Содержание к диссертации
Введение
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1 Методы оценки происхождения сельскохозяйственных животных 13
1.2 Оценка происхождения сельскохозяйственных животных по родословным 16
1.3 Иммуногенетическая экспертиза происхождения свиней 21
1.4 Использование генетических маркеров в селекции свиней 26
1.4.1 ДНК - микросателлиты, их характеристика и структура 33
1.4.2 Анализ микросателлитных локусов 37
1.4.3 Исследование сельскохозяйственных животных по микросателлитным маркерам 44
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 50
2.1 Материалы 50
2.1.1 Животные 50
2.1.2 Реактивы и расходные материалы 52
2.1.3 Оборудование 53
2.2 Методика исследований 53
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 59
3.1 Разработка системы анализа полиморфизма ДНК-МС свиней 59
3.1.1 Выбор локусов и теоретическое моделирование системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС 59
3.1.2 Экспериментальное моделирование системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС 61
3.2 Оценка информативности разработанной системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС 66
3.2.1 Определение среднего числа аллелей ДНК-МС у исследуемых пород свиней 66
3.2.2 Распределение частот встречаемости аллелей
ДНК-МС у исследуемых пород свиней 69
3.2.3 Вероятность совпадения генотипов в зависимости от исследуемого числа локусов 72
3.3 Характеристика генофонда и выявление генетических различий между группами свиней различной породной принадлежности (пород крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок) и происхождения (российской и канадской селекции) 73
3.3.1 Анализ аллелофонда по шести локусам ДНК-МС у
исследуемых групп свиней 73
3.3.2 Анализ степени гетерозиготности 84
3.3.3 Анализ показателей F-статистики 86
3.3.4 Анализ генетической принадлежности индивидуумов к своей популяции 89
3.3.5 Анализ генетических различий между группами свиней исследуемых пород 91
3.4 Характеристика генофонда и выявление генетических различий между группами свиней крупной белой породы различного происхождения 105
3.4.1 Анализ аллелофонда шести локусов ДНК-МС у исследуемых групп свиней 105
3.4.2 Анализ степени гетерозиготности 112
3.4.3 Анализ показателей F-статистики 113
3.4.4 Анализ генетической принадлежности индивидуумов к своей породе 114
3.4.5 Анализ генетических различий между группами свиней крупной белой породы 116
3.5 Оценка системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС в контроле достоверности происхождения свиней 128
3.5.1 Сравнительное тестирование достоверности происхождения свиней с использованием групп крови и ДНК-МС 128
3.5.2 Экспериментальная апробация системы для генетической экспертизы происхождения свиней различных пород 133
3.6. Экономическая эффективность проведения генетической экспертизы свиней 137
4 ВЫВОДЫ 140
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 143
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 144
- Методы оценки происхождения сельскохозяйственных животных
- Материалы
- Разработка системы анализа полиморфизма ДНК-МС свиней
Введение к работе
Актуальность темы. Важная роль в обеспечении населения Российской Федерации полноценными продуктами питания отводится свиноводству. Успех в увеличении производства свинины во многом определяется интенсификацией отрасли, совершенствованием животных, улучшением селекционно-племенной работы, использованием достижений в области биотехнологии [Программа развития свиноводства РФ на 2005-2010 гг. и на период до 2015 года].
Интенсивное развитие свиноводства на современном этапе предъявляет повышенные требования к контролю происхождения племенного материала. Селекционные программы совершенствования свиней во всех странах с развитым свиноводством базируются на использовании индексов племенной ценности (EBV) отдельных признаков и комплексных BLUP-индексов, при расчете которых учитываются продуктивные показатели не только самого животного, но и всех его родственников [Чинаров Ю.И., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., 2006; Амерханов Х.А., Зиновьева Н.А., 2008]. В этой связи, достоверность происхождения животных является одним из основополагающих факторов, обуславливающих . эффективность селекционно-племенной работы.
Принимая во внимание большое значение достоверности происхождения племенных животных, Министерство сельского хозяйства РФ в качестве одного из обязательных требований для аккредитации племенных заводов, генофондных хозяйств и селекционно-гибридных центров ввело проведение генетической экспертизы происхождения ремонтного молодняка [Приказ Минсельхоза РФ № 402 от 19 октября 2006 года].
Следует отметить, что начиная с 2006 г., Министерством сельского хозяйства России разрешен контроль достоверности происхождения племенных животных с использованием молекулярно-генетических методов
8 в лабораториях молекулярно-генетической экспертизы, аккредитованных Министерством сельского хозяйства РФ [Приказ Минсельхоза РФ № 402 от 19 октября 2006 года]. Одной из таких лабораторий является ГНУ ВНИИЖ Россельхозакадемии (Регистрационный код в государственном племенном регистре № 502504803000).
Таким образом, возникает необходимость в разработке аналитических систем для проведения молекулярно-генетической экспертизы происхождения животных. Перспективным приемом в этой связи является использование ДНК-микросателлитов. Под термином «микросателлиты» понимаются короткие тандемные повторы - один из наиболее распространенных типов повторяющейся ДНК [Tautz D., 1989]. Эти последовательности составляют основу высокого. полиморфизма микросателлитов у всех эукариот, имеющих определенную локализацию для каждого вида. Вместе с тем, функциональное значение их практически неизвестно, хотя, как предполагают, роль и значение их в организме достаточно велика. Доказательство тому — обязательное присутствие микросателлитных последовательностей в областях рекомбинаций, регуляции генной активности, конденсации и упаковке ДНК и хромосом. Большая часть микросателлитов является анонимной, то есть ген, его нуклеотидная последовательность еще до конца не изучены и в этом направлении требуются дальнейшие исследования. Тем не менее, другая часть представляет собой известные гены, у которых определена не только нуклеотидная последовательность, но и функция самих генов [Марзанов Н.С. и др., 2005]. Высоко полиморфный характер и менделевский тип наследования микросателлитов делает их идеальными ДНК-маркерами в геноме сельскохозяйственных животных.
По мнению Сулимовой Г.Е. [2004] основным ограничением широкого практического применения ДНК-МС в качестве генетических маркеров является высокая стоимость оборудования и реагентов. Так, при использовании наборов для проведения генетического анализа свиней на
9 основе использования ДНК-МС, предлагаемых компанией ABI - одним из мировых лидеров в области разработки и производства оборудования и наборов для молекулярно-генетических исследований составляет около 500 руб., что делает использование ДНК-МС в сельскохозяйственной практике экономически нецелесообразным. Вместе с тем, при разработке более совершенных и дешевых технологий анализа ДНК-МС этот подход может стать преобладающим.
Наряду с использованием в качестве инструмента контроля происхождения животных, ДНК-микросателлиты находят практическое применение в выявлении степени генетических различий между различными породами, типами, стадами и генеалогическими группами животных, в характеристике линейной и внутрилинейной структуры стад [Проскурина Н.В. и др., 2006]. Калашникова Л.А. с соавторами [2000] отмечают, что в настоящее время практически отсутствуют характеристики генофонда сельскохозяйственных животных России по полиморфизму генома, ДНК-маркерам - аллельным вариантам генов, связанных с продуктивностью, адаптационными качествами, устойчивостью к болезням, оценке генетического разнообразия. Такие характеристики являются необходимыми для принятия решений по вопросам сохранения и рационального использования генофонда сельскохозяйственных животных.
Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилось мультилокусное исследование ДНК-микросателлитов для характеристики генофонда свиней различной породной принадлежности и происхождения, разводимых в сельхозпредприятиях России.
Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи: 1. Изучить спектр микросателлитных маркеров свиней, выполнить теоретическое и экспериментальное моделирование мультилокуснои системы анализа ДНК-МС.
Изучить аллелофонд свиней различных пород по ДНК-МС, оценить информативность разработанной мультилокусной системы анализа.
Выполнить оценку прикладной значимости системы в выявлении генетических различий между группами свиней различных пород.
Оценить информативность системы в характеристике генофонда и в выявлении генетических различий между внутрипородными группами свиней различного происхождения на примере крупной белой породы.
Дать оценку результативности системы в контроле достоверности происхождения племенных свиней в сравнении с данными тестирования по эритроцитарным антигенам.
Выполнить анализ материальных и временных затрат на проведение мультилокусного исследования ДНК-МС.
Научная новизна исследований. Разработана мультилокусная система анализа свиней по ДНК-МС, включающая 6 маркеров. Выполнена экспериментальная апробация системы для характеристики генофонда и установления генетических различий между группами свиней пород ландрас, дюрок, йоркшир и крупная белая различного происхождения, установлены генеалогические связи между ними. Дана оценка результативности разработанной системы анализа ДНК-МС в проведении генетической экспертизы происхождения свиней.
Практическая значимость. Доказана высокая информативность разработанной мультилокусной системы генетического анализа свиней по ДНК-МС для характеристики генофонда свиней пород дюрок, ландрас, йоркшир и крупная белая различного происхождения и установления генетических различий между ними. Показана прикладная значимость системы как инструмента генетического контроля происхождения свиней: выявлено 100% совпадение результатов тестирования свиней с использованием ДНК-МС и эритроцитарных антигенов. Использование
разработанной системы анализа ДНК-МС позволит автоматизировать проведение генетической экспертизы происхождения свиней, дать характеристику генетической и генеалогической структуры пород, типов и линий свиней, разводимых в Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту
Мультилокусная система генетического анализа свиней, включающая 6 локусов ДНК-МС.
Характеристика аллелофонда и генеалогические связи между группами свиней пород крупная белая, йоркшир, ландрас и дюрок различного происхождения, выявленные на основе анализа ДНК-МС.
Мультилокусное исследование ДНК-МС как критерий для выявления генетических различий между внутрипородными группами свиней различного происхождения на примере крупной белой породы.
Мультилокусное исследование ДНК-МС как метод для проведения молекулярно-генетической экспертизы происхождения свиней.
Апробация работы. Результаты исследований были доложены:
на 6 международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы: ВИЖ, 19-20 декабря 2006 г;
на международной научной конференции ВНИИГРЖ «Современные методы генетики и селекции в животноводстве», Санкт-Петербург, 26-28 июня, 2007 г;
на четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности», Санкт-Петербург: Политех, ун-т, 2-5 октября, 2007 г;
на международной конференции «Вычислительная филогенетика и
геносистематика, ВФГС 2007», посвященной 50-летию становления
отечественной филогенетики и геносистематики, Москва, 16-19 ноября, 2007 г
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ «Сельскохозяйственная биология» и «Доклады РАСХН».
Структура и объем работы. Диссертация написана на 160 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа содержит 53 таблицы и 21 рисунок. Список литературы включает 164 источника, в том числе 80 на иностранном языке.
Методы оценки происхождения сельскохозяйственных животных
Повышение эффективности контроля происхождения племенных животных - одна из важнейших задач племенного животноводства.
Одним из первых методов оценки сельскохозяйственных животных по происхождению была родословная. Ведение родословной животных известно во многих странах издавна. Однако широкое распространение оно получило со 2-й половины 19 в., в период интенсивного развития породообразовательного процесса в животноводстве. Значение родословной сельскохозяйственных животных в племенной работе в животноводстве подтверждается мировой зоотехнической практикой. Знание родословной позволяет более правильно оценить хозяйственные и племенные качества животного в молодом возрасте, выбрать формы подбора животных и установить направление племенной работы с ними [Борисенко Е.Я., 1967].
В современных условиях в связи с высокой стоимостью племенных животных, увеличением импорта и применением биотехнологических методов при воспроизводстве необходимость надежной системы идентификации и контроля происхождения животных становится особенно актуальной [Зайцева М.А., 2001].
В настоящее время экспертиза происхождения племенных животных проводится иммуногенетическим методом - тестированием групп крови. Контроль отцовства (материнства) основывается на принципе исключения. Группы крови, имеющиеся у потомка, должны встречаться у одного или обоих родителей. В противном случае сведения о происхождении потомка неверны [Бакай А.В., Кочиш И.И., Скрипниченко Г.Г., 2006].
Открытие множественного аллелизма систем эритроцитарных антигенов, белков и ферментов крови в 60-80 гг. прошлого века положило начало широкому применению метода генетического маркирования племенного поголовья животных. Однако было обнаружено, что целый ряд генетических систем групп крови и белков у некоторых пород животных (особенно у пород с международным распространением) обладает пониженным уровнем полиморфизма, что значительно снижает уровень достоверности контроля. Эта ситуация осложняется и тем, что при современных методах селекции практически во всех породах при проведении генетического мониторинга наблюдается общее снижение уровня полиморфизма традиционных генетических систем, вплоть до исчезновения редких аллелей, являющихся наиболее эффективными маркерами [Зайцева М.А., 2001].
Прогресс в изучении генома сельскохозяйственных животных и разработка новых методов молекулярно-генетического анализа предоставили практическую возможность использования методов анализа ДНК в экспертизе происхождения племенных животных [Калашникова Л.А., 2002].
Наиболее точными для контроля происхождения животных, в частности свиней, являются методы молекулярной генетики, основанные на анализе сателлитной ДНК, широко используемые в генетической и судебно-медицинской экспертизе человека, нашедшие применение в генетике и селекции животных. Локусы сателлитной ДНК имеют определенное положение в геноме, каждый локус содержит определенное число аллелей, различающихся по числу пар оснований. По своей структуре сателлит представляет собой участок ДНК, содержащий ряд коротких нуклеотидных повторов - мотивов, ограниченный с двух сторон уникальными последовательностями. Более информативны в этом плане микросателлитные последовательности. [Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Иванов В.А., Иолчиев Б.С., 2005].
Таким образом, на сегодняшний день наиболее эффективным способом контроля достоверности происхождения и идентификации сельскохозяйственных животных, в том числе свиней, является генетическое тестирование, основанное на использовании ДНК-МС.
Материалы
Анализ информативности разработанной системы генетического анализа свиней проводили на 531 голове свиней пород крупная белая (7 популяций, п=290), йоркшир (3 популяции, п=93), ландрас (2 популяции, п=79) и дюрок (2 популяции, п=69).
Оценку прикладной значимости системы в выявлении генетических различий между группами свиней различной породной принадлежности проводили на племенных свиньях отечественной и зарубежной селекции. Выборка свиней отечественной селекции была представлена племенными животными пород крупная белая из ПЗ «Талдом» Московской области (п=52), ландрас из ПЗ «Нива» Московской области (п=53) и дюрок из ПЗ «Талдом» Московской области (п=33). Свиньи представленных групп длительное время разводились в себе без прилития крови свиней импортной селекции. Выборка свиней зарубежной селекции была представлена 118 племенными свиньями, завезенными в племпредприятия России из 3-х независимых ферм Канады, входящих в систему национального генетического нуклеуса Канады, пород йоркшир (п=56), ландрас (п=26) и дюрок (п=36).
Для характеристики разработанной системы в выявлении генетических различий между внутрипородными группами различного происхождения были исследованы 290 голов свиней крупной белой породы. Выборка была представлена 7-ю группами животных из ПЗ «Ачинский» Красноярского края (КБ1, п=40), ЗАО «Агрофирма Дороничи» Кировской области (КБ2, п=14), ОАО «Камский бекон» Республики Татарстан (КБЗ, п=30), ЗАО ПЗ «Константиново» Московской области (КБ4, п=65), ГПЗ «Талдом» Московской области (КБ5, п=52), а так же основными хряками и свиноматками белорусской селекции из СГЦ «Заднепровский» Республики Беларусь (КББ, п=53) и племенными животными, завезенными в Россию из Франции (КБФ, п=36).
Оценку системы как инструмента для проведения генетической экспертизы происхождения свиней проводили на 12 триадах (отец - мать -потомки) свиней крупной белой породы из ЗАО ПЗ «Заволжское», достоверность происхождения которых была предварительно подтверждена генетическим тестированием с использованием групп крови в лицензированной лаборатории ЗАО ПЗ «Заволжское». Последующую практическую апробацию системы для генетической экспертизы происхождения осуществляли на свиньях 3-ех пород: крупная белая (5 гнезд) ЗАО ПЗ «Юбилейный» Тюменской области (п=35), дюрок - 5 гнезд (п=43), йоркшир - 5 гнезд (п=51) из ПЗ «Гибридный» Самарской области
Разработка системы анализа полиморфизма ДНК-МС свиней
В настоящее время Международным обществом генетиков (ISAG) для генетического исследования свиней рекомендованы 15 микросателлитных локусов. Исходя из длин образующихся фрагментов амплификации локусов, а так же принимая во внимание возможность использования различных флуоресцентных красителей для мечения фрагментов, нами были выбраны 6 локусов: S0155, SW24, S0355, S0386, SW951, SW72.
Современные генетические анализаторы позволяют осуществлять одновременную детекцию продуктов амплификации, меченных 4-5 флуоресцентными красителями. Так как многие флуоресцентные красители (ТЕТ, NED и т.п.) характеризуются высокой стоимостью, при моделировании системы нами учитывался стоимостной аспект. Для включения в систему нами были выбраны такие микросателлитные локусы, идентификация которых в одной реакции может быть осуществлена с использованием двух красителей (FAM и R6G), что существенно снижает затраты на реактивы. При выборе красителя для мечения фрагментов амплификации локусов ДНК- 60 МС учитывали, чтобы область одного микросателлитного маркера не пересекалась с другим маркером, меченым тем же красителем.
Смоделированная мультиплексная система схематично представлена на рисунке 5.
Локусы, амплифицируемые с использованием праймеров, меченных FAM, показаны синими прямоугольниками, а меченных R6G - черными прямоугольниками. Минимальная и максимальная длина аллелей показана в парах оснований (п.о.) вверху (внизу) соответствующих прямоугольников.
Таким образом, смоделированная нами мультиплексная система генетического анализа свиней на основе ДНК-МС включала 6 локусов: SW24, S0155, SW72, SW951, S0386 и S0355. Объединение локусов в одну аналитическую систему достигалось за счет использования двух флуоресцентных красителей FAM и R6G.
Экспериментальное моделирование системы генетического анализа свиней на основе ДНК-МС осуществлялось в несколько этапов:
оптимизация ПЦР по составу реакционной смеси (определение рабочей концентрации праймеров).
выбор и оптимизация температурно-временного режима проведения полимеразной цепной реакции;
Оптимизация состава реакционной смеси для ПЦР
Результативность одновременной амплификации в одной реакции более чем одного локуса, во многом, зависит от оптимально подобранной рабочей концентрации праймеров. Различные температуры плавления праймеров, а так же различная эффективность отжига праймеров приводит к тому, что амплификация фрагментов некоторых локусов происходит более эффективно, что в итоге выражается в избыточном накоплении продуктов амплификации одних локусов и недостаточном накоплении продуктов амплификации других локусов. В последующем, это существенно влияет на способность детектирования продуктов реакции. В этой связи, оптимизация рабочей концентрации праймеров в конечном итоге определяет результативность всей системы генетического анализа в целом.
В таблице 5 приведены рабочие концентрации праймеров, оптимизированные экспериментальным путем в ходе выполнения диссертационной работы.
Нами была оптимизирована реакционная смесь для проведения мультиплексного анализа шести локусов ДНК-МС. Реакции проводили в конечном объеме 15 мкл. В пробирки вносили по 14 мкл реакционной смеси, состоящей из 1,5 мкл ЮхПЦР-буфера (16,6 мМ (NHL SO 67,7 мМ Трис -НС1, рН = 8,8; 0,1 (v/v) Tween 20) и 1,5 мкл 2 мМ раствора динуклеотидтрифосфатов, 0,15 мкл 100 мМ раствора МСІ2, 2,54 мкл 10 pmol смеси праймеров в пропорции, указанной в таблице 5, 0,2 мкл (1 ед.) Taq- 62 полимеразы, 8,01 мкл бидистиллированной воды, и добавляли 1 мкл (50-100 нг) исследуемой геномной ДНК.
