Введение к работе
Актуальность. Развитие начинается с деления-дробления оплодотворенной яйцеклетки - зиготы. Программа развития, заложенная в этой тотипотентной клетке, реализуется в процессе онтогенеза через дифференцировку, в результате которой формируется более 200 типов специализированных клеток, представленных во взрослом организме. Процесс дифференцировки сопровождается потерей первоначальной тотипотентности, которую можно условно градуировать: плюрипотентность, мультипотентность, коммитированность и терминальная детерминация. Важным элементом потери потенциала является ее одновекторность и, в большинстве случаев, необратимость. В нормальном развитии эукариот примеры восстановления дифференцированной клеткой утраченного потенциала чрезвычайно редки. В связи с этим исследователями не раз предпринимались попытки экспериментальным путем восстановить утраченный потенциал соматических клеток.
Одним из способов восстановления потенциала (репрограммирования) генома соматической клетки является ее слияние с эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой. В 1996 году было обнаружено, что слияние мышиных ЭС клеток и спленоцитов приводит к формированию гибридных клеток, которые обладают многими свойствами ЭС клеток, в том числе способностью участвовать в формировании химерных животных (Матвеева и др., 1996; Matveeva etal., 1998). Эти данные нашли подтверждение в целом ряде экспериментов по слиянию ЭС клеток с В- и Т-лифмоцитами (Tada etal, 2001; Kimura etal, 2004), незрелыми нейральными клетками (Do etal., 2004), незрелыми гемопоэтическими клетками (Ying etal., 2003) и фибробластами (Sullivan etal., 2006; Kruglova etal., 2008). Исследования таких гибридных клеток показали, что в них происходит: активация генов, неактивных в соматических клетках (таких как Oct4 и Nanog), реактивация неактивной Х-хромосомы, изменения профилей метилирования ДНК и модификаций гистоновых белков (Tada etal, 2001; Kimura etal, 2004; Do etal, 2007; Battulin etal, 2009). Все это является свидетельством репрограммирования, происходящего в геноме соматической клетки после слияния с ЭС клеткой. Изменения профиля экспрессии генов, происходящие в гибридных клетках такого типа, а также приобретение этими клетками плюрипотентных свойств говорит о доминировании генома ЭС клеток над геномом соматических клеток.
Представление о доминировании генома одного партнера по слиянию над другим долгое время было популярным не только для гибридных клеток, получаемых при слиянии ЭС клеток с соматическими клетками, но и для гибридов, получаемых при слиянии двух соматических клеток различной тканевой принадлежности. После слияния двух соматических клеток возможно, используя ингибиторы клеточного деления, оставить клетку на стадии гетерокариона, когда в общей цитоплазме присутствуют два ядра родительских клеток. В таких гетерокарионах, как правило, доминирует партнер с большей по объему цитоплазмой и укороченным клеточным циклом и под его воздействием меняется организация второго ядра и паттерн экспрессии генов на свойственный доминантному ядру. Примерами такого доминирования могут служить
гетерокарионы, полученные при слиянии эритроцитов птиц или амфибий с какими-либо растущими и делящимися в культуре клетками млекопитающих (Harris, 1967) или при слиянии кератиноцитов мыши с миобластами мыши (Zhang eta!., 2007). Однако недавно появилась работа, в которой показано обоюдное влияние ядер в гетерокарионах между кератиноцитами и мышечными клетками, а не доминирование одного ядра над другим (Palermo etal, 2009). Таким образом, возникает вопрос - возможно ли альтернативное проявление геномов родительских клеток при слиянии соматических клеток с ЭС клетками или же в данном случае наблюдается строгое доминирование ядер ЭС клеток?
Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение динамики становления фенотипа гибридных клеток на ранних стадиях после слияния диплоидных ЭС клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами мыши.
Для достижения целей были поставлены следующие задачи:
Модифицировать метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток на ранних стадиях после слияния ЭС клеток и фибробластов.
Провести иммунофлюоресцентный анализ маркеров плюрипотентных ЭС клеток (Oct4 и Nanog), фибробластов (коллагена I типа и фибронектина) и дифференцированных клеток (ламинаА/С) в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы (с 4-ого до 20-ого) и дни (с 1-го до 4-го) после слияния ЭС клеток и фибробластов.
Провести анализ профилей метилирования ДНК 5'-регуляторной области гена Oct4 в гибридных клетках через разные интервалы времени после слияния ЭС клеток и фибробластов.
Исследовать состояние Х-хромосом в гетерокарионах и гибридных клетках посредством иммунофлюоресцентного анализа факультативного гетерохроматина с использованием антител против триметилированного лизина в 27-ом положении в гистоне НЗ (НЗК27теЗ), маркирующего неактивную Х-хромосому.
Научная новизна и практическая значимость.
Модифицирован метод идентификации продуктов слияния ЭС клеток и фибробластов, позволяющий с 90% точностью дискриминировать гетерокарионы и гибридные клетки от гомокарионов и гибридных клеток, образовавшихся при слиянии двух родительских клеток одного типа (ЭС клетка-ЭС клетка и фибробласт-фибробласт).
Впервые обнаружено существование двух фенотипически контрастных типов гетерокарионов и гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток с диплоидными фибробластами - одни имеют признаки ЭС клеток, а другие фибробластов.
Впервые показано, что деметилирование ДНК 5'-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена Oct4 в гибридных клетках с фенотипом ЭС клеток происходит в течение первых 4-х дней после слияния, в то же время в гибридных клетках с фибробласто-подобным фенотипом происходит метилирование 5'-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена Oct4.
4. Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены в работе следующих конференций и симпозиумов: 3-я международная конференция «Наука для медицины» (Новосибирск, 2007); симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». (Москва, 2007); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2007); международная научная конференция молодых ученых «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); 4-ая международная конференция сообщества стволовых клеток северной Рейн-Вестфалии (Дюссельдорф, 2007); LXXIII симпозиум по количественной биологии (Cold Spring Harbor, 2008); 1-ый ежегодный международный конгресс по регенеративной медицине и стволовым клеткам (Фошан, 2008); V съезд Вавиловского общество генетиков и селекционеров (Москва, 2009); 5-ый международный конгресс по биотехнологии стволовых клеток (Тегеран, 2009); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009).
Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественном и международных журналах, входящих в перечень ВАК.
Положение, выносимое на защиту. В клетках, получаемых при слиянии диплоидных ЭС клеток мыши и диплоидных фибробластов мыши, начиная со стадии гетерокариона, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов. В результате чего формируются гибридные клетки, обладающие двумя контрастными фенотипами: ЭС-подобным и фибробласто-подобным.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, проиллюстрирована 27 рисунками и содержит 2 таблицы.
