Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Материал и методы 14
Глава 2. Проблемы унификации методов стадирования и учета фактора времени в эмбриогенезе позвоночных животных 20
2.1. Современное состояние описательной эмбриологии позвоночных 20
2.2. Понятие о стадиях эмбрионального развития 21
2.3. Принципы разделения эмбриогенеза на подпериоды и стадии 22
2.4. Сомитогенез позвоночных как ритмический процесс 24
2.5. Ts-единица измерения возраста зародышей позвоночных животных 38
Глава 3. Описание и хронология стадий раннего онтогенеза лососевых рыб с использованием новой системы критериев стадирования (на примере атлантического лосося salmo salar l.) 34
3.1. Разделение эмбрионально-личиночного периода на подпериоды и их краткая характеристика 34
3.2. Морфологическое и хронологическое описание эмбрионально-личиночного периода развития атлантического лосося Salmo salar 41
Глава 4. Сравнение процесса раннего онтогенеза у рыб подсемейства лососевых salmoninae, относящихся к разным видам и родам 78
4.1. Сравнение процесса раннего онтогенеза у видов лососей в пределах одного рода (Salmo) 80
4.2. Сравнение процесса раннего онтогенеза у видов лососей из разных родов (Salmo и Oncorhynchus) 81
4.3. Консервативный характер процесса раннего онтогенеза у рыб из разных видов и родов подсемейства лососевых 95
4.4. Развитие новых комплексов адаптации как путь видообразования в подсемействе лососевых 99
4.5. Онтогенетические гетерохронии в связи с вопросом об их роли в эволюционном процессе 104
Глава 5. Исследование временных и пространственных аспектов процесса сомитогенеза 107
5.1. Ритм сомитогенеза находится под контролем уникального по уровню механизма отсчета времени 107
5.2. Сравнение скорости сомитогенеза у нормальных и двойных зародышей 111
5.3. Передне-задняя длина сомитов и сегментов на уровне хорды на разных стадиях эмбриогенеза 115
5.4. Линейные размеры различных частей тела у зародышей рыб в процессе сомитогенеза 118
5.5. Линейная скорость волны сомитогенеза и других биологических процессов 120
Глава 6 Значение фактора времени в регуляции эмбрионального развития 124
6.1. Ритмические процессы в период делений дробления 124
6.2. Контроль времени зародышами и отдельными клетками зародышей на стадиях развития после дробления 125
6.3. Совпадение ритмов синхронных делений дробления, образования сомитов и других процессов эмбриогенеза 127
6.4. Значение механизма отсчета времени в регуляции эмбриогенеза позвоночных 131
6.5. Пресомитная мезодерма (ПСМ) как арена циклической активности генов сегментации 137
6.6. Является ли цикличность основным способом функционирования разного уровня систем зародышей? 138
Глава 7. Организатор шпемана и его роль в построении головного и туловищного отделов зародышей позвоночных 142
7.1. Открытие структуры организатора у зародышей позвоночных 142
7.2. Судьба организатора в процессе гаструляции 143
7.3. Организаторские свойства прехордальной пластинки (мезодермы) 148
7.4. Роль организатора в формировании головного отдела 151
7.5. Граница между головой и туловищем у позвоночных 153
7.6. Участие гомеобоксных и других семейств генов в образовании туловищного и головного отделов тела 157
7.7. К вопросу о единой продольной оси тела у позвоночных 165
Глава 8. Организатор шпемана и происхождение гипофиза 168
8.1.0 преемственности между организатором Шпемана, прехордальной мезодермой (ПХМ) и гипофизом 168
8.2. Что известно о филогенетическом происхождении гипофиза 171
8.3. Базовая схема развития гипофиза в филогенезе 173
8.4. Новая схема онтогенетического происхождения гипофиза 176
Глава 9. Организатор шпемана и происхождение позвоночных 184
9.1. Описание онтогенетических процессов, связанных с участием организатора Шпемана 184
9.2. Реконструкция этапов возникновения организатора Шпемана в филогенезе 187
9.3. Образование ПХМ в онтогенезе у бесчерепных хордовых как причина филогенетического возникновения головы позвоночных 191
Выводы 204
Список литературы 207
- Понятие о стадиях эмбрионального развития
- Морфологическое и хронологическое описание эмбрионально-личиночного периода развития атлантического лосося Salmo salar
- Консервативный характер процесса раннего онтогенеза у рыб из разных видов и родов подсемейства лососевых
- Сравнение скорости сомитогенеза у нормальных и двойных зародышей
Введение к работе
В конце XX— начале XXI столетий можно говорить о настоящем буме в исследованиях тонких механизмов зародышевого развития животных. Методы рекомбинирования и клонирования ДНК, создания библиотек и банков ДНК и РНК, геноинженерия и транс-генез, культивирование клеток и органов, — вся эта методология, возникшая за последние 15-20 лет, необычайно интенсифицировала исследования раннего онтогенеза организмов, . вывела их на уровень описания процессов на молекулярном уровне. Полностью секвени-рована последовательность ДНК в геномах нескольких многоклеточных организмов. Проект Геном Человека, задачей которого было поставлено определить последовательности ДНК во всех 23 парах хромосом человека, практически завершен. В конце концов, мы будем знать полную последовательность всех генов и, наверное, через какое-то время узнаем функции большинства из них, хотя вряд ли только на этом фундаменте мы сможем понять как происходит процесс превращения одной оплодотворенной клетки в многоклеточный организм. О том, что исследователи здесь столкнутся с неимоверными трудностями, можно судить по следующему примеру.
В числе модельных объектов, на которых исследуют проблемы раннего онтогенеза, находится Cenorhabditis elegans, крошечный червячок из нематод. Уже достаточно давно исследователи составили полную схему клеточных родословных, проследив, начиная с одноклеточной стадии, происхождение и судьбу всех клеток этого организма (Sulston et al., 1983). Позднее C.elegans стал первым многоклеточным организмом, у которого удалось «прочитать» полную последовательность ДНК. Предполагают, что в 6 хромосомах этого организма находится около 19 тысяч генов (The C.elegans..., 1998). Сейчас происходит интенсивная работа по выяснению функциональной роли многих из этих генов. И все же приходится констатировать, что решительных прорывов в понимании принципов формообразования — основного и итогового процесса в развитии организма — пока не наблюдается. До сих пор остаются неизвестными пространственно-временные закономерности, на основе которых'должна происходить сборка клеток в структуры, органы и части тела. Без знания этих закономерностей и механизмов, которые направляют, координируют, контролируют последовательность включения-выключения всех этих десятков тысяч
генов, надмолекулярных клеточных структур, отдельных клеток и клеточных комплексов, невозможно будет понять и, может быть, когда-нибудь смоделировать развитие целого организма.
К проблеме онтогенетического развития организма тесно примыкает и проблема происхождения видов и таксонов более крупного ранга многоклеточных организмов, включая подтипы и типы, среди которых нас особенно интересует тип хордовых и подтип позвоночных. Большинство теорий эволюционного развития животного мира в качестве основного источника возникновения эволюционной изменчивости рассматривают ранний онтогенез.
Какова бы ни была природа изменчивости, лежащая в основе эволюции животного мира, трудно отрицать наличие глубокого сходства между онто- и филогенезом. Самая большая разница между ними, видимо, только в том, что они протекают в разных временных масштабах: один в индивидуальном (кратком), другой в историческом (многоколенном) измерении. И есть надежда, что если понять принципы развития организмов в одном измерении, то это приблизит к пониманию принципов развития и в другом измерении. Фактически взаимодействие этих наук и происходит на наших глазах. Так, невозможность объяснить эволюцию как постепенный процесс за счет только отбора неопределенной изменчивости, когда макроизменчивость рассматривают только как итог постепенного накопления микроизменчивости (концепция градуалистической эволюции) (Gilbert et al., 1996; Юнкер, Шерер, 1997), привела к выдвижению теории прерывистого равновесия (El-dredge, Gould, 1972). Эта теория основывается, главным образом, на данных палеонтологии. Ее смысл заключается в том, что эволюция органического мира происходит не с равномерной скоростью, а состоит из коротких периодов бурного эволюционирования, сменяющихся длительной, в десятки и сотни миллионов лет, стабильностью существующих форм. Эта теория пытается в какой-то мере объяснить так называемый Кембрийский «взрыв», т. е. период наиболее бурной в истории эволюции биологической изменчивости, когда за короткий исторический интервал в 20-30 млн лет возникли практически все основные типы современных Metazoa, включая хордовых и позвоночных.
С другой стороны, данные молекулярной биологии последних лет заставили взглянуть на всю эволюцию совершенно новыми глазами. Секвенирование последовательно-
стей ДНК и белков обнаружили чрезвычайный консерватизм в структуре и функциях многих генов от самых низших форм многоклеточных организмов до наиболее сложных позвоночных. Оказалось, что гены высших организмов (например, человека) могут функционировать в клетках низших организмов (например, насекомых), и наоборот. Целые комплексы генов сохранили не только порядок их организации в одной хромосоме, но и основное функциональное предназначение. Так, например, комплекс гомеозисных генов Нох, отвечающий, как считают, за установление передне-задней оси у всех билатеральных организмов от низших червей до млекопитающих, сохраняет почти один и тот же набор гомологичных генов и порядок их расположения в хромосоме у всех организмов. На сходство онтогенетических механизмов в разных группах животных указывает, например, такой факт: мезодермальный организатор головы млекопитающего, будучи пересажен в ранний зародыш эмбриона птицы, может индуцировать развитие головы птицы (Knoetgen etal., 1999).
В нашей работе мы предпринимаем попытку рассмотреть некоторые важные проблемы раннего онтогенеза позвоночных животных не только сами по себе, но и с точки зрения их связи с проблемами филогенеза. Опираясь на новейшие данные биологии развития, молекулярной биологии и палеонтологии, делаем попытку понять с помощью каких механизмов онтогенеза процесс филогенеза может быть обеспечен необходимым материалом.
Автор работы преимущественно исследовал ранний онтогенез рыб из разных семейств и отрядов. Наиболее детально рассмотрено развитие рыб из семейства лососевых (описано развитие более 10 видов). Поэтому основной фактический материал и типовые особенности развития класса рыб будут изложены на примере лососевых рыб.
Во второй части работы будут проанализированы особенности раннего онтогенеза позвоночных вообще. Будут представлены доказательства, что в раннем онтогенезе предков всех хордовых животных решающими явились два события: вначале возникновение хордомезодермального зачатка (у предков низших хордовых), а затем, скорее всего по линии Cephalochordata (предков современного ланцетника), еще одного мезодермального зачатка, сыгравшего главную роль в филогенезе нового головного отдела и, соответственно, всего таксона позвоночных. В эмбриогенезе позвоночных оба эти зачатка идентифициру-
ются на стадиях гаструляции как структуры, входящие в состав так называемого организатора Шпемана (Spemann, Mangold, 1924). Новейшие данные по экспериментальной эмбриологии, молекулярной генетике и палеонтологии доказывают, что голова позвоночных возникла в филогенезе как новый отдел, не имевший гомологов во всей предшествующей эволюции, по крайней мере, если исходить из анатомии головы и из участия в ее построении совершенно нового типа эмбриональных клеток (Gans, Northcutt, 1983; Couly et al., 1993; Conway Morris, 2000).
Проанализировав обширный фактический материал, автор приходит к выводу, что головной компонент организатора Шпемана, идентифицируемый в начале гаструляции, в результате гаструляции инвагинирует в архентерон и превращается в прехордальную пластинку или прехордальную мезодерму, которая позднее играет решающую роль в формировании гипофиза. Опираясь на эти, а также на другие материалы, автор предлагает новую схему возникновения гипофиза в онтогенезе.
В последней главе представлены доказательства того, что разобщенное и независимое поведение туловищной и головной частей организатора Шпемана является следствием их разного исторического происхождения. Появление одной из них (туловищной) знаменует возникновение низших хордовых, а появление другой части организатора становится началом эволюции всех позвоночных. В свете всех рассмотренных фактов предлагается новая онтогенетическая модель возникновения головного отдела позвоночных.
Цели и задачи исследования. Цель работы — проанализировать конкретные механизмы, с помощью которых онтогенетическая изменчивость превращается в изменчивость филогенетическую. Для того, чтобы адекватно подойти к решению этой фундаментальной проблемы была поставлена задача произвести детальные описания ранних онто-генезов группы видов различной степени родства. Предполагалось, что на основе собранного обширного материала удастся выявить точки дивергенции по морфологическим или временным показателям между теми признаками, которые кладутся в основу разделения групп животных на отдельные таксоны, и далее, после их обнаружения, проанализировать каким образом происходит их расхождение. Особое внимание должно было быть уделено временным диверсификациям или гетерохрониям, поскольку, по современным представлениям, именно они являются основным источником морфологической микроэволюцион-
ной изменчивости. Имелось ввиду, что материал, полученный в результате сравнения ранних онтогенезов близкородственных видов, мог прояснить вопрос о распространенности гетерохронии и о том, каковы могут быть механизмы их превращения в конкретные формы морфологической изменчивости.
Не менее, если не более, важной проблемой является задача объяснить происхождение крупных таксонов, таких как классы позвоночных или подтипы хордовых. Эта проблема возникновения изменчивости макроэволюционного уровня пока не смогла найти никаких научных решений, несмотря на огромный массив новой информации, полученный различными дисциплинами за последние 15-20 лет. Автор, накопив значительный опыт в конкретных исследованиях проблем раннего онтогенеза на различных группах позвоночных животных и освоив обширные данные последних лет по экспериментальной эмбриологии, молекулярной генетике и палеонтологии, сделал попытку обобщений, касающихся природы макроэволюционных механизмов, которые могли иметь значение в происхождении низших хордовых и позвоночных.
Научная новизна. Для решения поставленной задачи выявления микроэволюционной изменчивости по результатам сравнительных описаний раннего онтогенеза в группе близкородственных видов, автором были предприняты попытки унифицировать процесс описания этого периода развития, в результате чего:
Предложена новая система градаций периода эмбриогенеза с предпочтением признаков, имеющих дискретное или количественное проявление, что позволило выделить большое число стадий, отделяемых друг от друга естественными, чаще всего одинаковыми временными интервалами.
Для позвоночных разработан новый метод измерения относительного времени, который позволяет наблюдать процесс раннего онтогенеза в едином временном масштабе, независимо от внешних и наследственных показателей; в качестве единицы относительного времени предложено измерять интервал времени xs (тау-сомит), необходимый для образования одной пары сомитов.
Введение в оборот новой безразмерной единицы ts стало возможным после открытия автором закономерности, касающейся процесса первичной осевой метамериза-ции или сомитогенеза: оказалось, что этот процесс при постоянных условиях является строго ритмичным, т. е. интервал Ts для образования подавляющего числа пар.
В результате исследований сомитогенеза была выведена математическая зависимость между продолжительностью ts и температурой инкубации зародышей, которая соответствует уравнению логарифмической параболы второго порядка. Оказалось, что это уравнение наилучшим из известных до сих пор способов описывает эмпирические данные не только по xs, но и по продолжительности любой другой стадии и эмбриогенеза в целом.
Впервые выявлено, что ритмы сомитогенеза и синхронных делений дробления либо совпадают, либо являются кратными, что, наряду с другими фактами, явилось основой для разработки модели внутризародышевых биологических часов, которые с помощью периодически генерируемых сигналов, контролируют и координируют все разнообразие процессов, происходящих в эмбриогенезе.
При рассмотрении эмбрионально-личиночного развития почти полутора десятков видов и экологических форм из трех родов подсемейства Salmoninae, была выявлена практически полная морфологическая и временная идентичность процесса их раннего онтогенеза, что указывает на чрезвычайную консервативность этого процесса в пределах достаточно крупных таксонов. Оказалось, что гетерохронии являются также очень редким явлением, а в тех случаях, когда они были выявлены, их наличие не претворилось в морфологическую изменчивость.
По проблеме, касающейся макроэволюции и происхождения хордовых позвоночных:
Представлены доказательства, что позвоночные животные, наподобие бесчерепным (Cephalochordata), рассматриваемым большинством специалистов в качестве наиболее вероятных предков позвоночных, сохраняют анатомическую медиальную ось вдоль всей ростро-каудальной оси тела; отличие состоит только в том, что недостающую часть хорды в головном отделе позвоночных занимают три кости основания черепа (основная затылочная кость, парасфеноид, сошник), которые имеют удлиненную форму и находятся на одной оси с хордой.
Предложена новая схема происхождения гипофиза: согласно этой схемы, организатор Шпемана ранней гаструлы, перемещающийся в результате гаструляции в будущий головной отдел зародыша, преобразуясь здесь в прехордальную мезодерму, принимает затем активное участие в образовании питуитарной железы.
Предложена новая модель происхождения головного отдела позвоночных.
Теоретическая и практическая ценность работы. На основе точных измерений сомитогенезного интервала Ts составлены таблицы для расчета и определения возраста и стадий раннего онтогенеза для атлантических и тихоокеанских лососей. В настоящее время они широко используются на лососевых рыборазводных заводах.
Впервые предложена модель тотального регулятора процесса эмбриогенеза с участием внутризародышевого механизма биологических часов. Новая схема, рассматривающая происхождение гипофиза из организатора Шпемана, является существенным вкладом в понимание источников возникновения этой центральной нейроэндокринной железы. Предложена модель происхождения новой головы позвоночных, учитывающая многие новые научные данные по эволюции этой группы животных. Материалы статей автора используются в курсе лекций по ихтиологии в С.-Петербургском государственном университете и в курсе лекций по биологии развития в Московском государственном университете, в курсе лекций по ихтиологии на кафедре ихтиологии С.-Петербургского государственного университета.
Часть 1
Сравнительные описания стандартизированных ранних онтогенезов
(на примере видов подсемейства лососевых рыб Salmoninae) как способ
исследования источников филогенетической изменчивости
Понятие о стадиях эмбрионального развития
На таком фоне серия наших исследований, проведенных в разное время на представителях многих таксонов костистых рыб, является, по-видимому, первым в мировой литературе целенаправленным и реализуемым в течение многих лет проектом, специально посвященным систематическому и детальному описанию процесса развития в группе близкородственных таксонов с соблюдением унитарной классификации и единого масштаба времени (Городилов, 1983 а, б, 1985, 1988, 1991, 1994, 1998; Gorodilov, 1996; Горо-дилов и Мельникова, 2003). По ходу этой работы нам приходилось решать некоторые вопросы унификации практики описания эмбриогенеза у разных видов и уточнять некото 21рые общепринятые понятия. Без такой предварительной работы невозможно проводить сравнительно-эмбриологические исследования, тем более, если их задачей ставится рассмотрение такой крупной теоретической проблемы, как проблема механизмов биологической эволюции. Оказалось, что многие понятия, связанные с классификацией эмбриогенеза, с градацией стадий практически не определены, и каждый автор пользуется своей системой классификации интервалов и стадирования. Само понятие стадии не определено в должной мере. Практически каждый из авторов, производящий описание развития исследуемого им вида, нумерует стадии последовательными номерами. Эта нумерация довольно бессмысленна, поскольку сам процесс эмбриогенеза чрезвычайно динамичный, а градации по стадиям, как правило, субъективны и не учитывают особенности тех или иных периодов раннего онтогенеза. Ясно, что пронумерованная система затрудняет возможность ее дополнения или расширения. Еще один вопрос, который также необходимо разрешить в связи с поставленной задачей, — это вопрос об измерении продолжительности развития. У пойкилотермных животных продолжительность отдельных стадий и всего эмбриогенеза зависит от температуры. Чтобы унифицировать его, недостаточно даже проводить инкубацию при постоянной температуре. Только использование параметра относительной продолжительности, способно решить проблему сопоставимого развития. Независимый от внешних и наследственных особенностей показатель относительной продолжительности (или скорости) развития может быть использован для сравнения развития не только пойкилотермных, но и гомейотермных животных. Некоторые из этих методически важных вопросов мы рассмотрим, прежде чем приступать к описанию типовых особенностей эмбриогенеза позвоночных.стадиях эмбрионального развития до сих пор остается дискуссионным. Стадию либо описывают как определенный набор морфологических признаков зародыша в данный момент, либо выражают в количественной форме как возрастное состояние (в часах, днях, градусо-днях и т.д.). В строгом смысле, стадия — это не период, а момент развития. Особенно соответствует такому ее пониманию выражение стадии коли чеством времени развития от момента оплодотворения яйцеклетки. Последнее, однако, должно сопровождаться контролем с помощью морфологических критериев, так как, во-первых, между зародышами имеется определенная асинхронность в развитии, во-вторых, не всегда возможно воспроизвести строго идентичные условия.
В то же время трудно относиться к стадии, описываемой в морфологических понятиях, как к моменту развития. Даже в самом оптимальном случае такая стадия достаточно растянута во времени, поскольку морфологические признаки не появляются и не меняются моментально. В большинстве же случаев диагностические морфологические признаки имеют довольно неопределенные временные рамки. К примеру, выделяют как стадию закладку глазных пузырей; процесс этот сложный и достаточно длительный, и визуально мы можем увидеть их тогда, когда они достигнут довольно крупных размеров. Причем поскольку нет определенных дискретных состояний этого процесса, то каждый наблюдатель сможет увидеть их в разном состоянии, т.е. на разных стадиях.
Задача исследователей заключается в таком подборе морфологических признаков, чтобы стадию можно было определить быстро и с большой точностью. От этого зависит решение многих проблем эмбриологии. Идеалом должно быть достижение такого уровня точности, когда длительность периода проявления признаков, маркирующих стадии, чрезвычайно мала по сравнению с общим временем развития, т.е. приближается к моменту. Для этого надо пользоваться не «долговременными» морфологическими критериями, а уметь находить дискретные, счетные признаки, различные морфологические «нюансы», которые могли бы служить маркерами стадий. Поиск таких критериев является наиболее трудной задачей практической эмбриологии.решении проблем онто- и филогенеза, других вопросов, необходимо научиться ориентироваться в цепи процессов, протекающих в эмбриогенезе различных видов. Принимая во внимание, что эмбриогенез в принципе является целостным, неделимым и непрерывным процессом, все же приходится признать, что для исследовательских и практических задач необходимо выделение тех или иных моментов, или точнееинтервалов, которые можно называть стадиями развития. При решении задачи разделения эмбриогенеза на стадии или другие градации подбор отличительных признаков может носить формальный характер: не по степени ценности их для организма, а с точки зрения точности привязки их к определенным интервалам процесса как маркеров последних, ориентируясь на которые можно описать комплекс сопутствующих признаков. При этом в работе по периодизации эмбрионального развития, на наш взгляд, следует исходить из следующих предпосылок:1) развитие следует описывать не как ряд статичных морфологических состояний, произвольно выбранных наблюдателем, а как динамический процесс;2) для этой цели лучше использовать дискретные и счетные признаки, которые составляют цепь следующих друг за другом предсказуемых состояний;3) как бы много стадий по морфологическим признакам нам не удалось выделить в раннем онтогенезе, их не будет достаточно для того, чтобы отразить непрерывность процесса развития;4) последнее качество чисто формально можно отразить, если выражать развитие в количественном виде, например, временем инкубации зародышей при постоянной температуре или величиной относительной продолжительности процесса.
Для характеристики эмбриогенеза как динамичного процесса особенно ценными являются признаки счетные или с большим количеством дискретных состояний (Городи-лов, 1982, 1985). Описывая ранний онтогенез костистых рыб можно указать на существование, по крайней мере, нескольких закономерно изменяющихся количественных признаков. Среди них такие как синхронные деления клеток во время дробления, сомитогенез, число опорных лучей-лепидотрихий в хвостовом плавнике, число члеников в лепидотри-хиях разных видов плавников.
Серию стадий, выделенных в эмбрионально-личиночном периоде на основе одного признака-маркера или на основе ряда однотипных признаков, предложено называть под-периодами (Gorodilov, 1996; Городилов, 1998). В зависимости от степени градаций признака-маркера, его дискретности или морфометрической изменчивости серия стадий может включать различное их число. Например, в выделяемом нами подпериодс сомитогене за у рыб может быть вычленено по числу пар сомитов от 30-45 стадий у бычковых, карповых, окуневых, до 65-75 у щуковых, корюшковых, лососевых. У других позвоночных число формируемых в эмбриогенезе пар сомитов может достигать несколько сот (у рептилий), и соответственно такое число стадий может быть выделено. Если бы удалось подобрать подобные признаки для других подпериодов раннего онтогенеза, мы бы получили возможность распознавания нескольких сот стадий, описание которых было бы проблемой. Имеет смысл производить описание стадий только наиболее важных и хорошо идентифицируемых по дополнительным признакам. В то же время следует иметь ввиду, что при необходимости могут быть описаны некоторые другие промежуточные стадии. При таком подходе, естественно, нет необходимости нумеровать описанные стадии.
Для разных таксонов высокого или высшего ранга позвоночных могут быть выделены различные подпериоды. Например, исследуя эмбрионально-личиночный период онтогенеза рыб семейства лососевых, мною выделены в этом периоде следующие подпериоды: 1) оплодотворение; 2) дробление; 3) бластуляция; 4) гаструляция; 5) сомитогенез; 6) степень васкуляризации желточного мешка; 7) образование лучей в хвостовом плавнике; 8) оформление непарных и парных плавников. Очевидно, что первые пять подпериодов являются обязательными для всех позвоночных.особенностью раннего органогенеза зародышей позвоночных является процесс последовательной метамеризации вдоль переднезадней оси, в которой первичным процессом является разделение парахордальных пластов мезодермы на серию отдельных телец или сомитов. Они выделяются парами (по одному с каждой стороны), вычленяясь последовательно друг за другом, и общее число их пар может быть от 3-4 десятков (рыбы семейств Gobiidae, Percidae, Cyprinidae) до нескольких сотен пар (змеи). Производными сомитов впоследствии являются миотомы, позвонки, ребра, корешки нервов спинного мозга и другие метамеры. В разных классах позвоночных в этом процессе обращала на себя внимание определенная ритмичность возникновения новых пар сомитов (Price, 1934; Hamburger, Hamilton, 1951; Cooke, Zeeman, 1975). Однако ни один из
Морфологическое и хронологическое описание эмбрионально-личиночного периода развития атлантического лосося Salmo salar
Описание эмбрионально-личиночного развития атлантического лосося Salmo salar Продол- Признаки Краткая характеристика подпериодов. житель- Номер для обоз- Описание основных процессов и ность раз- Рисун начения сопутствующих признаков для стадий. вития от ка к стадий осеменения, Ts стадии Оплодотворение (0-2) 8 Стадии Слияние пронуклеусов и образование зиготы могут является главным содержанием этого подпе- быть вы- риода. делены Киммел и соавторы (Kimmel et al.,1995) выде- по фазам ляют его как период образования зиготы. ядерных циклов Дробление (2-12) 9-12 Стадии Совершается 11 циклов синхронных делений могут раз- клеток одинаковой продолжительности. В личаться конце подпериода образуется высокий бласто- по числу диск, состоящий примерно из 2000 клеток. По- клеток: являются зачатки двух слоев дифференциро- 2,4,8 и ванных клеток: поверхност- т.д. стного эпителиального слоя и перибласта или желточного синцитиального слоя (ЖСС). Бластуляция (12-34) 13-15 Стадии Деления клеток резко замедляются. К середине могут быть подпериода в ядрах появляются ядрышки выделены (20т5). Начинаются морфогенетические пере- по высоте мещения клеток, вследствие которых высокий и форме бластодиск с плоским основанием превращает- бласто- ся в вогнутое со стороны желтка чашевидное диска или образование. По его краю наблюдается скоп- по време- ление клеток, образуя так называемое зароды- ни: ранняя, шевое кольцо. средняя и поздняя бластула
Гаструляция (34-55) 16-18 Стадии Подпериод длится от появления зародышевого обычно узелка с внутренней стороны зародышевого выделяют по форме и величине собственно зародыша и степени обрастания желтка бластодермой По числу пар сомитов может быть выделено до 65 стадий 1-3 пары кольца, обозначающего закладку собственно зародыша, до образования первичного комплекса осевых органов. Внешний, покрывающий бластодиск с анимальной стороны слой клеток называется перидермой: он является производным эпибласта. Перидерма и несколько слоев клеток под ней начинает разрастаться по поверхности желтка (процесс эпиболии). Сомитогенез В течение подпериода формируются 65-67 пар сомитов, из них не менее 60 (считая от 1-й) появляются через один и тот же интервал времени. Эпиболия охватывает 1/3 поверхности желтка. Передняя часть формирующейся нейральной пластинки начинает расширяться. Сразу после образования хорды на каудальном конце ее образуется Купферов пузырек. Его функция остается неясной. Он сохраняется до стадии 38-40 сомитов, когда закладывается анус и каудальный конец хорды теряет связь с желточным мешком. Длина зародыша (L) = 2,0 мм. (56-126) 56-58 19,а-в 5-6 пар 10 пар 17 пар Степень эпиболии зависит от диаметра икринки: у маленьких (5-6 мм) она достигает экватора желточного шара В передней части тела образуются 2 расширения, соответствующие будущим отделам головного мозга: в переднем выделяются зачатки глазных пузырей, а в заднем закладываются средний и задний отделы головного мозга. Длина зародыша (L) 2,3-2,5 мм. В области переднего головного мозга продолжают увеличиваться глазные пузыри и образуется ромбовидная ямка в зоне будущего мозжечка.
Эпиболия может охватывать % поверхности желтка. L = 2.7-2.8 мм В икринках семги Кольской популяции процесс обрастания желтка завершается, а в икринках балтийской популяции обрастание достигает 2/3-3/4. Нервная пластинка на границе между средним и задним мозгом формирует изгиб вверх почти под прямым углом к длинной оси зародыша. В области заднего мозга происходит закладка слуховых пузырьков. В передней части закладываются глотка и пищеводная трубка. В подглоточной области образуется перикардий или сердечная сумка, внутри которой в дальнейшем 60-61 20, а, б 21 а, б 22, а, б 23 пары 27 пар 33 пары вырастает сердечная трубка. L= 3.5 мм. Начинается развитие первичных почечных протоков. Ниже, под сегментированной частью, начинает формироваться зачаток кишечника. В заднем мозге намечаются 5 вздутий нейральнои трубки — 5 нейромеров (в настоящее время специальными методами у позвоночных выделяют до 7 нейромеров: смотри,напр., Lumsden and Keynes, 1989; Kim-mel et al,1995). В глазных бокалах начинают вычленяться линзы. В перикардии начинается рост сердечной трубки. L = 3.3-3.5 мм. У зародышей балтийских популяций лосося почти заканчивается обрастание поверхности желтка. В глазных бокалах вычленяются зачатки линз. Закладка рудиментов каналов почек и кишечника происходит ростро-каудально почти одновременно с процессом сомитогенеза, отставая от последнего лишь на 1-2 сомита. В перикардии происходит быстрый рост сердечной трубки. Происходит закладка передней границы жаберного отдела и зачатка Кювьерова протока. L = 4,0 мм. . Формируются просвет аорты и зачатки 4 жаберных карманов. Ниже глазных пузырей, немного каудальнее их, намечается складка 82 88 24 25 40 пар 45 пар будущего ротового отверстия. Закладывается желудочно-печеночный отдел. Рудименты кишечника и почечных протоков прослеживаются вдоль почти всей сегментированной части осевой (сомитной) мезодермы. Сегментация тела достигает уровня будущего ануса (соответствует 35-36 паре сомитов). После закладки ануса исчезает Купферов пузырек и образуется хвостовая почка, развивающаяся вне связи с желточным мешком. Впереди глаз закладываются обонятельные плакоды. В жаберных зачатках видны по 4 кармана слева и справа и в 1-й ростральной паре развиваются зачатки жаберных дуг.
Сердечная трубка достигает длины 0.6 мм и становится изогнутой (V —образной). Она начинает пульсировать либо спонтанно, либо после внешних раздражений. L = 5 мм. После начала спонтанных пульсаций сердечной трубки внутри уже сформированного просвета дорзальной аорты начинаются покачивания плазмы с небольшим еще числом клеток крови. В зачатке желудка образуется полость. Во 2-й паре жаберных карманов развиваются элементы дуг, а 1-я пара открывается наружу в результате образования 100 27 52 пары 56 пар щелей в покровной эктодерме. L = 5,5 мм. В каудальной части тела с вентральной 107 стороны начинается образование непарной плавниковой складки (ПС). Зачатки дуг образуются в 3-й паре жаберных карманов, в то время как 2-я пара открывается наружу. Происходит дальнейшая дифференциация желудка и начинается обособление от него зачатка печени. В результате того, что сомиты вскоре после их образования подвергаются дифференциации на миотомы, дерматомы и склеротомы (Van Eeden et al.,1996) и в миото-мах развиваются мышечные волокна, вследствие сокращений последних тело зародышей становится слабо подвижным. Передняя часть хорды (до уровня ануса) становится вакуолизированной (пузырчатой). Развивается кровообращение: в плазме крови появляется большое количество эритробластов (эмбриональных эритроцитов).
Начинается развитие грудных плавников. В 111 слуховых пузырьках появляются кристаллы мелких отолитов. Обособляется зачаток печени. По дорсальной аорте кровь проталкивается до уровня зачатка ануса, откуда кровь возвращается по дорсальной вене, достигает уровня 12-14 сомитов и уходит вентрально на 64-65 пар Стадии выделяются по степени охвата желточного мешка сетью кровенос желточныи мешок, где по развивающейся здесь желточной вене возвращается в полость сердца. До 60 пар сомитов образуются при постоянной температуре с равномерной скоростью. Последующие 5-7 пар образуются более медленно. Продолжается рост ПС, особенно вдоль дорсальной стороны туловища. Начинается процесс пигментации глазных бокалов — появляется полоска пигмента по верхнему краю глазных пузырей. Голова зародышей жестко соединена с желтком от уровня глазных пузырей. Система кровообращения: по дорсальной аорте кровь проталкивается до начала каудальной артерии, которая является продолжением аорты в постанальной части тела; впереди развивается церебральная артерия (Arteria cerebralis), по которой кровь достигает переднего края глазных пузырей.
Консервативный характер процесса раннего онтогенеза у рыб из разных видов и родов подсемейства лососевых
У одного из этих двойников (арктический голец) были произведены измерения ряда параметров обоих зародышей, и такие же измерения сделаны у нормальных зародышей из этой же пробы. Эти данные можно видеть в табл. 16. Очевидно, что линейные размеры как всего зародыша, так и отдельных его частей у двойников оказываются меньше, чем соответствующие параметры у нормальных зародышей. Это же касается и осевой длины (размера вдоль ПЗ оси) сомитов у тех и других зародышей. Весьма вероятно, что и вновь формирующиеся сомиты у двойников имеют меньшую осевую длину, чем сомиты нормальных эмбрионов. Отсюда следует, что сигнал для образования нового сомита связан скорее не с количеством материала (клеток) и не с его линейным размером, а с интервалом времени. Последний оказывается одинаковым как 5.3. Передне-задняя длина сомитов и сегментов на уровне хорды на разных стадиях эмбриогенеза Скорость образования большей части сомитов является постоянной. Является ли такой же постоянной их длина вдоль ПЗ оси или она изменяется в течение сомитогенеза? Нами проведены измерения длины сомитов на уровне хорды у зародышей симы (Oncorhynchus masu) на разных стадиях сомитогенеза как раз сразу после выделения их из пресомитной мезодермы. Эти сомиты являются на каждой стадии самыми каудальными. Кроме того, мы провели измерения самых передних сомитов (сегментов), обычно на тех же самых стадиях, чтобы посмотреть, как меняется их ПЗ длина в процессе эмбриогенеза. Все данные были получены как средние величины после измерения осевой длины 6 самых каудальных (новых) или 6 самых ростральных (передних) сомитов, затем разделенной на 6 (см. схему на рис.4).
Результаты всех этих измерений представлены в табл. 17. Очевидно, что ПЗ длина вновь формируемых сомитов практически не изменяется в течение сомитогенеза и остается на уровне 50 um. В то же самое время ПЗ длина передних сомитов (или сегментов, так как сомиты очень быстро начинают дифференцироваться на склеротом и дермомиотом, поэтому лучше говорить о них уже как о сегментах) постепенно увеличивается. Динамика осевой длины для передних и задних, а также для средних сомитов и сегментов на уровне ануса представлена на графиках (рис. 51). Она представлена не только для стадий сомитогенеза, но также и для более поздних стадий вплоть до вылупления зародышей. На этих графиках можно видеть, что осевая длина каудальных сомитов остается неизменной после окончания сомитогенеза еще в течение периода развития, который соответствует относительной продолжительности 20-25 Ts. Позднее она постепенно увеличивается, достигая размера около 200 um. Замечательно, что к стадии вылупления длина каудальных сегментов превышает таковую передних и средних, несмотря на то, что они после сомитогенеза также продолжают расти. 5.4. Линейные размеры различных частей тела у зародышей рыб в процессе сомитогенеза В период сомитогенеза проводились измерения трех следующих частей тела зародыша: 1) длина головы от переднего края до 1-го порядкового сомита; 2) длина сегментированной (сомитной) части; 3) длина несегментированной каудальной части тела (см. рис. 4). Наиболее полный ряд измерений был получен на зародышах арктического гольца, которые мы и приводим в табл. 18. Вполне очевидно, что по мере увеличения числа сомитов линейные размеры головы и особенно сегментированной части туловища постепенно возрастают, тогда как не-сегментированная часть в размерах уменьшается.
Можно предположить, что несегменти-рованная часть включает в себя не только так называемую пластинку пресомитной мезодермы (ПСМ) (Palmeirim et al., 1997; Dubrulle et al., 2001), но также хвостовую почку, которая не подвергается сегментации. Представляет интерес рассмотреть, как изменяется эта часть в процессе сомитогенеза. На стадии 19 сомитов несегментированная каудальная часть тела составляет 1,03 мм. По мере увеличения числа сомитов эта часть постепенно уменьшается, достигая длины 0,40 мм к стадии 60 сомитов и сохраняя эту длину до конца сомитогенеза (67-69 пар). Итак, если хвостовая почка, которая остается несегментированной после окончания сомитогенеза, составляет 0,40 мм, то пластинка ПСМ имеет максимальную длину вдоль оси тела (по крайней мере, на стадии 19 сомитов) 1,03 — 0,40 = 0,63 мм. Поскольку у лососевых рыб размер новых сомитов по длине оси составляет 50ц, то на стадии 19 сомитов в ПСМ может находиться материал для 12 пресомитов. По мере увеличения числа сомитов в сегментированной части размер ПСМ уменьшается и к концу сомитогенеза в ПСМ может находиться не более 2-3 пресомитов. Из выше представленных данных ясно, что время образования сомитов и их длина в ПЗ направлении являются постоянными величинами. Если клетки пресомитной мезодермы (ПСМ) преобразуются строго равномерно в эпителизированные клетки сомита соответствии с внутренними часами, можно оценить скорость движения волны сомитогенеза в ПЗ направлении и сравнить ее со скоростью других клеточных процессов.
В табл.19 мы представляем данные по вычислению скорости движения границы сомитогенеза у разных видов. Иногда продвижение каудальной границы сомитогенеза уподобляют с движением волны: это сравнение достаточно условно, так как мы не знаем, идет ли процесс активации клеток ПСМ постепенно, как это представляют иногда (Cooke, Zeeman,1976), или дискретно, активируя клетки на пространстве одного сомита, у лососевых равном 50 цт. Очевидно, что чем выше температура инкубации, тем выше скорость продвижения соми-тогенезной волны (смотрите данные для горбуши в табл.19). Из данных этой же таблицы также следует, что скорость сомитогенеза зависит от показателя Ts, который, являясь единицей отсчета эндогенного времени, свидетельствует о видоспецифичности этого типа времени у зародышей даже близко родственных видов. Хорошо видно, что у каждого из 4-х видов лососевых рыб при одной температуре 6С значения Ts оказываются неодинаковыми. Этот показатель, будучи температурно зависимым, может у одного вида в пределах толерантного диапазона изменяться по величине в 10 раз (пример для горбуши можно видеть в табл. 19). В то же время, видимо, следует представлять себе, что параметр скорости продвижения сомитогенеза вдоль ПЗ оси не является ведущим. Как было показано в табл. 16, размеры сомитов в нормальных и двойных зародышах оказались неодинаковы, и размер вдоль ПЗ оси первых превышает размер вторых примерно на 1/6; однако, сомиты у тех и других формируются с одинаковым интервалом. Это указывает на то, что более важную и, по-видимому,, первичную роль играет временной фактор, а не пространственный. И поэтому скорость движения волны сомитогенеза является функцией времени, а не пространства.
Сравнение скорости сомитогенеза у нормальных и двойных зародышей
Приведенные здесь факты и наблюдения, касающиеся выявления ритмических процессов в разные периоды эмбриогенеза, а также данные, демонстрирующие контроль времени клетками зародышей в различных экспериментальных условиях, определенно указывают на наличие в зародышах механизма, ведущего отсчет времени, вероятно, от момента оплодотворения и, возможно, до конца эмбриогенеза. Этот механизм осуществляет временную регламентацию процессов развития, благодаря которой каждая стадия протекает в строгих временных рамках, а все расписание подчиняется жестко фиксированному временному расписанию. Какой фактор может быть предложен как пейсмекер этих периодических осцилляции? В качестве пейсмейкера могла бы быть рассмотрена электрическая активность мембран зародышей, изменения которой по различным показателям (мембранный потенциал, электрическое сопротивление) обнаруживают четкую периодичность с продолжительностью ритма, равной клеточному циклу (Божкова и др., 1974; Гойда и др., 1981). Однако вряд ли электрическая активность изменяется сама по себе. Пейсмейкер мог бы быть осуществлен на основе автоматической периодически осциллирующей физико-химической реакции типа реакции Белоусова, открытой в 1950-х (Жаботинский, 1964). Благодаря такому типу реакций удается в течение долгого времени поддерживать ритмические осцилляции в самых простых физико-химических растворах. Используя цветные индикаторы, эти осцилляции можно наблюдать визуально. Интервал между последовательными сигналами не зависит от размеров зародыша, или структуры, или от количества клеток. Это было показано Куком (Cooke, 1975), который, удаляя часть клеток из бластулы Xenopus, получал миниатюрных эмбрионов с тем же самым числом маленьких сомитов, что и у нормальных. К сожалению, Кук не измерял время образования сомитов. Наше исследование зародышей-двойников подтверждает возможность образования сомитов, которые меньше чем нормальные (табл. 15 и 16). Однако самое важное следствие этих наблюдений двойников, состоит в признании первичности фактора времени по сравнению с пространственным фактором. Другими словами, в паре «время-пространство» первый фактор может рассматриваться как ведущий, поскольку он остается неизменным, несмотря на изменение второго.
В пользу особой важности временного фактора указывают также данные о чрезвычайно высокой точности (видимо, не имеющей аналогов в биологических системах) хода биологических часов в эмбриогенезе. Я представил лишь небольшую часть своих данных, сомитогенеза, когда стадии можно определять с наибольшей точностью. Строгий контроль за временем развития проявляется не только в том, что индивидуальные зародыши вступают в сомитогенез очень синхронно, но и в том, что в конце сомитогенеза они сохраняют уровень синхронности на том же уровне, что и в начале наблюдений этого подпериода, хотя у лососей наблюдаемый сомитогенез продолжался более чем месяц (табл. 13, 14). Наконец, подтверждением особо высокой точности работы часового механизма являются данные всех повторных определений интервала Ts: относительные отклонения этого показателя в 2-3 образцах, исследованных при совершенно идентичных условиях, обычно не превышали 1%, а в некоторых случаях даже 0,1% (табл. 13, 14). Учитывая, что такие результаты получены на статистическом материале, можно представить, что в пределах индивидуального зародыша эти часы работают с еще более высокой точностью. Можно считать, что беспрецедентная по точности работа эндогенных часов в эмбрионе обусловлена той необычайно важной ролью временного фактора, которую он осуществляет в обеспечении контроля над процессом развития. Когда представишь себе, насколько точно и согласованно на чрезвычайно малом пространстве происходит включение и выключение тысяч и тысяч генов (Ко et al., 2000), биосинтез ферментов, структурных белков, углеводов, липидов, сборка мембран и других органелл, то трудно вообразить, что все это множество реакций, процессов, синтезов, распадов, взаимодействий может происходить без участия регулирующих все эти события влияний. Как оркестр не может играть согласованно без дирижера, так и процессы, совершающиеся в зародыше, не могли бы происходить без координирующей системы сигналов. Последнюю можно представить себе как своего рода метроном, колебания которого учитываются всеми клетками зародыша, а период колебаний соотносится с длительностью разных процессов, ступеней, этапов дифференциации и морфогенеза как 1:1, 1:2, 1:3 и т. д., т. е. всегда кратно. Уже указанные выше примеры равных или кратных соотношений не только между клеточными делениями и сомитогенезом, но и между молекулярными процессами экспрессии генов убедительно подтверждают эту точку зрения. Можно полагать, что в яйце периодически генерируются некие сигналы, которые воспринимаются всеми клетками зародыша, и являются своего рода триггерами, запус кающими экспрессию генов и блоков генов, включение программ и подпрограмм, диффе-ренцировок и морфогенезов в соответствии с порядковым номером сигнала в разных типах клеток и сегментах зародыша, определяя развитие клеток и надклеточных структур по разным направлениям. Я попытался отразить это представление на схеме (рис. 54). С левой стороны схемы по вертикали изображена временная шкала развития зародыша, начиная от оплодотворения, где единицей времени является период т (То или Ts, если они равны).
Подразумевается, что температура инкубации постоянна и сигналы эндогенного ритма осуществляются через одинаковые промежутки времени. С правой стороны от шкалы времени на горизонталях обозначено развитие некоторых структур, частей, сегментов, органов зародыша, причем все части или органы, размещенные на одной горизонтали, начинают или завершают какие-то этапы преобразований в одно и то же время, т.е. по одному временному сигналу. В основе схемы лежат данные по развитию эмбрионов лососевых рыб (Городилов, 1983а, 1998; Gorodilov, 1996). Например, в течение первых интервалов т происходят деления дробления, в результате которых число клеток каждый раз удваивается. Через 12 т от начала развития формируется бластула с поверхностным слоем эпителия (ПСЭ), бластодермой и желточным синцитиальным слоем (ЖСС) (Городилов, Свимони-швили, 19816). Через 56 т образуется комплекс осевых органов и начинается сомитогенез и т. д. Образование новых органов и усложнение уже заложенных происходит и после обозначенного на схеме срока. Так, брюшные плавники закладываются на 215 т, а жаберные тычинки на 250 т. Из повторяющихся структур более позднего периода можно отметить закладку серии опорных лучей в хвостовом плавнике, которые в количестве 20-21 образуются через интервалы 7 т в период развития от 180 до 320 т. К последнему сроку эмбриогенез уже заканчивается, морфологическое развитие, за исключением деталей, завершается. Исходя из данной схемы регуляции процесса эмбриогенеза с помощью системы периодических сигналов, можно предсказать некоторые важные следствия такой системы регуляции: 1) Все процессы зародышевого развития самых разных уровней, от молекулярного до морфогенетического, должны иметь периодическое включение/выключение и быть равными или кратными интервалу т .
