Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Гибридизация клеток как способ изучения взаимодействия геномов 11
1.1.1. Гетерокарионы как модель изучения взаимодействий ядер разного типа 12
1.1.2. Гибридные клетки как модель изучения взаимодействия объединенных геномов 16
1.1.3. Соматические гибридные клетки, полученные при слиянии клеток с разной плоидностью 17
1.2. Свойства стволовых клеток эмбрионального происхождения и получение гибридных клеток между ними и соматическими клетками 18
1.2.1. Характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения 18
1.2.2. Дифференцировка стволовых клеток эмбрионального происхождения in vivo и
in vitro 21 /
1.2.3. Гибридные клетки между соматическими и стволовыми клетками 22
1.2.4. Получение химерных животных с участием гибридных клеток ЭСК-соматическая клетка как метод in vivo оценки их потенциала 25
1.2.5. Репрограммирование генома соматического партнера в гибридных клетках типа
ЭСК -соматическая клетка 26
1.3. Хромосомный состав гибридных клеток 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Клетки и клеточные линии 35
2.2. Условия культивирования клеток 36
2.3. Получение и культивирование клеточных культур и гибридных клеток 37
2.3.1. Получение культур первичных эмбриональных фибробластов 37
2.3.2. Получение линии тетраплоидных фибробластов мыши 37
2.3.3. Получение культуры фибробластов из органов и тканей взрослого животного 39
2.3.4. Получение гибридных клеток 40
2.3.5. Культивирование эмбриональных стволовых клеток и клонов гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты 40
2.3.6. Культивирование фибробластов и гибридных клеток ЭСК-тетраплоидные фибробласты 41
2.4. Анализ маркеров ЭСК в гибридных клетках 41 2.4.1. Оценка активности щелочной фосфатазы 41
2.4.2 Иммунофлуоресцентный анализ Nanog, Oct4, коллагена 1-го типа (Col-1) и фибронектина (Fbn) в ЭСК, фибробластах и гибридных клетках 42
2.4.3. Анализ экспрессии генов Oct4, Nanog, Col l и Fbn с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) 43
2.4.3.1. Выделение РНК 43
2.4.3.2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ) 43
2.5 Идентификация родительских хромосом в клонах гибридных клеток 46
2.5.1. Анализ хромосомного состава с помощью микросателлитных маркеров 46
2.5.1.1. Выделение ДНК 46
2.5.1.2. ПЦР-анализ микросателлитных маркеров 46
2.5.2. Приготовление препаратов метафазных хромосом и подсчет хромосом в клетках 48
2.5.3. In situ гибридизация с хромосомоспецифическими пробами 49
ГЛАВА 3. Результаты 51
3.1 Получение гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты 51
3.2. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-диплоидные фибробласты 52
3.3.Характеристика гибридных клеток типа диплоидные ЭСК-диплоидные фибробласты 58
3.4. Хромосомный и микросателлитный анализы клеточных культур, полученных из тканей химерных эмбрионов или взрослых химер 61
3.5. Фенотип гибридных клеток типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты 66
3.6. Хромосомный состав клонов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты 67
3.7. Анализ экспрессии маркерных генов ЭСК и фибробластов в гибридных клетках типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты 68
ГЛАВА 4. Обсуждение 71
Выводы 77
Список литературы
- Гибридные клетки как модель изучения взаимодействия объединенных геномов
- Получение культур первичных эмбриональных фибробластов
- Хромосомный состав клонов типа ЭСК-диплоидные фибробласты
- Хромосомный состав клонов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты
Введение к работе
Актуальность. Изучение природы такого свойства генома эмбриональных клеток, как плюрипотентность, является одной из важнейших задач современной биологии развития. Остаются не выясненными механизмы контроля над поддержанием или утратой плюрипотентности в ходе эмбрионального развития. Кроме этого, оставались не выясненными масштабы изменения генома плюрипотентной клетки при дифференцировке и возможность обратимости данных изменений. К настоящему времени разработано несколько экспериментальных подходов к репрограммированию соматического генома до плюрипотентного уровня. Например, с помощью переноса ядер соматических клеток в энуклеированный ооцит или оплодотворенную яйцеклетку (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998), или путем слияния эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) с соматическими клетками взрослого животного (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998; Tada et al., 2001; Serov et al, 2001; Ambrosi, Rasmussen, 2005). Такие гибридные клетки обладают всеми свойствами эмбриональных стволовых клеток, не зависимо от того, какие соматические клетки участвовали в слиянии (Tada et al, 2001; 2003; Terada et al, 2002; Ying et al., 2002; Cowan et al., 2005). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭСК-соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности - ключевого свойства ЭСК. В основе доминирования лежит репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭСК Mus muscuius domesticus и тимоцитов М. musculiis molossinus (Tada et al., 2001; 2003;). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭСК были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов ЭСК человека с фибробластами (Cowan et al, 2005). Сохранение стабильного кариотипа при длительном культивировании ЭСК и их плюрипотентный потенциал делает модель гибридных клеток, полученных при участии ЭСК и соматических клеток, привлекательной для изучения репрограммирования и свойств полученных гибридных клеток. Причины доминирования свойств ЭСК на данный момент не выяснены, поэтому крайне важно установить факторы, влияющие на
доминирование плюрипотентности в гибридных клетках. Однако при этом следует особо отметить, что для изучения возможных молекулярных механизмов поддержания плюрипотентности в гибридном геноме и репрограммирования генома соматического партнера, необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток, поскольку данные о хромосомном составе гибридных клеток носят противоречивый характер. Согласно данным одних авторов (Tada et al, 2001; 2003; Terada et al, 2002; Ying et al, 2002), гибридные клетки мыши типа ЭСК-дифференцированные клетки сохраняют тетраплоидный набор хромосом, появившийся в результате слияния двух диплоидных клеток, то есть признаки сегрегации хромосом отсутствуют. По данным других авторов, полученным при цитогенетическом анализе гибридных клеток типа ЭСК-спленоциты, имеет место отчетливая преимущественная элиминация хромосом спленоцитов (Matveeva et al, 1998; Матвеева и др., 2001; Серов и др., 2003; Пристяжнюк и др., 2005). В связи с этим актуальность полноценного анализа хромосомного состава гибридных клеток, который позволит избежать ошибок в интерпретации масштабов репрограммирования, трудно переоценить.
Одним из наиболее адекватных способов оценки потенциала плюрипотентных клеток является получение химерных животных при введении клеток в полость бластоцисты. Исследование химерных животных, полученных введением тетраплоидных гибридных клеток в реципиентные бластоцисты, показало лишь незначительный вклад гибридных клеток в органы и ткани химерного животного (Tada et al, 2001). Имеются сообщения о рождении двух химерных животных, полученных при введении около-тетраплоидных плюрипотентных клеток, однако необходимо отметить, что в данных работах нет доказательств получения химерных животных именно из таких клеток, так же как и доказательств сохранения исходного кариотипа клеток при развитии химерного животного (Ying et al, 2002; Pells et al, 2002). Таким образом, в данной работе впервые будет проведен анализ хромосомного состава потомков около-тетраплоидных гибридных клеток, давших вклад в органы и ткани химерного животного, что позволит однозначно ответить на вопрос, связан ли плюрипотентный потенциал вводимых гибридных клеток с репрограммированием дифференцированных хромосом или с их утерей.
Цели и задачи исследования. При выполнении работы преследовалась следующая цель: исследовать влияние плоидности соматического партнера на морфологию и свойства гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток мыши с ди- и тетраплоидными фибробластами.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Получить гибридные клетки между ЭСК Mus musculus линии 129/Ola и диплоидными фибробластами Mus musculus линии DD/c;
Получить гибридные клетки между ЭСК М. musculus линии 129/Ola и тетраплоидными фибробластами М. musculus линии DD/c;
Сравнить уровень экспрессии генов Oct4 и Nanog (экспрессия которых типична для ЭСК), коллагена 1-го типа и фибронектина (экспрессия которых типична для фибробластов) в полученных клонах гибридных клеток методом ПЦР в реальном времени;
Провести анализ хромосомного состава гибридных клеток типа ЭСК-диплоидные фибробласты и ЭСК-тетраплоидные фибробласты цитогенетическими методами, а также используя микросателлитные маркеры для идентификации родительских хромосом;
Исследовать хромосомный состав потомков гибридных клеток (полученных слиянием ЭСК и диплоидных фибробластов) с около-тетраплоидным набором хромосом, давших вклад в органы и ткани химерных животных.
Научная новизна и практическая значимость.
Впервые показано доминирование фенотипа соматического партнера в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭСК и тетрагаюидных фибробластов.
Впервые показано сохранение исходного кариотипа у потомков гибридных клеток с около-тетраплоидным набором хромосом в химерных животных при in vivo оценке их плюрипотентных свойств.
Апробация работы и публикации.
Результаты работы были представлены на II конгрессе общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), IV International Meeting Stem Cell Network North Rhine-Westphalia (Дюссельдорф, 2007), 3rd International Conference Basic Science for Medicine (Новосибирск, 2007), LXXIII Cold Spring Harbor Symosium on Quantitative Biology (Колд Спринг Харбор, 2008).
Материалы диссертации изложены в трех статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов, списка литературы и 3-х приложений. Работа изложена на 102-х страницах, иллюстрирована 12-ю рисунками и содержит 8 таблиц
/
Гибридные клетки как модель изучения взаимодействия объединенных геномов
Особое внимание следует уделить тому, что для получения гибридных соматических клеток использовали не только разные по происхождению, но и разные по плоидности клетки. Необходимо отметить, что такие работы были проведены с участием клеточных линий перевиваемых культур, у которых, как правило, кариотип гетероплоидный, то есть число хромосом выше нормального диплоидного набора, характерного для данного вида животных. Именно в таких культурах иногда возникают клетки с удвоенным числом хромосом. Для обозначения разной плоидности родительских линий клеток чаще используют термины: S (IS) - для обозначения кариотипа, напоминающего диплоидный, и 2S - его удвоенная версия.
Сравнение гибридных клеток, полученных при слиянии соматических клеток разной плоидности, показало, что чаще всего такие гибридные клетки обладают сильно различающимися свойствами. Например, при слиянии L-клеток с клетками меланомы с кариотипом IS наблюдается подавление синтеза меланина в гибридных клетках. Однако, когда в качестве партнера по слиянию с L-клетками использовали клетки меланомы 2S, синтез меланина сохранялся (Fougere et al, 1972). Сходные результаты были получены при слиянии эритроидных клеток мыши разной плоидности с различными соматическими партнерами. В гибридных клетках между эритроидными клетками 2S мыши и диплоидными фибробластами человека наблюдалась экспрессия а- и В-цепей гемоглобина человека (Willing et al., 1979). При слиянии эритроидных клеток IS мыши с любыми другими неэритроидными клетками такой активации не происходило. Интересно, что в гибридных клетках, полученных слиянием крысиной гепатомы IS и 2S с клетками лимфобластической лейкемии мыши, уровень синтеза альбумина крысы не менялся даже при сегрегации 15-45% хромосом крысы (Malawista, Weiss, 1974). Авторы сделали вывод о том, что сегрегация хромосом 2S партнера не влияет на степень экспрессии его ткане-специфических генов в гибридных клетках. В настоящее время исследователи располагают несколькими типами стволовых клеток эмбрионального происхождения, обладающими высокими проспективными потенциями. Ниже мы рассмотрим характеристики этих типов клеток, коснемся кратко истории применения таких клеток в экспериментах по слиянию с соматическими дифференцированными клетками.
Клетки эмбриональной карциномы (ЭКК). Впервые плюрипотентные стволовые клетки были выделены из тератокарциномы мыши. Такие клетки, способные к длительному культивированию in vitro, были названы клетками эмбриональной карциномы (Pierce et al., 1967). Позднее были получены культуры ЭКК из тератокарцином, развившихся в местах эктопической трансплантации бластоцист, например, под капсулу семенника или почки. Особый класс тератокарцином представляют спонтанно развивающиеся опухоли из первичных половых клеток у мышей у мышей линии LL (Solter et al., 1970; Stevens, 1970).
ЭКК обладают достаточно высокими потенциями, способны дифференцироваться in vitro или in vivo и давать начало многим типам специализированных клеток. Вызвать дифференцировку ЭКК можно добавлением в культуру индуцирующих агентов, таких как ретиноевая кислота и диметилсульфоксид (Edwards et al., 1983; Dinsmore et al, 1996). При инъецировании ЭКК под кожу иммунодефицитным мышам наблюдается образование опухолей, содержащих дериваты 3-х зародышевых листков. Имеется сообщение о получении химер в экспериментах по микроинъекциям ЭКК в бластоцисту (Stewart, 1982). Такие факты вызывают сомнение, поскольку почти все линии ЭКК анеушюидны и, как правило, несут хромосомные перестройки, что может препятствовать образованию химер (Martin, 1980). Предполагается, что именно кариотипические нарушения в ЭКК являются причиной отсутствия вклада таких клеток в зародышый путь у химер (Illmensee et al., 1976).
Культуры эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) были впервые получены в 1981 году из внутренней клеточной массы (ВКМ) бластоцисты мыши (Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981). Эта стадия эмбрионального развития является оптимальной для получения культур ЭСК, поскольку именно на этой стадии происходит важнейший акт эмбриональной дифференцировки - образование ВКМ, из которой в дальнейшем происходит развитие эмбриона (Wells et al., 1991). ЭСК сохраняют нормальный кариотип даже после продолжительного культивирования, и при этом в них поддерживается высокий уровень плюрипотентности. Наиболее адекватным способом оценки потенциала ЭСК является тест по получению химерных животных путем инъекций ЭСК в полость бластоцисты. Анализ химерных животных показал, что вклад тестируемых ЭСК обнаружен во всех органах и тканях, включая, что особенно важно, зародышевый путь (Beddington et al., 1989; Wobus, 2001).
Эмбриональные предшественники половых клеток (ЭПК) мыши также могут служить источником линий высокоплюрипотентных клеток (Matsui et al., 1992; Resnick et al, 1992). При инъецировании ЭПК в полость бластоцисты развиваются химеры с высоким вкладом во все ткани химерного животного, включая зародышевый путь (Labosky et al, 1994). Однако такие химерные животные имели нарушения в развитии, например, увеличение размеров плода и неправильное развитие скелета. Возможно, это связано с нарушениями экспрессии импринтированных генов (Tada et al., 1998).
Для всех трех типов клеток характерны некоторые особенности при культивировании их in vitro: образование клеточных островков на фидерном слое (Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981), высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение (Abbondanzo et al., 1993). Помимо общих морфологических свойств для ЭСК характерен набор определенных маркеров: высокая активность щелочной фосфатазы (Resnick et al., 1992), экспрессия высококонсервативного поверхностного антигена - эмбриогликана SSEA-1 (Solter et al., 1978) и транскрипционного фактора Oct4 (Scholer et al., 1989). Основной характеристикой клеточного цикла стволовых клеток является укороченная фаза Gi и короткий клеточный цикл в целом (Rohwedel et al., 1996). Кроме этого, для таких клеток характерен высокий уровень теломеразной активности (Thompson et al., 1998).
В последнее время большой резонанс вызвали работы по получению плюрипотентных клеток из соматических клеток путем их прямого репрограммирования с помощью определенного набора генов. Ретровирусной трансфекцией в мышиные эмбриональные фибробласты и фибробласты, полученные из взрослых животных, вводили четыре гена: Oct4, Sox-2, с-Мус и Klf-4 (Takahashi, Yamanaka, 2006). Полученные колонии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток имели все свойства ЭСК, в частности, такие клетки формировали тератомы и давали вклад во многие органы химерных животных, включая зародышевый путь (Maherali et al, 2007; Okita et al., 2007; Wernig et al., 2007). Аналогичные результаты получены на фибробластах человека с использованием того же набора генов ОСТ4, SOX2, с-Мус и Klf-4 (Takahashi et al., 2007), а так же с ОСТ4, SOX2, NANOG и LIN28 (Yu et al, 2007).
Получение культур первичных эмбриональных фибробластов
Для получения эмбриональных фибробластов использовали 12.5-дневных эмбрионов мышей линии DD/c М. mils cuius и 11-12-дневных химерных эмбрионов. Эмбрионы извлекали из матки и стерильно переносили в среду DMEM (Sigma, Германия), содержащую 1 мг/мл смеси антибиотиков (1:1) пенициллина (Sigma, Германия) и стрептомицина (Sigma, Германия). После двухминутной инкубации, эмбрионы переносили в чашку Петри в каплю раствора трипсина (0.25%). После удаления головы и печени ткани эмбриона тщательно измельчали и переносили в пробирку, содержащую 3 мл трипсина. После инкубации в трипсине при температуре 37С в течение 40 мин. трипсин инактивировали добавлением 8 мл среды DMEM. После центрифугирования при 160g супернатант сливали, к клеточному осадку добавляли свежую порцию 10 мл среды DMEM, клеточный осадок тщательно пипетировали. После центрифугирования при 160g к клеточному осадку добавляли среду DMEM для культивирования фибробластов. Клеточный осадок ресуспсндировали и переносили для выращивания в культуральные матрасы, площадью 25 см или 56 см (Corning, Германия). Объем ростовой среды доводили до 5 или 18 мл соответственно. Смену среды проводили на следующий день
Линия тетраплоидных фибробластов была получена из спонтанно возникших в культуре диплоидных эмбриональных фибробластов мыши линии DD/c тетраплоидных клеток. Первичная культура эмбриональных фибробластов размножается ограниченное время, но в некоторых случаях клетки первичных культур способны к неограниченной пролиферации, что нередко сопровождается тетраплоидизацией. По результатам цитогенетического анализа, проведенного на 33 пассаже культивирования, в культуре диплоидных фибробластов (tDD) спонтанно возникла популяция (около 10% от всех клеток) (рис. 1) фибробластов с около-тетраплоидным набором хромосом (Приложение 1, А). Для получения сублиний с максимально близким к тетраплоидному набору хромосом, гетерогенная культура фибробластов была субклонирована. Суспензию фибробластов, полученную после их дезагрегации с помощью трипсина, помещали в полную ростовую среду для культивирования фибробластов.
Индивидуальные клетки из полученной суспензии с помощью стеклянного капилляра переносили в лунки 96-ти ячеечного культурального планшета, куда предварительно было добавлено по 150 мкл полной ростовой среды для фибробластов. Всего было индивидуально рассажено 30 клеток исходной популяции фибробластов. Среду в лунках меняли через 3 дня. На 21 день обнаружено три активно растущих колонии фибробластов (В6, D8 и Е9). Каждая колония культивировалась индивидуально по стандартному протоколу культивирования фибробластов. По результатам цитогенетического анализа, для получения гибридных клеток была выбрана линия В6 с максимальным количеством тетраплоидных клеток (рис. 2, Приложение 1, Б-Г).
Для получения культуры "взрослых" фибробластов у взрослой 3-х месячной самки мыши линии DD/c М. muscuius извлекали легкие, а у химерных животных участки кожи из пятен с желтым окрасом шерсти. Легкие переносили в среду DMEM (Sigma, Германия), содержащей 1 мг/мл смеси антибиотиков (1:1) пенициллина (Sigma, Германия) и стрептомицина (Sigma, Германия). После двухминутной инкубации, легкие переносили в чашку Петри в каплю раствора 0.25% трипсина в ЭДТА и тщательно ресуспендировали. Далее последовательность действий для получения клеточной культуры из легкого совпадает с описанной выше процедурой получения культуры клеток из эмбрионов. Клеточную суспензию переносили в культуральные матрасы площадью 25 см , объем ростовой среды для культивирования фибробластов доводили до 5 мл.
Мы также использовали другой подход для получения культуры фибробластов из взрослых химерных мышей. С этой целью брали фрагменты кожи с желтым окрасом шерсти химерного животного и помещали в чашки Петри диаметром 6 см, добавляя минимальное (1.5 мл) количество ростовой среды для культивирования фибробластов. В течение четырех дней фрагмент кожи оставляли в минимальном объеме среды, что способствовало его прикреплению к поверхности чашки Петри. Через четыре дня аккуратно, не сбивая фрагмент кожи с поверхности культуральной посуды, добавляли полный объем ростовой среды - до 4 мл. На 14-16 день вокруг кусочка кожи вырастали колонии фибробластов, которые использовали в анализе хромосомного состава.
Хромосомный состав клонов типа ЭСК-диплоидные фибробласты
Как уже упоминалось в разделе "Обзор литературы", в гибридных клетках часто наблюдается потеря хромосом (сегрегация) одного из партнеров по слиянию . Потенциально потеря хромосом одного из родителей может быть причиной преимущественного проявления в гибридной клетке свойств того родительского генома, который сохраняет полный набор хромосом. После слияния двух диплоидных клеток ожидается, что кариотип гибридной клетки будет представлять собой сумму двух родительских наборов хромосом. В случае потери родительских хромосом (сегрегации) следует ожидать отклонение от ожидаемого числа хромосом (80-ти).
Подсчет хромосом в 15-ти клонах гибридных клеток серий tef и taf показал, что в 9-ти из них клетки содержали 80 и менее хромосом, а в шести клонах (tef6, taf4, taH 5, taf 16, taf20, taf23) клетки имели около-гексаплоидный набор хромосом (Таблица 4). Среди 9-ти клонов первой категории в 5-ти клонах 42-85% клеток содержали 76 - 80 хромосом (рис. 4А, Б, В, Г), а в 4-х клонах многие клетки содержали 70 - 76 хромосом (Приложение 2).
Гибридные клетки с около-гексаплоидным набором хромосом (рис. АД, Е), предположительно, возникли в результате слияния двух ЭСК с одним фибробластом или, наоборот, одной ЭСК с двумя фибробластами. Возможность слияния двух ЭСК с одним фибробластом может объясняться высокой склонностью ЭСК в суспензии образовывать ассоциации из двух и более клеток из-за своих высоких адгезивных свойств. При нанесении суспензии ЭСК на монослой фибробластов возможно слияние ассоциации из нескольких ЭСК с фибробластом. Процент клеток в клонах с количеством хромосом 110 - 120 составляет от 24% до 58%, остальные клетки имеют 106-110 хромосом.
Таким образом, большинство клеток клонов серий tef и taf содержат около-тетраплоидный или около-гексаплоидный набор хромосом, что говорит об отсутствии заметной сегрегации хромосом в клетках.
Методы цитогенетического анализа не позволяют идентифицировать родительскую принадлежность хромосом в полученных гибридных клетках, поскольку они были получены слиянием клеток, донором которых служили мыши линий DD/c и 129/01а, принадлежащих к одному виду М. musculus. В связи с этим, для дискриминации родительских хромосом в гибридных клетках использовали ПЦР-анализ длин молекулярных маркеров-микросателлитов. У мышей выделены и локализованы тысячи полиморфных микросателлитов - простые повторы последовательностей ДНК (simple sequence repeats, SSRs), маркирующие все хромосомы генома мыши. Такие микросателлиты высоко полиморфны по длине последовательности в различных лабораторных линиях мышей и могут быть надежно выявлены с помощью ПЦР.
Вывод о наличии той или иной родительской хромосомы в гибридных клетках был основан на присутствии или отсутствии микросателлита, специфического для того или иного гомолога (рис. 5).
Результаты микросателлитного анализа показали, что в гибридных клетках всех клонов серий tef и taf присутствуют микросателлиты, маркирующие все родительские хромосомы, за исключением микросателлита D14MU38 хромосомы 14 соматического партнера в клонах tef3 и taf4 (Таблица 5). Следует подчеркнуть, что клон teD имеет около-тетраплоидный набор хромосом, тогда как taf4 около-гексаплоидный (Таблица 4).
Следует отметить, что отсутствие ПЦР-продукта микросателлитного маркера может быть как результатом отсутствия всей хромосомы, так и результатом делеции хромосомы при хромосомных перестройках. При цито генетическом анализе мы не обнаружили видимых хромосомных перестроек ни в одном из полученных клонов гибридных клеток.
Для более надежной идентификации хромосомных перестроек, мы провели эксперименты по гибридизации in situ с использованием меченых дигоксигенин- или ФИТЦ зондов, специфичных для хромосом X, 4, 6 и 17 (рис. 6). Нами не обнаружено хромосомных фрагментов исследованных хромосом ни в одном исследованном клоне гибридных клеток. В целом, цитогенетический и микросателлитный анализы не выявили признаков заметной потери хромосом в большинстве клонов серий tef и taf. Этот вывод касается как клонов с около-тетраплоидным набором хромосом (tef3, tef4, tef9, ta2, taf5, taf8, taflO, taf22 и taf31), так и с около-гексаплоидным (tef6, taf4, tafl5, taf 16, taf20 и taf23).
Как отмечалось выше, гибридные клетки серий taf и tef имели выраженное морфологическое сходство с ЭСК. Это сходство проявляется также в организации f-актинового цитоскелета (рис. ЗД Е). Одной из ростовых характеристик ЭСК является рост в компактных колониях, где каждая клетка в отдельности не обладает выраженным цитоскелетом и f-актиновые нити распределены по цитоплазме, по сравнению с фибробластами, более диффузно, не организуя в клетках более плотных ориентированных тяжей. В цитоплазме фибробластов нити f-актина собраны в плотные тяжи, которые образуют "жесткий" каркас в цитоплазме клетки (рис. ЪЖ).
Высокая активность фермента щелочной фосфатазы (ЩФ) является наиболее характерной особенностью недифференцированных плюрипотентных клеток. Клетки, негативные по ЩФ, следует рассматривать как результат спонтанной дифференцировки: чем выше процент таких клеток, тем более склонна такая культура к дифференцировке. В таблице 6 приведены результаты подсчета позитивных и негативных по активности ЩФ колоний, в которых присутствовали как позитивные, так и негативные клетки. Четыре клона серии tef имели разную степень склонности к дифференцировке: три клона (tef3, tef6, tef9) более склонны к дифференцировке, о чем свидетельствуют невысокий процент клеток с высокой активностью ЩФ колоний (от 10% до 52%), тогда как доля позитивных по ЩФ в клоне tef4 составила 83% (Таблица 6). Все клоны гибридных клеток типа ЭСК-"взрослые" фибробласты имели низкую склонность к спонтанной дифференцировке, что соотносится с более высоким содержанием в культурах колоний, позитивных по активности фермента ЩФ. Доля таких колоний составила от 61% до 89% (Таблица 6).
Хромосомный состав клонов типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты
При слиянии диплоидных ЭСК (40 хромосом) с тетраплоидными фибробластами (80 хромосом), ожидаемое количество хромосом в гибридной клетке- 120. Подсчет числа хромосом показал присутствие от 105 до 120 хромосом во всех клонах гибридных клеток, причем доля таких клеток в большинстве гибридных клонах составила от 72% до 94%, за исключением клона tef22 (42%) (Таблица 8; Приложение 2, рис. 11). В трех клонах (tefl, tef7, tefl8) обнаружена достаточно высокая доля клеток со 120 хромосомами (30%, 16% и 20% соответственно), тогда как в двух других клонах (tef4 и tef8) доля таких клеток составила всего 4% , а в 6 клонах не обнаружено ни одной клетки со 120 хромосомами. Цитогенетический анализ не выявил видимых хромосомных перестроек ни в одном из полученных клонов (Приложение 3).Во всех клонах гибридных клеток, полученных при слиянии ЭСК и тетраплоидных фибробластов, обнаружена экспрессия коллагена и фибронектина (рис. 12). В большинстве клонов этого типа уровень экспрессии и фибронектина, и коллагена сопоставим или выше по сравнению с исходной линией тетраплоидных фибробластов. Исключение составили 4 клона из 11: tef22 и tef27, в которых уровень экспрессии фибронектина был незначительно ниже по сравнению с исходными тетраплоидными фибробластами, а также клоны tef22 tef4 со сниженной экспрессией коллагена 1-го типа (рис. 12). Активная экспрессия маркеров, типичных для фибробластов, наблюдалась на фоне полного отсутствия экспрессии во всех гибридных клетках генов-маркеров плюрипотентности, Oct4 и Nanog.
Таким образом, гибридные клетки типа ЭСК-диплоидные фибробласты не только имеют морфологию, типичную для ЭСК, но обладают и другими свойствами,
Таким образом, гибридные клетки типа ЭСК-диплоидные фибробласты не только имеют морфологию, типичную для ЭСК, но обладают и другими свойствами, типичными для плюрипотентных клеток: высоким уровнем активности ЩФ и экспрессией транскрипционных факторов Oct4 и Nanog. Гибридные клетки типа ЭСК-тетраплоидные фибробласты имеют морфологию и свойства, типичные для линии родительских фибробластов, и экспрессируют гены-маркеры фибробластов — коллаген 1-го типа и фибронектин. Уровни экспрессии генов-маркеров в большинстве клонов гибридных клеток сопоставимы или выше уровня экспрессии в родительских клетках.
Впервые показано, что гибридные клетки, полученные при слиянии ЭСК с фибробластами разной плоидности, проявляют альтернативные фенотипы: либо ЭСК, либо фибробласта. Кроме схожих морфологических характеристик, такие гибридные клетки имеют свойства, типичные для плюрипотентных клеток или фибробластов: активность щелочной фосфатазы, экспрессия генов-маркеров плюрипотентностии и генов-маркеров фибробластов. По результатам хромосомного анализа, во всех проанализированных клонах наблюдалась незначительная сегрегация хромосом. Таким образом, клоны гибридных клеток обладают свойствами, типичными для исходной линии тетраплоидных фибробластов или ЭСК на фоне присутствия всех хромосом плюрипотентного или соматического партнеров.
Высокий потенциал плюрипотентности ЭСК эффективно применяется для репрограммирования геномов соматических клеток, используя технологию клеточной гибридизации. Действительно показано, что гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК с дифференцированными клетками, имеют уровень плюрипотентности, сопоставимый с ЭСК (Матвеева и др., 1996; Tada et al., 1998; Matveeva et al., 2005; Vasilkova et al., 2007). Гибридные клетки обладают фенотипом и свойствами плюрипотентного партнера в независимости от того, диплоидные клетки какого типа использовали в слиянии с ЭСК: спленоциты, фибробласты или тимоциты.
В данной работе в качестве диплоидного соматического партнера по слиянию с ЭСК использовали культуры первичных фибробластов, полученных из эмбрионов и взрослых животных. Полученные при слиянии ЭСК и диплоидных фибробластов гибридные клетки имели морфологию ЭСК и проявляли свойства, типичные для этих клеток. Несмотря на использование в качестве партнера для слияния с ЭСК фибробластов из разных источников, значительных различий в свойствах клонов серий tef и taf обнаружено не было. Подсчет числа хромосом показал, что среди полученных клонов гибридных клеток обеих серий активной сегрегации хромосом не происходило. Однако при анализе хромосомного состава было выяснено, что, кроме клонов, клетки которых содержат около 80 хромосом, есть группа клонов, клетки которых содержат 110-120 хромосом. Такие клетки могли возникнуть при слиянии не двух, а трех клеток. Цитогенетический анализ внутривидовых гибридных клеток не позволяет определить, гомологи какого партнера по слиянию частично сегрегировали. Использование хромосомо-специфичных зондов поможет выявить лишь общее количество хромосом и их целостность, но не позволит определить их принадлежность из-за значительного сходства нуклеотидных последовательностей двух линий. Наиболее быстрым, удобным и адекватным способом, который следует применить для идентификации родительских аллелей в комплексе с цитогенетическим методом, является анализ длин полиморфных микросателлитов.
