки хромосом впервые использовали Грей и соавторы (Gray et al., 1975). Принцип работы этого комплекса приборов заключается в идентификации окрашенной флуорохромами хромосомы по уровням их свечения, выделении ее в микрокаплю и направлении этой микрокапли по определенной траектории в индивидуальную фракцию. Многие хромосомы могут быть разделены по размеру и сортированы в виде индивидуальных фракций. В последнее время для размножения полученного таким образом материала ДНК используют ПЦР с частично вырожденными праймерами (Telenius et al., 1992).
Двухцветная FISH с видоспецифичным и хромосомо-спсцифичным зондами
Для определения видовой принадлежности гомологичных хромосом в гибридной клетке проводили двухцветную FISH с помощью хромосомо-специфичного зонда, меченого дигоксигенином, и видоспецифичного зонда меченого биотипом. Видоспецифичный зонд биотинилировали методом ник-трансляции, как описано выше. Хромосомо-специфичные зонды были мечены дигоксигенином с помощью ПЦР. Эту процедуру мечения выполняла сотрудница лаборатории цитогенетики человека и животных Н.А. Сердюкова. Препараты метафазных хромосом обрабатывали раствором РНК-азы как описано выше. Затем предметные стекла отмывали в 2xSSC, обезвоживали последовательно в спиртах. Денатурацию ДНК проводили в 70% растворе формамида при 70С в течение 2-3 мин. Стекла быстро переносили в охлажденный во льду 70% этанол на 2 мин, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и высушивали при комнатной температуре. Хромосомо-специфичные зонды растворяли в гибридизационном буфере (2 мкл зонда и 15 мкл гибридизационного буфера на стекло). Денатурацию производили при 95 С в течение 6 мин, затем при 37 С в течение 1 ч. Видоспецифичную биотинилированную пробу растворяли в гибридизационном буфере (10 мкл на стекло). Денатурацию производили при 95С в течение 15 мин. Затем смешивали 2 пробы и наносили по 20 мкл на стекло. Препараты инкубировали в течение 12 - 18 ч при 37С во влажной камере. Стекла отмывали в 50% растворе формамида 3 раза по 3 мин при 45С, затем в 2xSSC при 45С в течение 3 мин. Детекцию производили так же, как и при гибридизации in situ с видоспецифичным биотинилированным зондом, как описано выше, за исключением того, что при накладывании последнего слоя, смешивали анти-дигоксигенин-родамин и ФИТЦ-авидин и наносили по 20 мкл на одно покровное стекло и инкубировали 40 мин во влажной камере при 37С. Отмывали в 4xSSC, содержащем 0,1% Tween 20, 3 раза по 2 мин при 37С. Обезвоживали последовательно в спиртах и высушивали при комнатной температуре. Хромосомы подкрашивали в растворе DAPI, отмывали в 2xSSC, затем в воде. Стекла высушивали при комнатной температуре. Под покровное стекло наносили по 5 мкл раствора антифейда. При проведеними FISH с хромосомо-специфичным зондом на Y-хромосому мыши, мы следовали инструкциям фирмы производителя Опсог. Препараты анализировали на микроскопе Axioskop 2 фирмы ZEISS оснащенном комплектом интерференционных фильтров.
Ввод цифровой информации производится с помощью черно-белой CCD-камеры VC-44 (РСО:). Изображение обрабатывали с помощью пакета прикладных программ ISIS3 (In Situ Imaging System) компании MetaSystems GmbH. Для того чтобы оцепить изменения кариотипа ЭС клеток в ходе продолжительного культивирования in vitro, мы анализировали хромосомный состав клеточной линии НМ-1 в течение 3-4 месяцев культивирования. Анализ метафазных пластинок, окрашенных DAPI, проводился с интервалом в 10 пассажей, начиная с 30-го и по 60-й. Согласно данным И.В. Ролинской и Е.М. Кафтановской, проводившим ранее несколько независимых анализов кариотипа клеток НМ-1 на 18-20-х пассажах, более 90% клеток имели нормальный диплоидный кариотип, а менее 10% клеток были трисомные по хромосомам 8 и 11 (Таблица 2). В исследованной выборке не было выявлено клеток с трисомией только по одной из этих хромосом. Важно отметить, что на этих же пассажах (18-20-й) клетки НМ-1 использовали в опытах по слиянию со спленоцитами М. caroli.
В нашем распоряжении были две культуры клеток НМ-1 на 30-м пассаже. Обе культуры происходили от двух независимых разморозок. Цитогенетический анализ показал, что одна культура имела нормальный диплоидный кариотип в 94% клеток (рис.1), а 6% клеток были трисомные по хромосомам 8 и 11 (рис.2). На 40-м пассаже кариотип мало отличался от 30-го пассажа. В отличие от первой, другая культура НМ-1 содержала до 41% клеток трисомных по хромосомам 8 и 11 (Таблица 2). Удивительно, но анализ на последующих пассажах второй культуры показал, что процент трисомных клеток резко снижался так, что нам не удалось выявить их на 40-м и 50-м пассажах, а на 60-м пассаже найдено только 4% таких клеток (Таблица 2). Такая необычная динамика трисомии по хромосомам 8 и 11 в культурах НМ-1 связана скорее с эффектом выборки, чем с истинным накоплением трисомных клеток при длительном культивировании ЭС клеток. При длительном культивировании клеток НМ-1 нами отмечено увеличение процента клеток, в которых отсутствует Y-хромосома (рис.3; Таблица 2). На 31-м пассаже Y-хромосома присутствовала во всех исследованных клетках, однако уже на 40-м пассаже Y-хромосома не была обнаружена в 10% клеток, а на 50-м и 60-м пассажах в 21% и 48% клеток, соответственно (рис.3; Таблица 2).
К другим отклонениям от нормального диплоидного набора хромосом в клетках НМ-1 в ходе культивирования следует отнести присутствие 2-4% клеток, имевших околотетраплоидный набор хромосом. Следует отметить, что такой уровень тетраплоидных клеток наблюдался во всех исследованных культурах НМ-1 независимо от продолжительности культивирования. Особо следует остановиться на выявленных структурных хромосомных перестройках в культуре клеток НМ-1. На рис.4 показаны две хромосомные перестройки в клетках НМ-1. Одна перестройка была представлена в виде метацентрической хромосомы, несвойственной нормальному кариотипу мыши (рис.4А). Она была выявлена в культуре после 30-го пассажа и наблюдалась в последующих пассажах. Другая перестройка была нами обнаружена после 50-го пассажа (рис.4Г; Таблица 2). По морфологии и DAPI бэндингу метацентрическая хромосома (рис.4А) имеет сходство с изохромосомой Y. Это предположение нашло подтверждение в опыте по гибридизации in situ с использованием меченого зонда, специфичного для Y-хромосомы мыши (рис.4Б). Вторая выявленная перестроенная хромосома, при окрашивании DAPI, имеет сходство с хромосомой 14 (рис.4Г). Предположительно эта перестроенная хромосома содержит материал хромосомы 14, но в дистальнои части увеличено присутствие DAPI-положительного материала неизвестного происхождения и меняющего привычную морфологию хромосомы 14 (рис.4В).
Исследование сегрегации гомеологов хромосом 1, 17 и X в клонах гибридных клеток
Для более детального изучения сегрегации гомологичных хромосом в гибридных клетках, мы провели эксперименты с применением метода двухцветной FISH с использованием зонда pMSat5, видоспецифичного для хромосом М. musculus, и хромосомо-специфичных зондов для хромосом 1, 17 и X мыши. Такой анализ позволил нам достаточно надежно идентифицировать родительскую принадлежность гомеологов хромосом 1, 17 и X, благодаря тому, что гомеологи, окрашенные хромосомо-специфичными зондами, имели или не имели позитивный сигнал, специфичный для М musculus, в центромерном районе.
Нами были проведены эксперименты с двойной меткой на 18 клонах гибридных клеток с использованием видоспецифичного зонда для хромосом М. musculus и хромосомо-специфичного зонда для Х-хромосомы мыши. В результате такого анализа нам удалось надежно идентифицировать количество и видовую принадлежность Х-хромосом в клетках гибридных клонов. Хромосомо-специфичный зонд позволяет определить общее количество Х-хромосом в гибридной клетке, а видоспецифичный позитивный сигнал в центромерном районе Х-хромосомы М musculus позволяет четко отличить ее от Х-хромосомы М. caroli (рис.15Г). В качестве контроля брали родительскую линию НМ-1 с диплоидным набором хромосом. В диплоидном наборе эта линия имеет одну Х-хромосому. На рис.15А видно, что меченый дигоксигенином хромосомо-специфичный зонд для Х-хромосомы мыши дает сильный сигнал по всей длине Х-хромосомы, окрашивая ее в красный цвет. Как отмечалось выше, меченый биотином видоспецифичный зонд pMSat5 гибридизуется с центромерами большинства хромосом М. musculus, включая Х-хромосому, и не дает перекрестной реакции ни с одной хромосомой М. caroli (рис.10А,Б). В клетках НМ-1 меченый биотином зонд pMSat5 окрашивает центромеру Х-хромосомы в зеленый цвет (рис. 15А).
При слиянии клеток НМ-1 со спленоцитами взрослой самки М. caroli ожидается присутствие 3Х-хромосом в гибридной клетке, две из которых М. caroli и одна М. musculus. На рис.15 приведены данные по анализу двухцветного мечения X-хромосом в некоторых гибридных клонах. Из рис.15 следует, что гибридные клетки содержат одну, две и реже три Х-хромосомы, то есть наблюдается существенное отклонение от ожидаемого числа Х-хромосом. Ожидаемое соотношение родительских гомологов Х-хромосом найдено в клоне НМС4 (рис. 15В) в 36% клеток и в клонах НМС15 в 8% клеток и НМС23 в 7% клеток (Таблица 3). В большинстве исследованных клонов наблюдали отклонение от ожидаемого соотношения родительских Х-хромосом (рис.15Б,Г,Д,Е, Таблица 3). Как показано в рис.15Г\ клетка НМС56 содержит 2Х-хромосомы, одна принадлежит М. musculus, а другая М. caroli. Из данных Таблицы 3 можно видеть, что исследованные клоны гибридных клеток можно разделить на 2 группы:
1. Клоны, в которых 80% - 100% клеток содержат 2Х-хромосомы, причем одна принадлежит М. musculus\ а другая - М. caroli (рис.15Г). В клонах НМС28 и НМСЗО клетки с таким сочетанием родительских Х-хромосом составляли 100% клеток (Таблица 3).
2. В другой группе клонов большинство гибридных клеток содержит три X-хромосомы, из которых две принадлежат М. musculus, а одна М. caroli. Следует отметить что, эта группа клонов (за исключением клона НМС50) характеризуются «скрытой» сегрегацией хромосом (рис.15Б; Таблица 3). Следует особо подчеркнуть, что, несмотря на то, что гибридные клетки постоянно культивировали в среде ГАТ, то есть в селективных условиях, почти во всех клонах, за исключением клонов НМС28, НМСЗО, НМС48, встречались клетки, которые содержали одну или две Х-хромосомы М. musculus, но не содержали X-хромосому М. coroli (рис. 15Д,Е). Процентное содержание таких клеток варьирует от 6% (в клоне НМС42) до 24% (в клоне НМС58) (Таблица 3). Появление таких гибридных клеток и их выживание в селективных условиях культивирования возможно только за счет кооперативного эффекта (Hooper, 1982) (Таблица 3).
В целом, результаты данного анализа свидетельствуют о выраженной преимущественной потере гомологов Х-хромосомы соматического партнера в подавляющем большинстве гибридных клеток. Более того, мы не обнаружили в исследованных клонах ни одной гибридной клетки, не содержащей Х-хромосому плюрипотентного партнера. Нами были проведены эксперименты с применением двухцветной метки (красной и зеленой) с помощью видоспецифичного зонда прицентромерных районов хромосом М. musculus и хромоеомо-специфичного зонда хромосомы 1 мыши для идентификации родительских гомеологов в клонах гибридных клеток. Принцип анализа результатов гибридизации in situ был таким же, как описано выше для X-хромосомы. В качестве контроля использовали родительскую линию НМ-1 с диплоидным набором хромосом. Из рис.ІбА видно, что хромосомо-специфичный зонд метит оба гомолога хромосомы І в диплоидном наборе клеток НМ-1. Всего было исследовано 14 клонов серии НМС, но один клон НМС4 имел перестройку, содержащую материал хромосомы 1 (подробнее см. ниже раздел 3.3.5 и по этой причине данные по этому клону не включены в Таблицы 4 и 5).
После слияния клетки НМ-1 и спленоцита, гибридная клетка содержит 4 гомеолога хромосомы 1: два гомолога хромосомы М. musculus и два гомолога хромосомы М. caroli. Из 13-ти исследованных клонов только в 3-х клонах, НМС2, НМС28 и НМС42, мы нашли высокий процент (от 66 до 76) клеток с таким соотношением родительских гомологов (рис.ІбГ; Таблица 4). В остальных клетках сегрегация родительских гомологов в этих клонах носила умеренный характер. Более того, эта сегрегация была без заметной видовой предпочтительности, поскольку имеются примерно в равном соотношении клетки с 3-мя копиями хромосомы 1, из которых либо 2 гомолога Ы. musculus и 1 М caroli, либо наоборот 2 М. caroli и 1 М. musculus (Таблица 4).
В остальных исследованных клонах мы наблюдали заметное отклонение от числа копий хромосомы 1, относительно ожидаемых четырех: два гомолога хромосомы М. musculus и два гомолога хромосомы М. caroli. В клоне НМС1 большинство клеток (64%) содержат 5 копий хромосомы 1, из них 2 гомолога принадлежат М. musculus и 3 гомолога М. caroli. В клоне НМС6 клетки с таким сочетанием родительских хромосом составляли 26% клеток. В данном клоне также встречались клетки с тремя копиями: 2 гомолога хромосомы М. musculus и 1 гомолог хромосомы М. caroli и четырмя копиями: 1 гомолог хромосомы М. musculus и 3 гомолога хромосомы М. caroli. В клонах НМС27 и НМС41 большинство клеток (87% и 53%, соответственно) содержат 5 копий хромосомы 1, из них 3 гомолога хромосомы М. musculus и 2 гомолога хромосомы М. сагоїі. В клоне НМС56 83% клеток содержат 3 копий хромосомы 1, из которых две принадлежат М. musculus и одна М. caroli. В клоне НМС54 78% клеток содержат 4 копий хромосомы 1 в соотношении 3:1 М. musculus и М. caroli (Таблица 4).
В 3-х клонах, НМС15, НМС47 и НМС48 мы не обнаружили присутствия хромосомы 1 М. caroli (Таблица 5), что указывает на полную потерю этими клонами соответствующей хромосомы соматического партнера (рис.16Б,В)- Интенсивная потеря гомолога М. caroli имела место также и в клоне НМС23 (Таблица 5).
Похожие диссертации на Анализ сегрегации хромосом межвидовых гибридов, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток Mus musculus и спленоцитов Mus caroli
