Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Проблема восстановления потенциала дифференцированной клетки 11
1.2. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью переноса соматических ядер 12
1.3. Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью их слияния с эмбриональными стволовыми клетками 16
1.3.1. Классификация клеток обладающих высоким потенциалом 16
1.3.2. Получение, поддержание и дифференцировка ЭСК 18
1.3.3. Применение ЭСК для изучения генетической регуляции развития и направленного мутагенеза 21
1.3.4. Клеточные гибриды между ЭСК и соматическими клетками 23
1.4. Методы оценки плюрипотентности ЭСК и гибридных клеток 29
1.4.1. Гисто- и иммуногистохимические маркеры 29
1.4.2. Анализ экспрессии генов-маркеров плюрипотентности 32
1.4.3. Оценка плюрипотентности клеток в тестах in vivo - получение химерных животных 35
ГЛАВА 2. Материалы и методы 39
2.1. Клетки и клеточные линии 39
2.2. Культивирование клеток в монослое 39
2.3. Замораживание клеток 40
2.4. Размораживание клеток 40
2.5. Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы 40
2.6. Оценка активности щелочной фосфатазы 41
2.7. Иммуногистохимическое выявление экспрессии ЕСМА7 41
2.8. Получение химерных животных 42
2.9. Получение эмбриоидных телец in vitro 42
2.10. Биохимическое выявление глюкозофосфатизомеразы (ГФИ) 42
2.11. Выделение ДНК 43
2.12. Выделение РНК 44
2.13. Синтез кДНК 44
2.14. ПЦР-анализ 45
2.15. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле 45
2.16. Рестрикционный анализ 46
ГЛАВА 3. Результаты 47
3.1. Гистохимический анализ активности щелочной фосфатазы в гибридных клетках серии НМС 47
3.2. Иммуногистохимический анализ эмбрионального антигена ЕСМА7 в гибридных клетках 50
3.3. Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на химеризм 50
3.4. Анализ экспрессии генов Oct4 и Nanog в гибридных клетках 57
3.5. Сравнение экспрессии родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках 59
3.6. Инактивация Х-хромосомы при индуцированной in vitro дифференцировке гибридных клеток 62
ГЛАВА 4. Обсуждение 67
Выводы 79
Список литературы
- Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью их слияния с эмбриональными стволовыми клетками
- Применение ЭСК для изучения генетической регуляции развития и направленного мутагенеза
- Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы
- Иммуногистохимический анализ эмбрионального антигена ЕСМА7 в гибридных клетках
Введение к работе
Актуальность. Одной из фундаментальных проблем генетики развития является изучение плюрипотентности - способности клеток к дифференцировке в различные клеточные типы in vitro и in vivo, которая характерна для клеток эмбриона на ранних стадиях развития и эмбриональным стволовым клеткам (ЭСК). То, какими механизмами осуществляется контроль над сохранением и утратой этого свойства в процессе дифференцировки клеток, к настоящему времени остается во многом неясным. С этим вопросом связана также не менее важная проблема, касающаяся эпигенетических изменений генома, происходящих при дифференцировке клеток, и возможности репрограммирования генома дифференцированных клеток взрослых животных. Долгое время считалось, что эмбриональные клетки очень рано теряют плюрипотентность, однако было показано, что пересадка ядер дифференцированных клеток, взятых у взрослого животного, в энуклеированные ооциты не препятствует нормальному развитию организма (Di Berardino, 1997; Wilmut et al., 1997; Wakayama et al, 1998). Таким образом, было установлено, что ядра дифференцированных клеток способны репрограммироваться и даже обеспечить полное развитие организма. Этот метод в последнее время широко применяется в клонировании млекопитающих и является очень эффективным способом репрограммирования ядер дифференцированных клеток. Однако существует альтернативный, не менее эффективный, экспериментальный подход к репрограммированию генома дифференцированных клеток, основанный на использовании высокого потенциала эмбриональных стволовых клеток, при их слиянии с дифференцированными клетками (Matveeva et al., 1998;Tadaefa/.,2001).
В настоящее время ЭСК, полученные из внутренней клеточной массы бластоцисты, являются "связующим звеном" в исследованиях in vitro и in vivo. При культивировании ЭСК сохраняют плюрипотентные свойства в течение длительного времени. Однако в ЭСК может быть легко индуцирована дифференцировка in vitro с образованием производных трех зародышевых листков. Более того, ЭСК, при введении в бластоцисту, принимают участие в образовании большинства органов и тканей химерных животных, в том числе и гонад (Tarn,
7 Rossant, 2003). Культуры ЭСК широко используются для исследования ранних этапов дифференцировки, для изучения функции гена и для создания трансгенных животных.
Гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК с дифференцированными клетками, открывают новые экспериментальные возможности изучения механизмов поддержания плюрипотеитности и процессы репрограммирования. Гибридные клетки такого типа сохраняют плюрипотентные свойства на достаточно высоком уровне и, что очень важно, гены дифференцированного партнера репрограммируются в результате взаимодействия с геномом ЭСК (Matveeva et ah, 1998; Tada et ah, 2001; 2003; Terada et ah, 2002; Ying et ah, 2002; Do, Scholer, 2004). Одним из несомненных достоинств такой модельной системы является возможность создания набора гибридных клеток с разным соотношением родительских хромосом. То есть открывается возможность оценить роль индивидуальных хромосом в поддержании плюрипотеитности и исследовать способность отдельных хромосом к репрограммированию.
Для изучения плюрипотеитности клеток применяют разносторонние методы. Для гисто- и иммупогистохимического анализа плюрипотеитности используют маркеры характерные для клеток ВКМ: активность щелочной фосфатазы и поверхностные антигены. Способность участвовать в формировании органов и тканей химерного животного (Tam, Rossant, 2003), а также в формировании тератом и эмбриоидпых телец (Rastan, Robertson, 1985) является наиболее адекватным свидетельством высокого потенциала исследуемых клеток. По наличию экспрессии генов Oct4 и Nanog, генов «плюрипотеитности», можно также оценить являются ли клетки плюрипотентными.
В настоящее время практически отсутствуют разработанные методы количественной оценки плюрипотеитности, однако использование подобных методов позволило бы больше узнать о том, какое влияние оказывают хромосомы соматического партнера на сохранение плюрипотеитности у клеточных гибридов.
В лаборатории генетики развития Института цитологии и генетики были получены внутривидовые клеточные гибриды серии HESS от слияния плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток линии НМ-1 мыши линии 129/01а и спленоцитов (клеток селезенки) мыши линии DD/c. Гибридные клетки
8 сохраняли плюрипотентные свойства, характерные для ЭСК, что было доказано тестами in vitro и in vivo (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al, 1998). Таким образом, было показано, что присутствие в клеточных гибридах хромосом дифференцированной клетки не препятствует сохранению плюрипотентности.
В той же лаборатории были получены межвидовые гибриды серии НМС от слияния плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток Musmusculus и спленоцитов близкого вида мыши М. caroli. Полученные гибридные клоны сохраняли фенотип ЭСК и имели подробно описанный состав хромосом (Пристяжнюк и др., 2005). Благодаря этому появилась возможность для более полной оценки плюрипотентности и интерпретации полученных данных в соответствии с общим хромосомным составом и присутствием хромосом соматического партнера.
Цели и задачи работы.
Цель работы заключалась в оценке плюрипотентности межвидовых клеточных гибридов, полученных от слияния эмбриональных стволовых клеток мыши Mm musculus и спленоцитов М. caroli.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Оценить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток in vitro с помощью маркеров, характерных для недифференцированных клеток: активности щелочной фосфатазы и эмбрионального поверхностного антигена ЕСМА7.
Сравнить плюрипотентность клонов межвидовых гибридных клеток в экспериментах in vivo - получение химерных животных, с последующей оценкой вклада гибридных клеток в формирование тканей и органов химер.
Изучить в клонах межвидовых гибридных клеток экспрессию генов Oct4 и Nanog, ответственных за поддержание плюрипотентности.
Сравнить экспрессию родительских аллелей генов Oct4, Nanog и Gla в гибридных клетках и, тем самым, оценить способность к репрограммированию генома дифференцированных клеток взрослого животного.
9 5. Оценить активность Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное исследование плюрипотентности межвидовых гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток мышей М. musculus линии 129/01а и спленоцитов М. caroli. Для оценки плюрипотентности использовали молекулярные, гисто- и иммуногистохимические маркеры, а также тест на получение химерных животных. Показано, что уровень плюрипотентности в гибридных клетках типа ЭСК-спленоцит мало зависим или полностью независим от числа хромосом соматического партнера в гибридном кариотипе, то есть плюрипотентность проявляется у гибридных клеток как доминантный признак.
В данной работе впервые описаны химерные животные, полученные микроинъекционным способом с использованием межвидовых клеточных гибридов серии НМС. Показано сохранение хромосом соматического партнера в потомках гибридных клеток при развитии химерного организма.
З.В гибридных клетках серии НМС впервые проведен анализ активности Х-хромосом, полученных из геномов с различным эпигенетическим статусом, и показано отсутствие предпочтительной инактивации Х-хромосом при индуцированной дифференцировке гибридных клеток in vitro.
Практическая значимость. Результаты данной работы способствуют расширению знаний о процессах поддержания плюрипотентности и репрограммирования и используются при чтении курса «Генетика развития» в НГУ.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на XL международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002), на международной научной конференции молодых ученых и студентов (Алматы, 2003), на 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на международном
10 симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), на 3-м съезде ВОГиС (Москва, 2004), на международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2006), на XLIV международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2006), на международной конференции «Фундаментальные науки - биотехнологии и медицине», (Новосибирск, 2006).
Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественных и международном журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 93 страницах, содержит 16 рисунков и 8 таблиц.
Изучение репрограммирования генома соматических клеток с помощью их слияния с эмбриональными стволовыми клетками
Соматические стволовые клетки (ССК) ответственны за регенерацию поврежденных тканей и сохранение тканевого гомеостаза у взрослых животных. По происхождению ССК относят к следующим типам: кроветворные (гемопоэтические) стволовые клетки, нейральные, печеночные, а также стволовые клетки скелетной мускулатуры и кожи (Blau etal, 2001). Однако последние исследования показали, что классификация только по тканевому происхождению не совсем верна. Например, нейральные стволовые клетки мыши и человека при их введении в скелетную мышцу могут дифференцироваться в кардиомиоциты (Galli et al, 2000). Также было показано, что стволовые клетки костного мозга могут давать начало клеточным типам, которые присущи другим тканям, например скелетным мышцам, головному мозгу, сердцу и печени (Bittner et al, 1999; Brazelton et al, 2000). Микроокружение, под которым понимают специфическое положение, контакт с окружающими клетками, внеклеточный матрикс, внутреннюю среду (Studer et al, 2000), факторы роста и дифференцировки, играют ключевую роль в детерминации функций соматических стволовых клеток (Blau et al., 2001).
Клетки эмбриональной карциномы (ЭКК) выделяют из тератокарцином и поддерживают в недифференцированном состоянии в культуре (Jones-Villenneuve et al., 1982). При культивировании в суспензионной культуре они способны формировать эмбриоидные тельца, в которых можно наблюдать процесс дифференцировки (Martin, Evans, 1975; Grover et al., 1983). Ретиноивая кислота индуцирует в ЭКК дифференцировку в эндодерму, нейроны, глию и фибробласты (Strickland, Mahdavi, 1978; Jones-Villenneuve et al, 1982; Jones-Villenneuve et al, 1983), а диметилсульфоксид (ДМСО) в нетоксичных дозах способствует формированию клеток скелетной и сердечной мускулатуры (McBurney et al, 1982; Edwards et al, 1983). При введении ЭКК в полость бластоцисти они дают вклад в ткани и органы химерного животного (Rossant, McBurney, 1982), однако такие животные имеют отклонения, у них обнаружены опухоли, возникшие из введенных ЭКК.
Эмбриональные зародышевые клетки (ЭЗК) были получены из первичных половых клеток (ППК) с различных стадий развития (Matsui et al., 1992; Stewart et al, 1994). У мыши ППК выселяются из эпибласта в эмбриональную мезодерму на 7 d.p.c. Здесь они пролиферируют и, позднее, мигрируют в зачатки половых органов - генитальные валики (Lawson, Hage, 1994). Ведение ППК клеток в культуре ограничено несколькими поколениями, и они не способны давать химер. Тем не менее, при культивировании в среде, содержащей факторы, стимулирующие пролиферацию, происходит изменение свойств ППК (Resnick et al., 1992). Такие клетки становятся способными колонизировать зародышевый путь в химерных организмах и давать гаметы (Stewart et al, 1994). Было показано сходство эпигенотипов ЭЗК и ППК (Labosky et al., 1994). Это сходство настолько велико, что ЭЗК могут быть использованы для исследования механизмов эпигенетических изменений, которые происходят в ППК. Более того, ЭЗК доступны для культивирования in vitro и получения химерных животных (Tada et al, 1997).
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) получают из предимплантационных эмбрионов. Они способны размножаться как гомогенная некоммитированная популяция клеток в течение длительного времени, сохраняя плюрипотентность и нормальный кариотип (Prelle et al., 2002). Плюрипотентные эмбриональные стволовые клетки, полученные из внутренней клеточной массы бластоциста, могут дифференцироваться во все типы тканей (Robertson et al., 1986). Поскольку основу представляемой работы составляют гибридные клетки, полученные слиянием ЭСК с клетками взрослого животного, то имеет смысл остановиться подробнее на свойствах именно ЭСК.
Эмбриональные стволовые клетки мыши были получены в 1981 г. (одновременно группами Эванс и Мартин) из эмбрионов, находящихся на стадии бластоциста. Эмбрион на этой стадии имеет наружный трофобластический слой клеток, полость - бластоцель, внутреннюю клеточную массу (ВКМ, inner cell mass, ІСМ) и клетки эндодермы. Линии ЭСК происходят из клеток ВКМ (Prelle et al, 1999).
В методике, описанной Эванс [Evans, Kaufman, 1981 (цит. по Flechon, 1995)], пятидневные эмбрионы мыши помещают в культуральную среду, где они прикрепляются к субстрату-фидеру (клетки первичных фибробластов мыши). После этого эмбрионы начинают интенсивно расти и распластываются по субстрату. Клетки трофобласта увеличиваются в размерах, полиплоидизируются и спустя несколько дней дегенерируют, а клетки ВКМ продолжают интенсивно делиться. Затем проводят дезагрегацию разросшейся ВКМ на отдельные клетки, которые являются источниками линий ЭСК. При таком способе выделения линий ЭСК эффективность составляет 10-30%, в зависимости от исходной линии мышей - доноров бластоцист.
По методу Г. Мартин [Martin, 1981 (цит. по Flechon, 1995)] выделение ВКМ из эмбриона происходит иммунохирургически, а дальнейший рост в кондиционной среде, получаемой после культивирования ЭКК.
Позднее был описан еще один метод получения линий ЭСК из эпибласта (первичной эмбриональной эктодермы) эмбриона мыши (Brook, Gardner, 1997). Имплантированные бластоциста или бластоциста, полученные от самок с экспериментальной задержкой имплантации, разделили микрохирургически на составляющие их компоненты: эпибласт, эндодерма, трофэктодерма, выяснилось, что только целый эпибласт или клеточная суспензия из него обладают способностью давать начало линии ЭСК.
Применение ЭСК для изучения генетической регуляции развития и направленного мутагенеза
Метод, позволяющий осуществить слияние различных клеток животных и растений и получать гибридные клетки, широко применяется в генетике как соматических, так и стволовых клеток. В основе метода лежит спонтанное или искусственно вызванное слияние различных клеток и образование клеточного гибрида. Используя этот метод, можно получать как внутривидовые, так и межвидовые гибридные клетки (Рингерц, Сэвидж, 1979).
При гибридизации стволовых и дифференцированных клеток происходит объединение генома плюрипотентных клеток и генома дифференцированных клеток. Перспективность такого подхода обусловлена взаимодействием «плюрипотентного» и «дифференцированного» геномов в ядре гибридной клетки, что позволяет исследовать влияние отдельных хромосом соматического партнера на сохранение статуса плюрипотентности, с одной стороны, и возможность репрограммирования соматических хромосом под влиянием «плюрипотентного» генома, с другой стороны.
Из литературных данных известно о клеточных гибридах от слияния клеток эмбриональной карциномы и дифференцированных клеток (Miller, Ruddle, 1976, 1977; Andrews, Goodfellow, 1980; Rousset et al, 1980; Takagi, 1993; McBurney, 1977; McBurney et al, 1978; Rousset et al, 1979; Schaap et al, 1984). Результаты экспериментов зависели от выбранного соматического партнера. Так, гибриды от слияния ЭКК и фибробластов мыши имели фенотип фибробластов и утрачивали экспрессию эмбриональных маркеров ЭКК, несмотря на то, что все хромосомы, полученные от ЭКК, сохранялись. Результат не зависел от того, были ли исходные линии диплоидными или тетраплоидными (Rousset et al, 1979). В этих гибридных клетках экспрессировался Н-2 аллотип ЭКК, "молчащий" в исходной линии. Однако гибриды от слияния лимфоцитов (Forejt et al., 1984) или клеток тимуса (Miller, Ruddle, 1976) и ЭКК сохраняли эмбриональный фенотип и продолжали экспрессировать эмбриональные поверхностные антигены. При инъекции мышам такие гибриды формировали тератомы, состоящие из стволовых клеток и различных дифференцированных тканей. Оставалось неясным, репрограммируется ли геном соматического партнера и возвращается ли к недифференцированному состоянию. Однако на гибридах между ЭКК и тимоцитами из гетерозиготной линии мышей +/tl2 была обнаружена реактивация tl2 эмбрионального антигена, полученного от соматического партнера. В норме этот антиген экспрессируется только в раннем эмбриогенезе (Artzt et al., 1981). Реактивация плюрипотентных свойств в гибридах между ЭКК и тимоцитами была показана и в другой работе (Rousset et al., 1983). В отличие от исходной ЭКК линии с ограниченным потенциалом, формирующей простые опухоли из однородных клеток, гибридные клетки образовывали хорошо дифференцированные опухоли. Полученные результаты свидетельствуют о возможности репрограммирования у млекопитающих.
При гибридизации лимфоцитов и эмбриональных зародышевых клеток, полученных из ППК мыши (Tada et al., 1997), образовывались клеточные гибриды, которые обладали плюрипотентными свойствами, что было доказано получением химерных эмбрионов. По крайней мере, на ранних пассажах эти гибриды имели, полный тетраплоидный набор хромосом и четыре синхронно реплицирующихся, активные Х-хромосомы. Показано, что в таких гибридных клетках происходит деметилирование обширного числа локусов. При этом происходила реактивация материнского аллеля гена Pegl/Mest, который подвергался импринтингу в лимфоцитах. Последнее обстоятельство указывает на то, что геном лимфоцита подвергся репрограммированию. Авторы рассматривают несколько причин для объяснения наблюдаемых фенотипических и биохимических изменений в гибридных клетках. Во-первых, возможна репрессия лимфоцит-специфичной генной активности факторами, содержащимися в эмбриональных стволовых клетках. Во-вторых, специфические свойства лимфоцита могли утратиться после слияния с эмбриональными стволовыми клетками в результате эпигенетических изменений генома лимфоцита. Было предположено, что оба этих события произошли последовательно после слияния клеток.
Немаловажную роль в процессе исследования плюрипотентности играют соматические стволовые клетки. По литературным данным, эти клетки имеют способность к трансдифференцировке, т.е. к изменению направления дифференцировки клеток-предшественников, предетерминированных к дифференцировке в пределах одной тканевой специфичности (Shen et al, 2000). Например, нейральные стволовые клетки мыши и человека при попадании их в скелетную мышцу способны дифференцироваться в кардиомиоциты, а стволовые клетки костного мозга способны переключаться на дифференцировку по типу скелетных мышц, головного мозга, сердца и печени (Bittner et al, 1999; Galli et al, 2000; Brazelton et al, 2000). В принципе, если клетки различных органов способны мигрировать и проникать в другие ткани, то, по мнению ряда исследователей (Blau et al, 2001), они способны к изменению своей морфологии и функции, в соответствии с их новым микроокружением, следовательно, эти изменения в клеточной судьбе не всегда ограничены тканевой нишей. Иными словами, может быть множество источников стволовых клеток и путей, посредством которых организм производит специфические типы дифференцированных клеток.
В последнее время появился ряд работ о спонтанных слияниях между клетками in vivo и in vitro. Например, клетки костного мозга мыши спонтанно сливаются in vitro с ЭСК и впоследствии принимают фенотип реципиентных клеток. Клоны, полученные от такого слияния, в большинстве случаев показывают околотетраплоидный (78-79) набор хромосом (Terada et al, 2002). Показано, что незрелые клетки головного мозга эмбрионов мыши способны сливаться с ЭСК при их сокультивировании.
Гистохимическое выявление щелочной фосфатазы
ЭСК культивировали в термостате (ShellLab, США), в атмосфере, содержащей 5% СС на ростовой среде (на 100 мл: 80 мл среды MEM-Glasgow, 15 мл эмбриональной сыворотки (КРС), 1 мл ЮОх раствора аминокислот, 1 мл глутамина, 200 мМ, 0,1 мл Р-меркаптоэтанола, 0,1 М, 10 мкл LIF (Leukemia Inhibitor Factor) (10000000 ед/мл), 0,1 мл пенициллина (100 мкг/мл)). Для лучшей адгезии клеток культуральную посуду предварительно обрабатывали 0,1% раствором желатина. Гибридные клетки культивировали в селективных условиях, используя среду ГАТ (среда содержит 100 мМ гипоксаптина, 15 мМ тимидина, 0,7 мМ аминоптерина) для «удержания» соматической Х-хромосомы, несущей аллель дикого типа гена ГФРТ.
Каждые 2-3 дня культуры ЭСК пересевали. Для этого среду удаляли, клетки промывали раствором BPBS (рН 7.2), добавляли 0,3 мл трипсин-EDTA (0,025% трипсина, 0,037% EDTA-Na2, рН 7,3) и выдерживали при 37С в течение 2-3 мин. Затем добавляли 0,5 мл промывочной среды (на 100 мл: 90 мл среды MEM-Glasgow, 10 мл эмбриональной сыворотки, 0,1 мл пенициллина), осторожно пипетировали до получения однородной клеточной суспензии, переносили в пробирки с 2 мл промывочной среды и центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин на центрифуге Janetzki К23. Супернатант сливали, клеточный осадок ресуспендировали в ростовой среде и рассаживали в культуральные планшеты в отношении 1:2.
Для гистохимического выявления щелочной фосфатазы клетки клонов высевали на чашки Петри (диаметром 3 см) и культивировали в течение трех дней. Для иммуногистохимического выявления экспрессии ЕСМА7 клетки выращивали на покровных стеклах (12x12 мм) в чашках Петри (диаметром 6 см) в течение двух дней.
Культуру клеток трипсинизировали и суспендировали стандартным способом. Клеточную суспензию переносили в пробирку с 2 мл промывочной среды; центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин на центрифуге Janetzki К23. Супернатант сливали и ресуспендировали осадок, добавляли 0,8 мл промывочной среды, 1 мл эмбриональной сыворотки (50%), 0,2 мл (10%) DMSO (диметилсульфоксид, Sigma), осторожно перемешивали. Суспензию клеток переносили в криопробирку и охлаждали до -70С в течение 12-72 часов, затем помещали в жидкий азот на длительное хранение.
Криопробирку с замороженной суспензией клеток прогревали в стакане с теплой водой (37С) в течение нескольких минут до оттаивания. Суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку с 8 мл промывочной среды, центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин на центрифуге Janetzki К23. Супернатант сливали, клеточный осадок мягко ресуспендировали в 1 мл полной ростовой среды. Суспензию переносили в лунки культурального плато, обработанного 0,1% желатина с полной ростовой средой для культивирования.
Окраска включала следующие стадии: 1. Удаление ростовой среды и отмывка клеток буфером DPBS (рН 7.6-7.8), 2 раза по 3 мин. і.. .. 2. Фиксация клеток 4% формальдегидом на DPBS (рН 7.6-7.8), 4 С, 15 мин. 3. Отмывка клеток от фиксатора буфером DPBS (рН 7.6-7.8), 3 раза по 5 мин. 4. Инкубация клеток в красящем растворе (TrisHCl рН 9.5 ЮОтМ, NaCl ЮОтМ, MgCl2 5тМ, Naphtol AS-MX Phosphate (Sigma) 0.4 mg/ml, Fast Violet В Salt (Sigma) 1 mg/ml), 37C, в течение 15 мин (визуальный контроль). 5. Отмывка клеток от красящего раствора буфером DPBS (рН 7.6-7.8), 3 раза по 5 мин. 6. Промывка препарата дистиллированной водой, 0.5 мин. 7. Высушивание.
На окрашенных препаратах с пяти полей подсчитывалось число колоний клеток различного типа, общая выборка составляла 500-700 колоний. Затем подсчитывалась доля колоний каждого типа: АР+ (состоящие только из окрашенных клеток), АР- (состоящие только из неокрашенных клеток) и АРсм (состоящие как из окрашенных, так и неокрашенных клеток в разных пропорциях). Окраска включала следующие стадии: 1. Промывка DPBS, 2 раза по 5 мин. 2. Фиксация в формальдегиде (4%), 4С, 20 мин. 3. Промывка DPBS, 2 раза по 5 мин. 4. Инкубация в овальбумине (1%), 20 мин. 5. Промывка DPBS, 2 раза по 5 мин. 6. Инкубация с первыми AT (ЕСМА7, предоставленные доктором Кемлером), 37С, 1 ч. 7. Промывка DPBS, 3 раза по 10 мин. 8. Инкубация со вторыми AT (FITC) (Sigma), 37С, 1 ч. 9. Промывка DPBS, 3 раза по 10 мин. 10. Промывка дистиллированной водой. 11. Приготовление препаратов.
Для получения химерных животных, 10-20 ЭСК (либо гибридных клеток) инъецировали в реципиентные бластоцисты мышей линии C57B1/J6. Работа осуществлялась на микроскопе Olympus с использованием микроманипулятора фирмы Narishigi (Япония). Инъецированные бластоцисты трансплантировали реципиентным псевдобеременным самкам Fl (C57B1/J6 х CBA-Lac).
Иммуногистохимический анализ эмбрионального антигена ЕСМА7 в гибридных клетках
Наличие поверхностных антигенов ЕСМА7 и семейства SSEA является критерием, свойственным недифференцированным клеткам эмбрионов ранних стадий развития. При анализе межвидовых клеточных гибридных клонов серии НМС мы использовали поверхностный антиген ЕСМА7, присутствие которого свойственно клеткам ВКМ (Banbault, Kcmlcr, 1989). Были исследованы 6 клопов (НМС1, НМС6, НМС15, НМС21, НМС47 и НМС54). Все исследованные клоны были позитивны по присутствию ЕСМА7 (рис. 3).
Оценка плюрипотентности гибридных клеток в тесте на химеризм
Наиболее информативным тестом на плюрипотентность клеток является оценка их способности формировать химерных животных. При использовании этого метода донорские клетки, смешиваясь с клетками реципиентной ВКМ, способны участвовать в развитии организма. Важной характеристикой этого метода является возможность анализировать вклад тестируемых клеток в тот или иной орган или ткань. С помощью этого теста были исследованы плюрипотентные свойства двух межвидовых гибридных клонов (НМС 15 и
HMC29) и двух субклонов (НМС15-1 и НМС15-4). По данным цитогенетического анализа гибридные клоны НМС15 и НМС29 существенно отличаются по хромосомному составу (Пристяжнюк и др., 2005; Matveeva el at., 2005). НМС15 имеет околотетраплоидный набор хромосом, причем содержит всего 3 хромосомы соматического партнера по слиянию. Субклоны НМС15-1 и НМС15-4, так же как и исходный клон НМС15, имели околотетраплоидный набор хромосом и содержали 2 или 1 хромосомы М, caroli, соответственно (к.б.н. С.А. Темирова, личное сообщение). Присутствие Х-хромосомы и аутосом 15 и 18 было выявлено в этих клонах с помощью ПЦР анализа микросателлитов (к.б.н. А.Г. Мензоров, личное сообщение), дискриминирующих родительские гомологи этих хромосом в гибридных клетках. Клон НМС29 имеет околодиплоидный набор хромосом, причем 13 пар хромосом были представлены обоими родительскими гомологами в соотношении, близком к 1:1 (Пристяжнюк и др., 2005).
Все исследованные клеточные гибриды были взяты в эксперимент примерно на 20 пассаже. Результаты теста представлены в таблицах 4 и 5. В экспериментах по инъекции клеток клона НСМ15 было получено 25 живых потомков, из которых два были химерные самки (рис. 4), то есть доля химерных животных составила 8%. По окраске шерсти вклад потомков гибридного клона оценивался как 30% и 50%. В эксперименте по инъекции клеток клона НСМ29 в 53 бластоцисты наблюдали рождение 19 животных, среди которых было выявлено одно химерное (табл. 4). Доля химерных животных составила 5,3%, а вклад по окраске шерсти оценивался как 5%. В экспериментах с клетками субклонов НМС15-1 и НМС15-4 было получено по 42 живых потомков, из них 5 (11,9%) химерных от НМС15-1 (две самки и три самца) и 7 (16,7%) - от НМС15-4 (самка и шесть самцов). Вклад потомков субклона НМС15-1 по окраске шерсти составлял 5%, тогда как у субклона НМС15-4 этот показатель варьировал в интервале от 5% до 30% (табл. 5). Для анализа вклада гибридных клеток в зародышевый путь были проведены скрещивания химерных животных с C57B1/J6. В результате этих скрещиваний от каждого химерного животного было получено 4-5 полноценных потомств, однако не было получено ни одного потомка с фенотипом 129/01а и с фенотипом агути (А.Н. Голубица, А.И. Железова, личное сообщение).
От родительской линии ЭСК НМ-1, взятой в качестве контроля, было получено 30 живых потомков, четыре из которых были химерными (две самки и два самца). Доля химерных животных составила 13,3%, а вклад потомков ЭСК по окраске шерсти достигал 50%.
