Содержание к диссертации
Введение
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Сперматогенез у млекопитающих 7
1.1.1. Происхождение и развитие половых клеток 7
1.1.2. Стволовые сперматогониальные клетки 11
1.1.3.Развитие мужских половых клеток в базальном (сперматогоииалыюм)
компартменте 15
1.1.4. Стадия роста половых клеток или мейоз 22
1.1.5. Спермиогенез: процесс постмейотического созревания мужских половых клеток 26
1.1.6. Роль клеток Сертоли и Лейдига в поддержании развития половых клеток
и регуляция сперматогенного процесса 29
1.2. Биологическая модель ускоренного старения 34
1.3. Особенности сперматогенного процесса у ускоренно стареющих мышей линий SAM 39
1.4. Биологические эффекты дипина 43
II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
II.1. Постановка эксперимента 49
II.2. Фиксация материала, приготовление и окраска препаратов 49
II.3. Патогенетические методы
II.3,1, Метод учета сперматогониальных и мейотических микроядер (микроя дерный тест) 50
11,3.2. Метод учета аномалий форм головок спермиев 52
11.4. Цитоспектрофотометрический анализ 53
П.5. Авторадиография 53
II,6. Статистическая обработка данных 53
III РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
III.1. Динамика изменения веса животных 54
III.2 Динамика изменения массы гонад 54
III.3. Цитогенетический анализ сперматогенеза
III.3.1. Морфология ядерных и хромосомных нарушений в развивающихся
сперматогенных клетках 56
III.3.2. Оценка частоты возникновения микроядерных аберраций в спермато-
гониальных клетках и округлых сперматидах 56
III.З.З. Оценка частоты встречаемости тестикулярных спермиев с морфоло
гически аномальными головками 60
III.4. Количественный анализ клеток спермато генно го эпителия 61
III.5. Цитоспектрофотометрический анализ содержания ДНК-фуксина в сперма-
тогенных клетках 66
III.6. Сравнительное изучение пролиферативной активности клеток Сертоли 67
III.7. Гистологический анализ структуры сперматогенного эпителия 69
IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 98
V. ВЫВОДЫ 108
VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110
- Сперматогенез у млекопитающих
- Метод учета сперматогониальных и мейотических микроядер (микроя дерный тест)
- Динамика изменения веса животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сперматогенез - высокопродуктивный, многофазный, имеющий строгую пространственно-временную организацию биологический процесс, регуляция которого очень сложно организована. Актуальность его всестороннего изучения очевидна. Кроме того, система развития мужских половых клеток представляет собой удобную модель для изучения разных проблем экспериментальной эмбриологии, клеточной биологии, генетики, биологии размножения.
Несмотря на то, что многие фундаментальные закономерности процессов становления, развития и дифференцировки сперматогенных клеток уже хорошо изучены на всех уровнях организации живого, исследовательская активность в области мужского гаметогенеза продолжает оставаться очень высокой. Это связано не только с чисто познавательным интересом к этой узловой проблеме биологии, но диктуется необходимостью решения постоянно расширяющегося круга актуальных практических задач, имеющих большое медико-биологическое и социальное значение. А именно - преодоление мужского бесплодия, изучение последствий действия повреждающих факторов окружающей среды, в том числе фактора времени, химеотерапии, а также усовершенствование методов искусственного оплодотворения, криоконсервации, трансплантации половых клеток, эффективного управления размножением сельскохозяйственных животных и вредных насекомых (Рузен-Ранге, 1980; МсСаггеу, 1998; Захидов, 1998; Hovatta, 2001; Khorram et al., 2001; Brinster, 2002; Hardy et al., 2002; Gosden, Nagano, 2002; Liu, Handelsman, 2003).
Ускоренно стареющие мыши SAM (senescence-accelerated mouse), проявляющие все признаки раннего физиологического угасания, бьши получены японскими исследователями (Takeda et al., 1981, 1994, 1997) путем близкородственного скрещивания и длительного отбора мышей линии AKR/J, страдающих наследственной формой вирусной лейкемии. В последние годы линии мутантных ускоренно стареющих мышей широко используются как модель для изучения механизмов, лежащих в основе нормального старения и его патологических форм, причин возникновения возрастных старческих болезней, а также для проверки эффективности средств, направленных на улучшение качества жизни и ее продление (Takeda et al., 1997; Захидов, 2003). Уникальной особенностью мышей линий SAM, выгодно отличающей их от других моделей ускоренного старения (Takeda et al., 1981; Troen, 2003; Warner, Sierra, 2003), является передача признака ускоренного старения по наследству.
Предыдущие комплексные исследования сперматогенеза у ускоренно
стареющих мышей SAM, в том числе мышей линии SAMP1 (senescence-accelerated mouse prone), создали надежную основу для развертывания широких экспериментальных исследований (Гордеева и др., 2001; Захидов и др., 1999, 2001, 2002; Гопко и др., 2003; Кулибин и др., 2005). Сперматогенная система мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению, имеет свои специфические особенности, основной среди которых является сочетание сравнительно нормального течения сперматогенного процесса с высоким уровнем генетической нестабильности, значительно превышающим интенсивность спонтанного, естественного мутагенеза у нормально стареющих животных (Захидов и др., 2001,2002, 2005).
До сих пор никто не анализировал перспективу развития мужских половых клеток у ускоренно стареющих мышей линии SAMP1 после мутагенного вмешательства. Между тем, важность таких исследований не вызывает сомнения, поскольку многое реальное в структуре строго детерминированного сперматогенного процесса остается закрытым для прямых наблюдений. Экспериментальный мутагенез позволяет глубоко проникнуть в сущность многих генетических и биологических явлений, индуцировать аномальное течение морфогенетических процессов и нарушение их регуляции. На этом фоне можно увидеть и познать закономерности, действующие только в условиях катастрофических изменений в строении и функционировании сложных биологических систем, неопределенности и нестабильности их развития.
Ранее было показано (Захидов, 1993; Захидов, Гордеева, 1998; Захидов и др., 1999), что в гонадах грызунов под влиянием генетически активных соединений разворачиваются два процесса - разрушительный, ведущий к появлению большого числа генетически аномальных клеток и массивной клеточной гибели, и созидательный, восстанавливающий нормальное течение сперматогенеза за счет пула стволовых сперматогониальных клеток; удалось впервые показать способность к пролиферации высокодифференцированных клеток Сертоли (Захидов и др., 1995), что принципиально меняет представления не только о свойствах данной клеточной популяции, но и о возможных путях восстановления сперматогенеза.
В этой связи исследования сперматогенеза у мышей SAMP1, развивающихся по механизму ускоренного старения, проводимые на базе химического мутагенеза, имеют огромную познавательную ценность. Они, в частности, дают возможность достичь результатов, отвечающих на принципиальный вопрос: будет ли после мутагенного воздействия динамически неустойчивая сперматогенная система «вдвойне мутантна» или и без того чрезвычайно высокий уровень генетической нестабильности преодолеть не удастся.
Цели и задачи работы. Цель настоящей работы - изучение динамики сперматогенеза у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению, подвергшихся однократному воздействию модельного мутагена дипина.
Цель исследования предусматривает решение следующих основных задач:
Изучение особенностей индуцированного мутагенеза в системе развития мужских половых клеток.
Количественная характеристика сперматогенных клеток различных типов и фолликулярных клеток Сертоли.
Изучение особенностей строения сперматогенного эпителия.
Цитоспектрофотометрический анализ содержания ДНК в мейотических и постмейотических клетках.
Изучение пролиферативной активности клеток Сертоли.
Научная новизна работы. Впервые с помощью системного подхода изучена динамика развития генетически нестабильной сперматогеннои системы у му тантных ускоренно стареющих мышей линии SAMP1 после мутагенного вмешательства.
Впервые показано, что у ускоренно стареющих мышей процессы хаотизации и распада сперматогеннои системы, происходящие под действием дипина в генетически активной дозе, не носят необратимого характера. Мужские половые клетки сохраняют способность развиваться в условиях нарастающей хромосомной нестабильности в стволовых сперматогониях.
Впервые показана способность к пролиферации клеток Сертоли у ускоренно стареющих мышей в ответ на повреждающее сперматогенез действие мутагена.
Впервые установлено, что одним из источников регенерации сперматогеннои системы в условиях индуцированного химического мутагенеза являются предшествен-ники стволовых сперматогониев и клеток Сертоли, расположенные в сети семенника (rete testis).
Практическая иенность работы. Материалы диссертации могут быть использованы в курсах лекций по эмбриологии, биологии размножения и геронтологии для студентов университетов и медицинских вузов, а также при составлении методических пособий к курсам лекций по гистологии тканей в норме и при патологии.
Результаты настоящей работы представляют интерес для врачей - андрологов и специалистов в области репродуктивных технологий.
Апробаиия работы. Материалы диссертации докладывались на Всероссийской научной конференции «Гистологическая наука в России в начале XXI века:
итоги, задачи, перспективы» (Москва, 2003), на Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (Москва, 2005), на конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты" (Москва, 2005), на семинарах кафедры эмбриологии МГУ и Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав обзора литературы, описания материала и методов исследования, пяти глав собственных результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 141 странице машинописного текста, содержит 24 рисунка, шесть таблиц. В списке цитированной литературы упомянуто 400 работ, из них 55 отечественных.
Сперматогенез у млекопитающих
Сперматогенез представляет собой сложный, многоступенчатый процесс дифференцировки стволовых сперматогониальных клеток (ССК) в высокоспециализирован ные, мобильные клетки - сперматозоиды, способные к автономному существованию и оплодотворению яйцеклетки.
Процесс развития мужских половых клеток обычно подразделяют на три основных стадии развития: первая - период активного размножения и дифференцировки половых клеток - спсрматогонисв; вторая стадия - стадия роста и созревания половых клеток или мейоз; третья стадия - спермиогенез - процесс формирования мужских половых клеток (Рузен-Ранге, 1980; Райцина 1982в, 1985г; Захидов, 1998; Schulze et al., 1992; de Rooij, 1998, 2001; de Rooij, Russell, 2000; Luetjens et al., 2005).
Сперматогенез имеет строгую пространственную и временную упорядоченность; у мышей продолжительность одного сперматогенного цикла составляет примерно 35 дн, а продолжительность отдельных его стадий - размножения, мейоза и спермиогенеза, составляет, соответственно, 7.4, 13.7 и 14.1 дн(рис. 1) (Meistrich, 1986а).
В рамках данного обзора рассмотрены основные особенности происхождения и дифференцировки мужских половых клеток у млекопитающих. Отдельное внимание уделено предшественникам половых клеток- стволовым сперматогониям, поддерживающим непрерывность сперматогенного процесса и бессмертие половых клеток. Рассмотрены также некоторые вопросы, касающиеся регуляпии сперматогенеза и его чувствительности к различным воздействиям
Метод учета сперматогониальных и мейотических микроядер (микроя дерный тест)
Микроядерные структуры - это окруженные ядерной мембраной хромосомные фрагменты или целые хромосомы, не включившиеся после клеточных делений-митотических или мейотических - в дочерние посттелофазные ядра. Они обычно располагаются дискретно в непосредственной близости от основного ядра, либо остаются тонко связанными с ним. В зависимости от своего происхождения микроядра могут иметь мелкие либо крупные размеры. Обрывки хромосом обычно возникают в результате нарушения связности хромосомной нити, в то время как микроядра на уровне отдельных целых хромосом могут возникать в результате нарушений аппарата деления (рис. 7). Образование крупных микроядер может происходить и в результате объединения в одно целое небольших микроблоков хромосомного материала.
Известно, что микроядериые структуры могут обладать сравнительно высоким уровнем устойчивости, способны сохранять на протяжении нескольких клеточных поколений свою целостность. Биохимические исследования показали возможность синтеза ДНК и РНК в микроядерных структурах, причем не было обнаружено их асинхронизации с репликацией ДНК в основном ядре (Miiller, Streffer, 1994).
Динамика изменения веса животных
Вес животных обоих групп в начале эксперимента (до введения дипина и ДМСО), в среднем составил 27.7 г (рис. 8). Как видно из рисунка различия в динамике изменения веса подопытных самцов по сравнению с контрольными были статистически недостоверными до 14 сут после введения дипина; затем вес подопытных животных снижался и на 21, 28 и 35 сут был значительно меньше, чем у контрольных животных. После 35 сут фиксации мыши подвергшиеся действию дипина начинали восстанавливать свой вес и к концу эксперимента (100 сут) весили больше, чем контрольные мыши. Отличия в весе мышей из опытной и контрольной групп были статистически достоверными на 21-35 и 100 сут.
