Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 8
II. 1 - Старение организма, как результат потери функциональности живой системы: краткий обзор теорий старения. 8
II. 1.1. Пролиферирующие клеточные системы и описывающие их состояние теории старения . 12
II. 1.2. Старение на тканевом и органном уровне. 20
II.2. Лабораторные модели для исследования процессов старения и нарушения функциональности органов и тканей организма. 25
П.2.1. Лабораторные модели с увеличенной продолжительностью жизни. 26
П.2.2. Лабораторные модели с укороченной продолжительностью жизни. 28
11.23. Процессы старения у мышей линий SAM - проявление на различных уровнях организации 34
И.3.1 .Типы стволовых клеток и их потенции к дифференцировке 46
11.3.2. СККМ как материал для клеточных трансплантаций. 51
11.3.3. Некоторые аспекты дифференцировки миобластов 52 П.3.4. Клеточные источники для репарации мышечных волокон. 79
III. РАЗДЕЛ 1. Экспериментальные исследования онтогенеза млекопитающих на мышах sam, характеризующихся ускоренным старением 91
III. 1. Методическая часть раздела 1. 91
III. 1.1. Характеристика линий мышей SAM. 91
III. 1.2.Методология постановки экспериментов. 95
III. 1.3. Методы исследования. 96
Ш.2. Глава 1. Анализ возрастных хромосомных и биохимических нарушений в соматических клетках мышей SAM . 102
Ш.2.1. Возрастные морфо-функциональные и биохимические характеристики и продолжительность жизни мышей линий SAM 102
Ш.2.2. Возрастные изменения соматических клеток мышей линий SAM 104
Ш.2.3. Влияние карнозина на морфо-функциональные и биохимические показатели мышей SAMP 1 112
III.3. Глава 2. Анализ сперматогенеза у разновозрастных мышей линий SAM 121
Ш.3.1. Возрастные аспекты сперматогенеза SAM. 122
Ш.3.2. Влияние карнозина на частоту встречаемости генетически аномальных половых клеток в семенниках мышей SAM. 132
Ш.4. Глава 3. Анализ нарушений эмбрионального развития у мышей SAM 138
Ш.4.1. Нарушения раннего развития мышей SAMP1 139
Ш.4.2. Нарушения постимплантационного развития мышей линии SAMP 145
IV. Раздел 2. Экспериментальные исследования онтогенеза млекопитающих на мышах mdx, характеризующихся нарушением развития мышц . 151
VI. 1. Методическая часть 2-го раздела 157
VI. 1.1. Характеристика линии дистрофин-дефицитных мышей mdx. 157
VI. 1.2. Методология постановки исследований 159
VI. 1.3. Методы исследования 161
VI. 2. Глава 4. Восстановление мышечной ткани мышей mdx после проведения баллистической трансфекции 181
VI. 2.1. Репаративные процессы в интактной мышце мышей и после нанесения повреждения. 182
VI. 2.2. Распределение экспрессии трансгена в мышечной ткани мышей mdx. 186
IV.3. Глава 5. Восстановление мышечной ткани мышей mdx после проведения клеточная трансплантация . 193
IV.3.1. Трансплантация прогениторных клеток в мышечную ткань мышей mdx. 194
IV.3.3. Формирование зоны распространения транспланти рованных клеток в мышечной ткани . 207
VI. Выводы 217
VII. Список цитируемой литературы
- Пролиферирующие клеточные системы и описывающие их состояние теории старения
- Анализ возрастных хромосомных и биохимических нарушений в соматических клетках мышей SAM
- Методология постановки исследований
- Формирование зоны распространения транспланти рованных клеток в мышечной ткани
Введение к работе
Для решения многих биомедицинских и гериатрических проблем с позиций биологии развития необходимы комплексные исследования процесса старения и факторов, влияющих на продолжительность жизни, а также различных аспектов, обеспечивающих функциональную состоятельность органов и тканей организма. Однако, смерть, наступившая в результате старости, достаточно редкое событие даже при современном уровне медицины и, несмотря на многие успехи в этой области. Старение традиционно рассматривают на организменном и популяционном уровне (распространенность в популяции болезней связанных с возрастом, продолжительность жизни, индексы смертности) или на клеточном уровне (различные модели старения клеток in vitro), а не как результат суммы онтогенетических процессов, происходящих в течение всей жизни индивидуума.
Устойчивость (надежность) технической системы равняется устойчивости (надежности) самой неустойчивой ее части. Часто причиной фатального нарушения функций является выход из строя одного, самого слабого компонента системы. Биологические системы отличаются сложностью значительно более высоких порядков, чем самые сложные технические системы. Этим объясняется большое разнообразие теорий старения, которые придают разным аспектам износа организма определяющее значение.
В настоящее время считается, что клеточное старение в культуре in vivo соответствует некоторым (но не всем) изменениям, происходящим при старении целого организма. Более 40 лет назад Хейфлик и Мурхед опубликовали данные о том, что человеческие фибробласты способны реплицироваться в культуре только ограниченное количество клеточных циклов [Hayflick, Moorhead 1961]. Это явление получило название "лимита Хейфлика" и общее признание. После прохождения определенного числа клеточных циклов фибробласты человека прекращают пролиферировать и меняют фенотип - становятся крупнее, распластываются и длительное время переживают в культуре без всяких признаков старения и без проявления маркеров клеточной гибели. Это стабильное состояние клеточной культуры называют репликативным старением, однако является ли это состояние одним из признаков старения клеток в культуре до сих пор обсуждается [Hayflick 2000]. В последние годы были опубликованы работы, доказывающие, что состарившиеся клетки отличаются от клеток более ранних пассажей по многим биохимическим и физиологическим параметрам [Campisi 2000]. Так, стареющие клетки имеют отличные от более молодых паттерны генной экспрессии, в том числе значительные различия в экспрессии многих факторов транскрипции, а также белков, составляющих каскады трансдукции [Kletsas et al, 2004; Wang et al, 2006]. Предполагается, что молекулярные механизмы, приводящие к старению в нормальных тканях организма, включаются в раковых клетках, при лечении цитостатическими препаратами [Schmitt et al, 2002; Schmitt 2006] По некоторым данным стареющие клетки накапливаются с возрастом во многих тканях человека, таких как печень [Paradis et.al, 2001], дерма кожи [Dimri et.al, 1995] и т.д. Накопление стареющих клеток в органах и тканях на поздних этапах онтогенеза характерно не только для человека, но и для других долгоживущих млекопитающих. В недавнем исследовании, результаты которого были опубликованы в Science, показано, что у бабуинов при старении в коже происходит накопление клеток с молекулярными признаками старения и у самых старых особей количество таких клеток достигает 15% [Herbig et al, 2006]. Так как в культуре in vitro клетки, находящиеся в терминальной фазе старения часто экспрессируют цитокины и ферменты, разрушающие не только сами клетки, но и структуры внеклеточного матрикса, высказываются предположения, что и in vivo стареющие клетки, при достаточном их количестве, могут вызывать связанные с возрастом, нарушения в структуре ткани или быть одной из причин патологий, связанных со старением.
В последние годы все более широко обсуждается возможность и пределы репарации стареющих или функционально-дефектных тканей при как помощи активации собственных ресурсов организма при помощи активных фармокологических средств (препаратов), используемых как пищевые добавки, так и за счет использования современных достижений биотехнологии, генных и клеточных технологий. Эти два подхода принципиально различны. В первом случае предполагается активация внутренних процессов репарации в организме, в том числе и клеточной репарации за счет введения в организм геропротекторных средств.
В основе второго подхода постулируется невозможность восстановления функциональности ткани за счет собственных ресурсов организма по причине исходных генных дефектов или соматических мутаций. В современной науке активно разрабатываются методы заместительной генной и клеточной терапии. Только обзоров, анализирующих различные аспекты данных технологий, в настоящее время опубликовано более 10 тысяч (генная терапия) и 1 тысячи (клеточная терапия). Фактически одна из каждых трех работ, опублинованных по этим тематикам, является обзорной. Однако, несмотря на огромный интерес к этой проблеме, эффективные результаты получены только тогда, когда методы генной и клеточной восстановительной терапии разрабатываются для лечения дефектов клеток крови и кроветворных органов. Результаты, полученные для других органов и тканей во многом разочаровывают, так как исследователи надеялись на больший успех.
В связи с вышеизложенным, в нашем исследовании мы рассматриваем аспекты функциональных нарушений связанных с генетическим статусом используемых моделей (ускоренно стареющие мыши SAM и дистрофин-дефицитные мыши mdx). Другим важным аспектом работы явилось исследование возможностей и ограничений применения фармакологических агентов, методов генной терапии и замещающей клеточной терапии для компенсации патологий и восстановления функциональности системы.
Пролиферирующие клеточные системы и описывающие их состояние теории старения
Современные клеточные теории старения были разработаны на основе модели культивирования клеток in vitro. Фибробласты и другие нетрансформированные клетки при культивировании in vitro претерпевают ограниченное число делений (лимит Хейфлика) [Hayflick, 1980, 2000]. По достижении этого лимита наступает репликативное старение клеток - часть клеток прекращает пролиферацию и переходит в постмитотическое состояние, часть клеток гибнет, а часть трансформируются в раковые. Фактически, старение пролиферирующих клеточных систем - это накопление дефектов, снижающих пролиферативную активность клеток и/или инициация процесса клеточной гибели, а механизмы старения - это механизмы реализующие эти дефекты.
Рассматривая модели, использующие клеточные культуры in vitro, следует с осторожностью употреблять термин старение. В данном случае скорее следует говорить о снижении пролиферативной активности или о повышении уровня апоптотической гибели клеток при их культивировании на протяжении многих клеточных циклов. Классическое определение старение - это серия временных процессов, происходящих во взрослом организме, которые раньше или позже приводят организм к смерти (жизнь к завершению). В любом случае старение может быть понято и как сложное многофакторное координированное действие большого количества различных генов. Кроме того, понятие старения включает в себя и значительную и стохастическую компоненту, складывающуюся из внешних и внутренних факторов, приводящих к повреждению и разрушению биомолекул.
Теломеразпая теория старения. В 1971 году А.М.Оловников, пришел к выводу, что при репликации хромосом их концевые участки (теломеры) с каждым делением клетки укорачиваются и при достижении определенного предела репликация хромосом в соматических клетках прекращается, клетки перестают делиться и начинается процесс их старения, заканчивающийся гибелью клетки [Оловников 1995]. Позднее был открыт белок, относящихся к классу обратных транскриптаз и способный достраивать нуклеотидные последовательности в теломерных участках хромосом - теломераза.
Теломерная теория старения также была разработана при исследовании клеток человека в культуре in vitro. Теломеры - структуры, защищающие концы хромосом и состоящие из повторяющейся последовательнстей (TTAGGG у млекопитающих и большинства других позвоночных животных) и комплекса РНК и белков, укорачиваются в каждом цикле клеточной репликации. У человека фермент теломераза, достраивающий концевые участки хромосом и препятствующий укорачиванию теломер, присутствует только в клетках полового ряда и отсутствует в большинстве соматических клеток [Wu et ah, 1999; Kim et ah, 2002]. Фактически, теломерный комплекс маскирует концевые участки хромосом и не дает системе репарации повреждений реагировать на них, как на поврежденную ДНК. Благодаря этому теломеры препятствуют слиянию концов хромосом и таким образом поддерживают стабильность генома [Wright, Shay, 2000]. Также привлекательность теломерной теории старения в том, что в настоящее время укорочение хромосом - это единственный известный молекулярный механизм, позволяющий клеткам учитывать количество пройденных циклов репликации. Также считается, что связанное с укорочением теломерных участков старение это не постепенных процесс, а некоторая триггерная система: программа "старение" включается до того, как длина теломер достигнет критических значений и станет причиной геномной нестабильности (слияние концевых участков хромосом, формирование кольцевых структур, анеуплоидий и т.п.), ведущей к раковому перерождению/Ю я? et.al, 2002].
Остается открытым вопрос, насколько реально работает теломеразный механизм Укорочение теломерных участков в организме человека в норме не обнаруживается.
В последние годы было опубликовано несколько работ, где была исследована длина теломерных участков ядерных клеток периферической крови у пациентов после пересадки костного мозга и у их доноров. У пациентов в течение первого года после пересадки костного мозга наблюдается укорочение теломерных участков хромосом моноцитов [Lee et al 1993]. Однако для тех же пар донор-реципиент было показано, что укорочения теломер хромосом периферической крови не наблюдается. По-видимому, это связано с разной пролиферативной нагрузкой на различные линии трансплантата.
Эмбриональные фибробласты мыши ведут себя в культуре также, как и фибробласты человека. У них также наблюдается пролиферативный период определенной продолжительности и период репликативного старения. Однако такой тесной коррелятивной связи между укорочением теломерных участков хромосом и клеточным старением у мышей не наблюдается. Это связано с несколькими причинами. Во-первых, у мышей теломерные участки хромосом значительно длинее, чем у человека (30-40 Кб и 5-15 Кб соответственно). Во-вторых, у мышей теломеразная активность наблюдается не только в клетках полового ряда, но и соматических клетках [Wright et al 2000]. Поэтому некоторые исследователи считают ведущим фактором клеточного старения клеток мыши in vitro не уменьшение длины теломер (внутренняя причина), а то, что называют культуральным стрессом (т.е. совокупность внешних факторов) [Sherr et ah, 2000]. Старение в результате накопления соматических мутаций.
Одной из наиболее широко распространенных теорий старения является теория соматических мутаций. Эта теория исходно была основана на наблюдениях, что такие радиационные повреждения у животных как неоплазия и генерализованная атрофия сходны с процессами, происходящими на поздних стадиях старения. И тот хорошо известный факт, что радиационное поражение приводит к мутациям в клетках различных тканей организма, дал возможность предположить, что старение может быть результатом долговременного (в течение всей жизни) воздействия природного уровня радиации и других воздействий среды, приводящих к повреждению ДНК.
Анализ возрастных хромосомных и биохимических нарушений в соматических клетках мышей SAM
Изменение хромосом и клеточного цикла гепатоцитов мышей SAM. В соответствии с современными теориями старения, ведущим фактором в процессах возрастных изменений являются изменения в структуре ДНК соматических клеток. В активно пролиферирующией популяции это накопление менее заметно, так как аберрантные клетки выводятся из репликативных циклов и, как правило, погибают. Более показательна в этом отношении популяция постмитотических клеток, одной из которых являются гепатоциты взрослого организма. В данной серии у самцов линий SAMP1 и SAMR1 в возрасте 10 дней, 3 и 6 мес. были исследованы микроядерные аберрации, представляющие собой интерфазный эквивалент аберраций митотических хромосом (табл.Ш-2).
У 10-дневных мышей клетки растущего органа - диплоидные гепатоциты - интенсивно пролиферируют. Высокая частота аберраций свидетельствует в данном случае о высоком уровне повреждаемости генетического материала в гепатоцитах SAM мышей уже в раннем постнатальном периоде. Аналогичные данные литературы, касающиеся какой-либо другой линии, нам неизвестны.
У взрослых, иных, чем SAM, линий, мышей в возрасте 3 и 6 мес. рост органа тормозится, соответственно прекращаются митозы гепатоцитов и тем самым снимается возможность образования микроядер. Картины митоза и тем более микроядерные аберрации в нормальной печени у взрослых млекопитающих, а также у человека обнаруживаются только случайно и чрезвычайно редко. Как видно из табл. Ш-2, взрослые мыши линий SAM имеют высокую частоту аберраций в неоперированной печени, при этом аберрации с варьирующей частотой были обнаружены у всех исследованных животных линий SAMP1 и SAMR1 без статистически значимых различий между ними. Так же регулярно встречаются единичные митозы гепатоцитов и ядра с признаками дегенерации. Как следствие продолжающихся пролиферативных процессов, уровень полиплоидизации ядер у 6-месячных животных увеличен в сравнении с 3-месячными. Можно предположить, что в печени взрослых мышей линий SAM стабильно высокая частота микроядерных аберраций поддерживается непрекращающейся пролиферацией регенеративного характера, по-видимому, вследствие повышенной гибели гепатоцитов. При повреждении печени в результате травмы или заболевания не происходит активации пролиферации диплоидной части популяции гепатоцитов, а активируется процесс увеличения плоидности оставшихся клеток. В печени, регенерирующей после стандартной частичной резекции, индуцируется процесс тотальной митогенной стимуляции клеток остатка органа и волна высокосинхронных митозов. Теоретически ожидается, что таким образом могут быть визуализированы все накопленные в ткани латентные изменения ДНК, способные в ходе митотического цикла преобразовываться в микроядра и сопутствующие аберрации. Как показано в табл. Ш-3 высокий уровень микроядер у мышей SAM обнаруживается уже в неонатальный период и увеличивается у взрослых животных. Достоверных различий в плоидности ядер и частоте хромосомных аббераций у линий SAMR1 и SAMP1 выявлено не было. Для печени 10-дневных мышей характерна пролиферация диплоидных клеток и высокая частота аббераций говорит о нарушении их генетического материала уже в ранний постнатальный период. Известно, что микроядра образуются в ходе митоза и содержат обычно ацентрические фрагменты хромосом, не вошедшие в состав взрослой печени. Для мышей других линий характерно прекращение пролиферации гепатоцитов, когда печень достигает взрослого размера. Однако у мышей SAM частота встречаемости аберрантных клеток продолжается увеличиваться с возрастом, т.е. во взрослой печени SAM продолжаются клеточные деления. Это подтверждается присутствием в печени не оперированных мышей 3 и 6 мес. возраста редких, но постоянно встречающихся митозов. По-видимому, в печени мышей SAM стабильно высокий уровень аберрантных клеток поддерживается непрекращающейся с раннего онтогенетического возраста пролиферацией репаративного характера, идущей по причине повышенной гибели гепатоцитов. Хотелось бы отметить, что эти нарушения в печеночной ткани предшествуют морфологическому и поведенческому проявлению старения, наступающему в возрасте свыше 6 месяцев. Мыши SAMR1 обладают большей устойчивостью к процессам возрастных изменений, однако при индуцированной регенерации печени (4 сут. после частичной гепатоэктомии у животных в возрасте 10 мес. был выявлен высокий уровень аберраций интерфазных ядер, частота которых достигала 47% (табл.Ш-3).
У взрослых мышей практически все гепатоциты полиплоидны, при этом они имеют одно или два ядра. После регенерации уровень плоидности ядер увеличивается (табл. Ш-3). Поскольку вероятность поражения полиплоидного ядра увеличена в сравнении с диплоидным, частота аберраций была пересчитана в расчете на единицу генома, а именно на его диплоидный эквивалент (см. подпись к табл. Ш-3). Такой метод расчета дает возможность на основании прироста частоты аберраций в течение 3 мес. оценить реальную скорость повреждения генетического материала в единицу времени [Uryvaeva, Delone 1995]. Для мышей линий SAM скорость повреждения генетического материала составила 0.059% на диплоидный геном в день. Этот показатель у мышей линий SAM фактически в двое выше, чем у мышей-гибридов CBA/C57BL6, (0.03%), имеющих нормальную для мышей продолжительность жизни [Uryvaeva, Delone 1995].
Методология постановки исследований
В главе 1 мы рассмотрели результаты наших экспериментов по воздействию карнозина на состояние быстростареющих мышей SAMP1. В данном разделе представлены данные о влиянии карнозина на процесс сперматогенеза у тех же экспериментальных групп.
В группе животных, использованных в предыдущих экспериментах по влиянию карнозина на процессы, связанные со старением, были выделены самцы, достигшие 12 мес. и более (SAMP1, п=16 и SAMR1, п=28). Для определения частоты встречаемости генетически аномальных сперматогониев и округлых сперматид использовался метод учета микроядерных аберраций, возникающих в результате фрагментационного эффекта и/или потери целых хромосом во время митотических и мейотических делений. Число аберрантных клеток выражали в промилле (табл. ІІІ-7), полученные данные обрабатывали с помощью статистического пакета SPSS (критерий Вилкоксона; однофакторный дисперсионный анализ). На рис. Ш-8 представлены результаты статистической обработки этих данных в виде модулей "ящик с усами".
Длительное воздействие карнозина у SAMP1 вызывало статистически недостоверное увеличение выхода клеток с хромосомными мутациями в среднем на 20% по сравнению с контролем. Напротив, у мышей SAMR1 под влиянием карнозина частота встречаемости генетически аномальных форм в популяциях сперматогониев и округлых сперматид статистически значимо превосходила уровень интактного контроля на 64 и 85% соответственно. В контрольных и опытных группах мышей линии SAMP1 обнаружены единичные особи с нехарактерными, резко выделяющимися значениями частоты встречаемости сперматогониев с микроядерными аберрациями, которые в статистическом анализе называют "выбросами". Аналогичная картина выявлена в контрольной группе мышей линии SAMR1 при цитогенетическом анализе в популяции округлых сперматид. Однофакторный дисперсионный анализ (критерий Левеня) показал, что у мышей линии SAMR1 разброс (варьирование) частот округлых сперматид с микроядрами в опыте превышает аналогичный разброс в контроле. Другими словами у мышей линии SAMR1 в ответ на действие карнозина в популяции округлых сперматид значимо увеличивается степень генетической гетерогенности. Поскольку неясно, взаимодействует ли карнозин напрямую с генетическим началом, можно предполагать, что в семенниках мышей линии SAMR1 сильные микроядерные эффекты связаны с усилением генетической нестабильности вследствие индуцированных карнозином ферментативных нарушений. С другой стороны, нельзя исключить, что существенное увеличение числа клеток с микроядерными аберрациями в семенниках мышей SAMR1 под влиянием карнозина обусловлен нарушениями механизма устранения гибнущих клеток, одним из основных элементов которого является взаимодействие и баланс специфических белков-"контролеров" апаптоза (р53, Bcl-х, Вах и др.), действующих на стадии размножения сперматогониев и в профазе I мейоза, когда происходит преимущественная элеминация генетически и цитологически дефектных клонов сперматогенных клеток [Print, 1998, Schwartz 1999].
Неоднозначное, разнонаправленное действие при воздействии карнозин на клетки "нецелевого фенотипа" видно также из приведенных ниже данных. Карнозин замедляет старение фибробластов человека в культуре, отодвигая лимит Хейфлика примерно на 10 делений [McFarland, Hollyday, 1994, 1999] и уменьшает количество хромосомных разрывов [Хипкис, 2000]. Также известно, что карнозин, по крайней мере, в условиях in vitro, оказывает токсическое действие на трансформированные и опухолевые клетки [Холлидэй, МакФарланд, 2000].
Традиционно, при исследовании геропротекторных и других препаратов, анализируются процессы, происходящие в органах-мишенях. Так, при исследовании влияния карнозина, традиционно исследуются изменения, затрагивающие ткань головного мозга, так как нейроны и другие нейральные клетки - основная мишень для антиоксидантних, мембранопротекторных и других геропротекторных свойств карнозина [Болдырев, 1992, 2000]. Также исследуется влияние карнозина на клетки крови, в том числе на эритроциты, так как карнозин, присутствующий в плазме крови не может не оказывать (и оказывает) воздействие на форменные элементы крови, в том числе и мембранопротекторное [Болдырев, 1999]. Однако ткани, которые не предполагаются как непосредственные мишени веществ с предполагаемой геропротекторной активностью, привлекают внимание исследователей в значительно меньшей степени. Мыши SAM, сперматогенез которых был исследован в этой серии экспериментов, входили как составная часть в группы, на которых было проведено представленное выше исследование о влиянии карнозина на возрастные изменения. На фоне значимого увеличения средней продолжительности жизни и улучшения морфо-функциональных и биохимических показателей, влияние карнозина на состояние сперматогенного эпителия продемонстрировало более сложную ответную реакцию на этот антиоксидантный и мембранопротекторный агент.
Формирование зоны распространения транспланти рованных клеток в мышечной ткани
Детекция зеленого флуоресцентного белка. Присутствие в мышцах зеленого флуоресцентного белка обнаруживали визуально по свечению под люминесцентным микроскопом. Мышь забивали смещением шейных позвонков на 7, 14 и 65 сутки после введения плазмид pCMV-GFP и pRGH-GFP методом баллистической трансфекции (контроли - введение 168 pGEM7Zf(+) и неоперированные мыши). Исследуемые мышцы дессектировали и помещали в пенопластовую ванночку с жидким азотом, которую переносили в холодильную камеру микротома-криостата МК-25 (t=-20-25C) и приготовляли производили криосрезы толщиной 10-15мкм. Фиксацию срезов осуществляли при комнатной температуре в течение 2 мин 1%-ным формальдегидом на ФСБ, отмывали от фиксатора троекратной сменой ФСБ и заключали в смесь ФСБ-глицерин (1 часть 10-кратного маточного раствора ФСБ на 9 частей глицерина). Гистологические препараты исследовали под люминесцентным микроскопом "Leitz" (длина волны возбуждающего света 495 нм, длина волны флуоресцентного свечения 520 нм).
Детекцию дистрофина человека в мышцах mdx-мышей проводили на 3, 17 и 60 сутки после введения плазмиды pDMD методом баллистической трансфекции (контроль - введение pSV-3-Gal и неоперированные мыши линий C57BL/10J и mdx). Мышцы дессектировали и производили замороженные срезы по описанной выше методике. Дистрофии на замороженных срезах выявляли иммунными реагентами с флуоресцентной (ФИТЦ-коньюгированные антитела) и ферментной (антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена) метками.
Для детекции дистрофина иммунофлуоресцентным методом криосрезы фиксировали (2,5%-ным глутаральдегидом на ФСБ, Змин при комнатной температуре), отмывали от фиксатора срезы (ФСБ, 3 раза), наносили ФСБ с лошадиной сывороткой для блокирования неспецифического связывания антител и помещали препараты на 30 мин во влажную камеру. Затем срезы промывали в 2 сменах ФСБ и наносили ФСБ с поликлональными антителами кролика к миодистрофину человека (Р6) (любезно представлены д-ром Caroline Swery и д-ром Peter Strong, Hammersmith University, London). Препараты помещали во влажную камеру не менее чем на 12 ч. По завершении периода инкубации срезы промывали в нескольких сменах ФСБ в течение 1 ч. Затем проводили инкубацию с вторичными антителами овцы к антителам кролика, конъюгированными с ФИТЦ (Sigma), в течение 1-2 ч. Промывали в нескольких сменах ФСБ и заключали в смесь ФСБ-глицерин, препараты исследовали под люминесцентным микроскопом "Leitz" (длина волны возбуждающего света 495 нм, длина волны флуоресцентного свечения 525 нм).
Для детекция дистрофина иммуноферментным методом, фиксацию срезов и инкубацию с рабочими антителами осуществляли по методике, описанной выше, а затем проводили ингибирование эндогенной пероксидазы (0,1%-ный р-р фенилгидразина на ФСБ, 5 мин.) После отмывки фенилгидразина наносили вторичные антитела овцы к антителам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена на 1-2 часа. Препараты промывали в нескольких сменах ФСБ, после чего погружали на 5 минут в красящий раствор с диаминобензидином (ДАБ) (0,05% ДАБ, 0,01% Н202 на 0,1 М трис-HCl). После окрашивания срезы отмывали в проточной воде и докрашивали гематоксилином Карраччи и 1% раствором эозина. Препараты обезвоживали в растворах этанола возрастающей крепости и ксилоле и заключали в канадский бальзам. Распределение дистрофина в мышечной ткани изучали под микроскопом "Opton".
Молекулярно-генетический анализ присутствия транрсгена в трансфииированных тканях Геномную ДНК стандартным фенол-хлороформным методом и исследовали методом ПЦР с применением стандартной процедуры с незначительными изменениями [Zelenin et ah, 1991]. Праймеры для определения присутствия трансгена подбирали при помощи стандартных компьютерных программ и анализировали при помощи базы данных EMBL.
