Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. Онтогенез гипоталамо-гипофизарно-семенниковой системы млекопитающих 15
1.1.Пренатальний онтогенез 18
1.1.1. Развитие фетальных клеток Лейдига 18
1.1.2. Особенности гонадотропной регуляции биосинтеза тестостерона в фетальных клетках Лейдига 22
1.1.3. Другие функциональные особенности фетальных клеток Лейдига 25
1.2. Постнатальное развитие клеток Лейдига 27
1.2.1. Три стадии развития взрослой популяции интерстициальных клеток 29
12 11 Предшественники клеток Лейдига (14-28 сутки постнатальной жизни крысы) 29
12 12 Незрелые клетки Лейдига (28-56 сутки жизни крысы) 30
1.2.1.3. Взрослые клетки Лейдига (более 56 суток жизни крысы) 32
1.2 2 Гормональная регуляция постнатального развития клеток Лейдига 34
1.2.3. Особенности биосинтеза тестостерона в пре- и постнатальном онтогенезе 41
1.3. Генетические факторы, запускающие и контролирующие развитие и функционирование семенников 49
1.4. Изучение генетически обусловленного полиморфизма андрогенной функции клеток Лейдига 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы 56
2.1.1. Экспериментальные животные 56
2.1.2. Характеристика стимуляторов стероидогенеза 57
2.1.3. Инкубирование клеток Лейдига in vitro 58
2.1.4. Оценка точности метода и тест на разведение при инкубировании клеток Лейдига in vitro 59
2.1.5. Радиоиммунологический метод определения тестостерона 65
2.1.6. Статистическая обработка результатов 68
2.1.6.1. Дисперсионный диаллельный анализ 68
ГЛАВА 3. Собственные результаты 71
3.1. Роль генотипа и возраста в регуляции контрольной и стимулированной продукции тестостерона клетками Лейдига in vitro у мышей 71
3.1.1. Влияние возраста на постнатальную динамику контрольной продукции тестостерона клетками Лейдига 71
3.1.2. Влияние генотипа на контрольную продукцию тестостерона клетками Лейдига 71
3.1.3. Влияние возраста на постнатальную продукцию тестостерона клетками Лейдига при стимуляции ХГ, цАМФ и прегненолоном 77
3.1.4. Влияние генотипа на постнатальную продукцию тестостерона клетками Лейдига при стимуляции ХГ, цАМФ и прегненолоном 78
3.1.4.1. Особенности реактивности клеток Лейдига разных генотипов в возрасте 20 суток 19
3.1.4.2. Особенности реактивности клеток Лейдига разных генотипов в возрасте 35 суток 83
3.1.4.3. Особенности реактивности клеток Лейдига разных генотипов в конце периода полового созревания... 84
3.1.4.4. Особенности реактивности клеток Лейдига разных генотипов в постпубертатном периоде 86
3.2. Генетический диаллельный анализ гормональной функции клеток Лейдига 87
ГЛАВА 4. Обсуждение рузультатов 99
Выводы 120
Литература
- Особенности гонадотропной регуляции биосинтеза тестостерона в фетальных клетках Лейдига
- Три стадии развития взрослой популяции интерстициальных клеток
- Инкубирование клеток Лейдига in vitro
- Влияние возраста на постнатальную динамику контрольной продукции тестостерона клетками Лейдига
Введение к работе
В регуляции мужской репродуктивной системы исключительная роль принадлежит стероидному гормону тестостерону, основным местом биосинтеза которого являются клетки Лейдига семенников. На раннем этапе онтогенеза тестостерон оказывает на репродуктивную систему самцов организационное, или морфогенетическое действие, выступая в качестве индуктора половой дифференцировки урогенитального тракта (Hiort, Holterhus, 2000; Nef, Parada, 2000), нейроэндокринной регуляции секреции гонадотропинов, а также областей мозга, принимающих участие в регуляции полового, агрессивного и некоторых других форм поведения (MacLusky et al., 1997). Во взрослом организме тестостерон осуществляет активирующее влияние на поддержание и функционирование репродуктивной системы самцов на самых различных уровнях ее организации: в этот период андрогены в мужском организме абсолютно необходимы для стимуляции определенных этапов сперматогенеза, развития вторичных половых признаков и реализации андроген-зависимых форм поведения (Brain, 1983).
В изучении происхождения, роста и регуляции функционирования клеток Лейдига в пре- и постнатальном онтогенезе млекопитающих за последнее время достигнуты большие успехи. Известно, что в ходе постнатального развития они проходят через определенные этапы развития - клеточной пролиферации и дифференцировки, достигая своей дефинитивной формы (у крыс и мышей) приблизительно к концу периода полового созревания.
Главным фактором, регулирующим этот процесс, является гормон аденогипофиза - лютеинезирующий гормон (ЛГ). Однако, регуляция стероидогенеза в клетках Лейдига - сложный процесс, в который вовлечены практически все уровни гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной системы. К тому же, в различные периоды онтогенеза, в ходе сложного "жизненного цикла" клеток Лейдига, значение того или иного уровня регуляции меняется (Tahka, 1986; Saez, 1994; Ge et al., 1996; Huhtaniemi, 1996; Pelliniemi et al., 1996; Lejeune et al., 1998).
Биосинтез тестостерона в клетках Лейдига непосредственно зависит от четырех основных ферментов стероидогенеза: Р450ОбЦ или цитохрома Р450, отщепляющего боковую цепь холестерина; 3|3-гидроксистероиддегидрогеназы (ЗрТСД), цитохрома Р450 17а-гидроксилазы/Сп-го-лиазы, и, наконец, 17-кетостероидредуктазы (17КСР) (Saez, 1994). Установлено, что экспрессия генов, кодирующих ключевые ферменты стероидогенеза, также имеет многоуровневую регуляцию, в которой принимают участие ЛГ, цАМФ, андрогены, ростовые факторы и цитокины, а также многочисленные транскрипционные факторы или "орфановые" ядерные рецепторы: SF1, DAX1, WT1, COUP-TP, члены семейства Sox и другие (Luo et al., 1994; Parker, Schimmer, 1997).
С одной стороны, для исследования стероидогенной функции семенников широко используется метод инкубации клеток Лейдига in vitro (Bilinska, Szoltys, 1981; Chase, Payne, 1983; Ge et al., 1999; Sultana et al., 2000). С другой стороны, использование моделей инбредных линий животных с известными функциональными характеристиками клеток Лейдига дает возможность оценить влияние генетических факторов на исследуемые эндокринные показатели.
Ранее, в исследованиях на клетках Лейдига у мышей шести
инбредных линий (РТ, YT, DD, C57BL/6J, А/Не и СВA/Lac), была
выявлена межлинейная изменчивость по цАМФ- и субстрат-
зависимой продукции тестостерона, которая носила
координированный характер, и в ее основе лежала коррелятивная
изменчивость по четырем активностям микросомальных ферментов
стероидогенеза (Осадчук, Свечников, 1994, 1995, 1998).
Во-первых, обнаруженная нами межлинейная изменчивость по гормональной функции клеток Лейдига у взрослых самцов позволяет изучить становление дефинитивных наследственных различий в гормональной активности клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе. Во-вторых, дальнейшее обоснование координированности генетического контроля нуждается в проведении генетического (гибридологического) анализа тестикулярного стероидогенеза.
Очевидно, что гормональная функция гонад - это сложный фенотипический признак, характер наследования и формирование которого в ходе онтогенеза может зависеть как от стадии постнатального онтогенеза, в частности, от стадии дифференцировки клеток Лейдига, так и от множества других регуляторных процессов. В свою очередь, каждый из этих процессов определяется функционированием ряда генов. В основе наследственной изменчивости гормональной функции мужской репродуктивной системы может лежать генетическая изменчивость по любому из звеньев гипоталамо-гипофизарно-семенникового комплекса. Поэтому, изучение генетического контроля гормональной функции мужских гонад и, в частности, формирования наследственной изменчивости в ходе постнатального развития, является фундаментальной задачей в решении проблемы генетической детерминации репродуктивной функции.
В данной работе, с целью изучения процесса формирования
дефинитивного паттерна наследования гормональной функции клеток
Лейдига в ходе постнатального развития у контрастных по андрогенів
зависимым признакам линиям мышей, проведено исследование различных цАМФ- и субстрат-зависимых звеньев биосинтеза тестостерона клетками Лейдига in vitro и изучение формирования генетических компонент фенотипической изменчивости по продукции тестостерона клетками Лейдига при действии различных стимуляторов стероидогенеза.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы заключалась в выявлении возрастных закономерностей и межлинейных особенностей формирования гормональной функции клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе в критические периоды развития и в выяснении генетического контроля этого процесса у 16 кроссов диаллельной матрицы между 4 линиями лабораторных мышей, контрастных по гормональной активности клеток Лейдига взрослых самцов.
В связи с этим мы поставили перед собой следующие задачи:
1. На самцах, полученных по полной схеме диаллельных
скрещиваний, исследовать влияние генотипа и возраста животных, а
также взаимодействия этих двух факторов на гормональную
реактивность клеток Лейдига при действии различных стимуляторов
стероидогенеза: хорионического гонадотропина, цАМФ и
прегненолона в ходе постнатального развития.
2. Изучить формирование наследственных различий по гормональной
реактивности клеток Лейдига по их цАМФ- и субстрат-зависимой
продукции тестостерона при половом созревании.
Установить, на какой стадии онтогенеза появляется наследственная межлинейная изменчивость, свойственная взрослым самцам выбранных контрастных генотипов, и какие изменения она претерпевает в ходе постнатального развития.
Изучить формирование генетических компонент фенотипической изменчивости по продукции тестостерона клетками Лейдига в критические периоды постнатального созревания при действии различных стимуляторов стероидогенеза.
Следует отметить, что для решения поставленных задач нами был использован системный подход - сочетание физиологического исследования и генетического анализа для оценки генотипической изменчивости in vitro и характера наследования гормональной реактивности клеток Лейдига в ходе постнатального развития.
Научная новизна исследования
В данном исследовании впервые на основе системного подхода к изучению гормональной активности клеток Лейдига в сочетании с генетическим диаллельным анализом установлены существенные наследственно обусловленные различия по гормональной функции клеток Лейдига при половом созревании. Важным фактом является координированный генетический контроль всех трех изученных показателей гормональной активности клеток Лейдига, что отражает их цАМФ- и субстрат-зависимую реактивность. Установлено, что в ходе постнатального развития показатели стероидогеннои активности клеток Лейдига претерпевают существенные и индивидуальные для каждой линии (кросса) изменения, достигая своей дефинитивной формы лишь к возрасту двух месяцев, что связано с окончанием полового созревания. Настоящую работу следует рассматривать как
пионерскую в данной области исследования, поскольку впервые проведен генетический анализ характера наследования особенностей функционирования гормональной активности клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе в ходе полового созревания.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Полученные результаты развивают теоретическое представление о закономерностях развития в онтогенезе гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной системы, функциональной активности клеток Лейдига при половом созревании и особенностях характера наследования гормональной функции клеток Лейдига. Исследования выполнены на стыке наук - генетики и физиологии (эндокринологии). В работе было использовано сочетание методов этих дисциплин: различные линии животных и генетический метод анализа и изучение гормональной активности интерстициальных клеток в постнатальном онтогенезе при инкубировании клеток in vitro.
В настоящей работе генетический диаллельный анализ системной регуляции гормональной функции клеток Лейдига выполнен на четырех контрастных по андроген-зависимым признакам линиях лабораторных мышей (РТ, BALB/c, А/Не и CBA/Lac), а также реципрокных гибридах первого поколения между всеми указанными родительскими линиями. Данное исследование расширяет представления о механизмах генетического контроля формирования эндокринной функции половых желез самцов при половом созревании, что может способствовать выработке стратегии идентификации и картирования генетических локусов, детерминирующих наследственные различия по тестикулярному стероидогенезу.
Вклад автора
Выполнение большого по объему эксперимента проводилось коллективно, вместе с тем, основная часть работы, касающаяся выращивания и подготовки экспериментальных животных и оценки гормональной активности их клеток Лейдига, проведена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю признательность сотрудникам лаборатории эндокринологической генетики: к.б.н. Свечникову К.В. за неоценимую помощь в освоении методики по выделению, подсчету и инкубированию клеток Лейдига, старшему лаборанту Никитиной О.Н. за существенную практическую помощь в работе. Особую благодарность автор выражает своему руководителю и заведующему лабораторией к.б.н. Осадчуку А.В. за четкую постановку научной задачи, разработку планов экспериментов, оригинальных методов статистической обработки и помощь в их освоении при обсчете материала.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ.
Структура и объём работы
Диссертация изложена на 149 стр. текста, содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, собственные результаты, обсуждение, выводы и список литературы, который включает 224 литературных источника, из них 201
иностранный. Материалы диссертации включают 13 рисунков и 8 таблиц.
Апробация работы
Результаты работы были представлении на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, 1999, 2003), на IV съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2002), на международной конференции "Эндокринные механизмы регуляции функций в норме и патологии" (Новосибирск, 2002), на международном симпозиуме "Genetic and developmental psychoneuroendocrinology" (Новосибирск, 1999), на II и III съездах ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2004), а также на 16 международной конференции "International Mouse Genome Conference" (San Antonio, USA, 2002).
Особенности гонадотропной регуляции биосинтеза тестостерона в фетальных клетках Лейдига
Главной мишенью для действия ЛГ у самцов являются клетки Лейдига семенников. У плодов крыс существует временная корреляция между началом морфологической дифференцировки, появлением рецепторов к ЛГ (Warren et al., 1984), стимуляцией стероидогенеза ЛГ (Warren et al., 1973; Picon, Ktorza, 1976; Feldman,
Bloch, 1978; Picon, Gangnerau, 1980) и синтезом тестостерона в семенниках (Warren et al., 1973). Все эти события происходят около Е15. Показано, что в семенниках крыс на Е13.5 синтез тестостерона отсутствует (Warren, 1989). Однако у мышей в семенниках на Е13 уже определяли мРНК стероидогенных ферментов, участвующих в синтезе тестостерона (Greco, Payne, 1994). В семенниках плодов крыс обнаружены несколько транскриптов мРНК ЛГ-рецептора, из которых в процессе альтернативного сплайсинга образуется полностью функциональный рецептор. Действительно, внеклеточная часть ЛГ-рецептора появляется в семенниках за сутки до появления полностью функционального рецептора на Е15.5 (Huhtaniemi, 1996). Поэтому, по-видимому, появление рецепторов к ЛГ в клетках Лейдига отмечено к Е15.5 жизни плода крысы. Однако этот факт не означает, что стероидогенез в интерстициальных клетках находится под контролем ЛГ с этого момента.
Как было отмечено выше, ЛГ не определяется в циркулирующей крови плодов крыс до Е18.5. До Е19.5 уровень ЛГ в плазме крови плодов крыс очень низкий ( 5.0 нг/л) (El-Gehani et al., 1998). У грызунов стимуляция семенников плода должна исходить из его гипофиза, поскольку у этих видов в плаценте не синтезируется ХГ. У зародышей крыс, а также кроликов, стероидогенез в клетках Лейдига начинается за несколько дней до начала секреции ЛГ в количествах, достаточных для стимуляции. По-видимому, в отсутствие ЛГ контроль стероидогенеза в фетальных клетках Лейдига осуществляют негонадотропные паракринные факторы. Существуют доказательства, полученные на различных видах млекопитающих, что стероидогенез в фетальных клетках Лейдига начинается независимо от воздействия гонадотропинов (Huhtaniemi, 1996; Lei et al., 2001; Zhang et al., 2002). Подтверждением этого является нормальное завершение половой дифференцировки и развитие наружных гениталий во внутриутробном периоде развития, обнаруженное у новорожденных самцов гипогонадных мышей (мутация hpg), имеющих низкий уровень гонадотропинов на всех стадиях развития, и мышей с отсутствием а-субъединицы гликопротеинов, полученных методом генетического нокаута (Cattanach et al., 1977; Achermann, Jameson, 1999; Zhang et al., 2002).
Хотя семенники начинают синтезировать тестостерон без гонадотропной стимуляции, на поздних стадиях внутриутробного развития ЛГ необходим для обеспечения оптимального уровня продукции тестостерона. Поэтому взрослые самцы с нарушенной функцией ЛГ-секреции имеют недоразвитые гениталии, а именно: сниженное в 10 раз количество клеток Лейдига, примерно в 5 раз меньшие их размеры (Baker, O Shaughnessy, 2001), сниженную гормональную активность клеток Лейдига, незавершенный сперматогенез (Scott et al., 1990; Murphy et al., 1994; Zhang et al., 2002). Подобные нарушения функции гонад описаны также другими авторами, получившими и исследовавшими мышей с разрушенным на стадии развития эмбриональных стволовых клеток геном ЛГ/ХГ-рецептора (Lei et al., 2001). Эффекты мутаций действительно сходны, поскольку гипогонадотропный гипогонадизм развивался у таких самцов также в постнатальном периоде развития. Дефекты фенотипических признаков самца (внешние и внутренние гениталии) развивались примерно к возрасту 60 суток, что свидетельствует о необходимости ЛГ для развития в большей степени взрослой популяции клеток Лейдига, чем фетальной (Kendall et al., 1995; Lei et al., 2001).
Три стадии развития взрослой популяции интерстициальных клеток
На 14 сутки жизни крысы в результате пролиферации и дифференцировки мезенхимных стволовых клеток, ведущих свое происхождение из эмбриональной стадии развития, возникают мезенхимоподобные предшественники клеток Лейдига.
Морфологически клетки-предшественники имеют удлиненную веретенообразную форму и визуально неотличимы от стволовых. Тем не менее, их принадлежность к популяции предшественников идентифицируется по наличию фермента ЗрГСД (Hardy et al., 1990), ЛГ-рецепторов (Shan, Hardy, 1992; Vihko et al., 1992), андрогеновые рецепторы (Shan, Hardy, 1992; Shan et al., 1995) и способности синтезировать андрогены (Hardy et al., 1990; Shan, Hardy, 1992). В экспериментах in vitro было показано, что предшественники содержат мРНК ферментов ЗРГСД, цитохрома Р45017а, ЗаГСД (Hardy et al., 1990; Shan et al., 1995). Клетки-предшественники имеют небольшой объем цитоплазмы и слабо развитый ЭПР. К воздействию ЛГ они очень слабо чувствительны, поскольку на данной стадии клеточной дифференцировки ЛГ-рецепторы имеют только внеклеточный домен. Внутриклеточная часть рецептора появится чуть позже, после чего рецептор будет полностью функционален (Tena-Sempere et al., 1994; Zhang et al., 1994; Zhang et al., 2002).
Механизм, благодаря которому предшественники клеток Лейдига синтезируют определяемые количества тестостерона, имея слабо развитый ЭПР и слабую чувствительность к ЛГ, еще не установлен (Hardy et al., 1990; Ge et al., 1996). Для семенников 21-суточных крысят предшественники клеток Лейдига являются типичными клетками в интерстициальной ткани (Benton et al, 1995). Для мышей, в отличие от крыс, свойственно более раннее созревание клеток Лейдига. В первые сутки жизни в семенниках мышей выявляется значительное количество фетальных клеток Лейдига (Kerr, Knell, 1988). Единичные зрелые интерстициальные клетки появляются в гонаде, начиная с четвертых суток жизни, а в возрасте 9-10 суток они легко идентифицируются как взрослые клетки Лейдига (Kerr, Knell, 1988; Vergouwen et al., 1.991; Mendis-Handagama et al., 1998).
Клетки Лейдига существуют как предшественники достаточно короткое время - с 14 по 28 сутки жизни. После этого предшественники интерстициальных клеток начинают превращаться в незрелые клетки Лейдига, приобретая округлую форму, увеличиваясь в размерах, благодаря значительному развитию гладкого ЭПР и накоплению многочисленных липидных гранул (Ge et al., 1996; Lejeune et al., 1998). Липидные гранулы - это резервуар холестерина и холестероловых эфиров, из которых синтезируется в митохондриях прегненолон при участии цитохрома Р450обц и белка STAR (steroidogenic acute regulatory protein, 37 кДа) (Рис. 2 в разделе 1.2.3.). Характерными признаками формирующихся незрелых клеток Лейдига являются увеличение активности трех основных стероидогенных ферментов, таких как цитохромы Р450Обц, P450i7a (Shan et al., 1993) и ЗрГСД (Murono, 1989; Dupont et al., 1993), что связано с увеличением объема гладкого ЭПР и количества митохондрий (Zirkin, Ewing, 1987). Однако активность фермента 17КСР, катализирующего синтез тестостерона из андростендиона, остается низкой до 35-суточного возраста (Eckstein et al., 1987).
Более того, установлено, что незрелые клетки Лейдига синтезируют в основном 5 ос-редуцированные андрогены, такие как дигидротестостерон, 5сс-андростан-3,17-дион, 5а-андростан-3а, 170-диол (андростандиол), андростерон (Chubb, Ewing, 1981; Tapanainen et al., 1984; Sundaram, Kumar, 1996), что связано с высокой активностью метаболизирующих тестостерон ферментов 5а-редуктазы и ЗаГСД (Murono, 1989; Shan et al., 1993; Дегтярь, Кушлинский, 2002) (Рис. 2 в разделе 1.2.3.). По сравнению с предыдущим этапом развития у незрелых клеток Лейдига количество ЛГ-рецепторов на клетку увеличивается в 3 раза, а андрогеновых рецепторов - в 1.5 раза в расчете на одну клетку (Shan, Hardy, 1992).
Перед началом следующего этапа дифференцировки незрелые клетки Лейдига крыс проходят в интервале между 28 и 56-ми сутками один цикл митотического деления (Lejeune et al., 1998). В исследованиях in vitro показано (Hardy et al., 1990), что около половины популяции клеток Лейдига возникает путем дифференцировки из клеток-предшественников, другая половина -путем митоза вновь дифференцированных клеток, т.е. незрелых клеток Лейдига. У мышей на 21 сутки жизни отмечена низкая пролиферативная активность клеток Лейдига (1.9% делящихся клеток), наиболее высокая активность деления клеток установлена на 29 сутки (7.4 %) (Vergouwen et al., 1991). Это подтверждает наличие фазы незрелых клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе у мышей, а также свидетельствует о более раннем начале процесса созревания популяции зрелых интерстициальных клеток.
Инкубирование клеток Лейдига in vitro
В качестве стимуляторов стероидогенеза in vitro использовали хорионический гонадотропин, дибутирил-цАМФ и прегненолон. Хорионический гонадотропин (ХГ) является природным аналогом ЛГ и синтезируется плацентой приматов и копытных (лошади). При специфическом связывании с рецепторами ЛГ, находящимися на мембране клеток Лейдига, он запускает биосинтез тестостерона (Berridge, 1984; Теппермен, Теппермен, 1989). ХГ отличается от ЛГ количеством аминокислот в молекуле (соответственно, 237 и 213 для ЛГ крыс) и более длительным периодом полужизни in vivo (Setchell et al., 2002). Концентрация ХГ ("Serva", USA) в инкубационной среде с клетками Лейдига - 50 мЕД/мл;
Дибутирил-цАМФ (цАМФ) - производное цАМФ (в дальнейшем), относительно легко проникающее через цитоплазматическую мембрану и стимулирующее протеинкиназу A (Berridge, 1984; Теппермен, Теппермен, 1989). Концентрация цАМФ ("Calbiochem", Switzerland) в инкубационной среде составляла 200 мкМ;
Прегненолон - один из ранних субстратов-предшественников в цепи синтеза тестостерона (Saez, 1994). Концентрация прегненолона ("Sigma", USA) в инкубационной среде составляла 2 мкг/мл. Кроме того, использовали бычий сывороточный альбумин (БСА), фракция 5 ("Sigma", USA) в виде 0.1% раствора в среде Игла.
Мышей забивали путем декапитации, извлеченные семенники декапсулировали и помещали в среду Игла, насыщенную карбогеном (95%Ог+5%С02) и содержащую 0.1% БСА. Пробирки с семенниками переносили в стерильный бокс, где проводили выделение клеток Лейдига. Все процедуры проводили при температуре 20С.
Выделение клеток Лейдига осуществляли механическим способом по модифицированной нами методике (Stoklosowa, 1982). Для этого семенники диспергировали, т.е. последовательно пропускали через набор наконечников для автоматического дозатора объемом 5 см , выпускные отверстия которых имели постепенно уменьшающиеся диаметры. Полученную суспензию фильтровали через нейлоновый фильтр с величиной отверстий около 90 мкм, клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин. при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, клетки ресуспендировали в 1 мл среды Игла.
Данная методика позволяет получить суспензию, содержащую 40-50% клеток Лейдига, выживаемость составляет около 90%. Количество клеток Лейдига подсчитывали в камере Горяева с помощью микроскопа с фазово-контрастным объективом (увеличение х200). Их идентифицировали по специфическому ярко-желтому свечению в среде Игла, содержащей феноловый красный (10 г/л).
Полученную суспензию клеток разводили средой Игла до рабочей концентрации таким образом, чтобы в 1 мл ее содержалось: 105 клеток Лейдига - для 60- и 100-суточных животных; 0.75x10 клеток - для 35-суточных и 0.25x105 клеток - для 20-суточных животных. Суспензию клеток в объеме 100 мкл, содержащую соответственно возрасту 10000, 7500 и 2500 клеток Лейдига, инкубировали со 100 мкл препарата. Для определения контрольной продукции клетки инкубировали со 100 мкл среды без стимуляторов. Продукцию тестостерона пересчитывали в нг на 105 клеток Лейдига за 3 часа для всех возрастов.
Количество клеток Лейдига, измеряемое в тысячах и используемое при инкубировании, было выбрано нами согласно биологическим особенностям развития семенников мышей в постнатальном периоде и реально выделяемому данным методом количеству клеток у животных определенного возраста. У взрослых самцов (60 и 100 суток после рождения) при различной интенсивности проводимых манипуляций с декапсулированными семенниками в среде Игла (процедура диспергирования) можно выделить не менее 100-150 тыс. клеток Лейдига в 1 мл объёма среды. Тогда как у 20-суточных и 35-суточных самцов, в силу возрастных особенностей и по нашим предварительным исследованиям, можно выделить не больше 30 тыс. и 75-90 тыс. клеток Лейдига, соответственно. Этими возрастными и методическими особенностями объясняется выбор концентрации клеток Лейдига для инкубирования.
В двух проведенных дополнительно методических экспериментах были оценены: (1) точность метода или воспроизводимость результатов при манипуляции с суспензией клеток Лейдига в серии повторных опытов (трехкратные повторы) и (2) тест на разведение клеток Лейдига у мышей выбранных возрастов.
Влияние возраста на постнатальную динамику контрольной продукции тестостерона клетками Лейдига
Продукция тестостерона клетками Лейдига при их стимуляции ХГ, цАМФ и прегненолоном значительно сильнее, чем контрольная, зависела от возраста животного (Табл. 5). У 20-суточных самцов стимулированная продукция тестостерона превышала контрольную в среднем в 4.2 раза. К концу препубертатного периода (с 20 по 35 сутки) в ответ на стимуляцию клетки Лейдига значительно увеличивали продукцию тестостерона, о чем свидетельствует возрастание (р 0.00001) в среднем в 5.4 раза усредненной по генотипам продукции гормона в этот период. На резкое увеличение реактивности клеток Лейдига к этому возрасту указывало также существенное (в среднем в 14.7 раза) превышение стимулированной продукции тестостерона над контрольной (Рис. 4). К концу пубертатного периода (к 60 суткам) стимулированная продукция тестостерона снижалась (р 0.00001) в среднем в 1.4 раза, однако при этом превышала контрольную в среднем в 17.4 раза. Далее, в постпубертатном периоде (60-100 суток), происходило дальнейшее снижение (р 0.00001) продукции тестостерона еще в 1.4 раза. У взрослых самцов (100 суток) средняя стимулированная продукция тестостерона превышала контрольную в 12.1 раза.
Реактивность клеток Лейдига к ХГ, цАМФ и прегненолону, как и контрольная продукция, зависела от второго фактора - генотипа (Табл. 5; Рис. 6-8), на что указывали усредненные по возрасту различия в реактивности на данные стимуляторы клеток Лейдига 16-ти кроссов диаллельной матрицы. При добавлении в инкубационную среду стимуляторов максимальную усредненную по возрасту продукцию имели клетки Лейдига кроссов (С х PT)F1, (РТ х C)F1, а минимальную - кроссов (СВА х A)F1 и А (р 0.04). Однако следует отметить существенное влияние эффекта взаимодействия главных факторов - генотипа и возраста животного (Табл. 5), что указывает на значительные изменения характера генетических различий в реактивности клеток Лейдига в постнатальном онтогенезе.
Из четырех исследованных линий мышей наибольшим усредненным по возрасту показателем реактивности к гонадотропину обладали линии С, РТ и СВА, а наиболее низким - линия А (р 0.03). При стимуляции клеток Лейдига цАМФ усредненная по генотипам динамика продукции тестостерона в постнатальном онтогенезе практически совпадала с таковой при стимуляции ХГ (Рис. 4). Однако при этом достоверных межлинейных различий, усредненных по всем возрастам, не выявлено. Изучение усредненного по возрасту влияния генотипа на продукцию тестостерона при стимуляции прегненолоном выявило следующие межлинейные особенности: максимальная реактивность к прегненолону выявлена у клеток Лейдига линии С, минимальная — у А (0.004). Другие две линии РТ и СВА занимали промежуточное положение.
Проявление наследственно обусловленных различий сильно варьировало в постнатальном онтогенезе, о чем свидетельствует высокодостоверное взаимодействие возраста и генотипа при действии каждого из трех стимуляторов стероидогенеза (Табл. 5).
В возрасте 20 суток, несмотря на слабую реактивность клеток Лейдига к стимуляторам в начале препубертатного периода (Рис. 4), были выявлены достоверные различия между 16 кроссами с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Наиболее высокую реактивность имели клетки Лейдига кроссов (С X CBA)F1, (С X A)F1, (РТ х C)F1 и РТ, а наиболее низкую - (С х PT)F1, (РТ х CBA)F1, (СВА X PT)F1 и (СВА X A)F1. На основании планируемых сравнений различия между группами высокодостоверны (Fi)i56=47.45, р 0.00001 - для ХГ; F1(i56=36.45, рО.00001 - для цАМФ и F,,i56=44.00, р 0.00001 - для прегненолона).
Следует также отметить, что из четырех исследованных чистых линий у генотипа РТ в возрасте 20 суток методом планируемого сравнения установлена достоверно более высокая реактивность клеток Лейдига к каждому из трех стимуляторов стероидогенеза по сравнению с остальными тремя генотипами (F1;49=7.65, р 0.008 - для ХГ; F1(49=4.28, р 0.04 - для цАМФ и FM9=14.96, р 0.003 - для прегненолона) (Рис. 6-8).
