Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Эмбриональные стволовые клетки как связующее звено исследований проблем эмбриональной диффереицировки в системах in vitro и in vivo , 12
1.1.1. Общая характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения 12
1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки 14
1.1.3. Культивирование эмбриональных стволовых клеток 14
1.1.4. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток in vitro 15
1.1.5. Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток in vivo 16
1.2. Применение эмбриональных стволовых клеток 16
1.3. Гибридные клетки между стволовыми и дифференцированными клетками как модель для изучения процессов репрограммирования 17
1.4. Сегрегация хромосом в гибридных клетках 20
1.5. Использование микросателлитов в качестве генетических маркеров 25
1.6. Роль митохондрий в нормальном развитии, экспериментально реконструированных зиготах и гибридных клетках 27
1.6.1. Организация митохондрий млекопитающих 27
1.6.2. Сегрегация мтДНК у клонированных млекопитающих, полученных методом трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты 28
1.6.3. Сегрегация мтДНК при гетероплазмии 29
1.6.4. Сегрегация мтДНК в гибридных клетках 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Клетки и клеточные линии 35
2.2. Работа с культурами клеток 36
2.2.1. Пассирование клеток 36
2.2.2. Субклонироваиие 37
2.2.3. Замораживание клеток 37
2.2.4. Размораживание клеток 38
2.3. Выделение геномной ДНК 38
2.4. ПЦР-анализ микросателлитов 39
2.4.1. Условия ПЦР для амплификации микросателлитов 39
2.4.2. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР 39
2.5. Анализ мтДНК 40
2.5.1. ПЦР фрагментов мтДНК 40
2.5.2. Выделение амплифицированного фрагмента ДНК 42
2.5.3. Подготовка фрагмента мтДНК для секвенирования 43
2.5.4. Секвенирование мтДНК 43
2.6. Рестрикционный анализ мтДНК 43
2.7. ПЦР-анализ мтДНК единичных клеток 44
2.8. Цитогенетический анализ 45
2.8.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом 45
2.8.2, Подсчет хромосом 46
ГЛАВА 3. Результаты 47
3.1. Идентификация родительских хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит и ЭС-фибробласт с помощью полиморфных микросателлитов 47
3.1.1. Выбор микросателлитиых маркеров, дискриминирующих гомологичные хромосомы мышей линий 129/Ola, DD/c и мышей М. caroli 47
3.1.2. Оптимизация условий ПЦР для алельных вариантов микросателлитов у мышей линий 129/01anDD/c 50
3.1.3. Оптимизация условий ПЦР для анализа аллельных вариантов микросателлитов мышей М. musculus иМ. caroli 53
3.2. Сегрегация хромосом в клонах внутривидовых гибридных клеток 56
3.3. Сегрегация хромосом в клонах межвидовых гибридных клеток 64
3.4. Сегрегация митохондрий в клонах внутривидовых гибридных клеток 69
3.5. Сегрегация митохондрий в клонах межвидовых гибридных клеток 74
ГЛАВА 4. Обсуждение 77
Выводы 89
Список литературы
- Эмбриональные стволовые клетки как связующее звено исследований проблем эмбриональной диффереицировки в системах in vitro и in vivo
- Гибридные клетки между стволовыми и дифференцированными клетками как модель для изучения процессов репрограммирования
- Условия ПЦР для амплификации микросателлитов
- Идентификация родительских хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит и ЭС-фибробласт с помощью полиморфных микросателлитов
Введение к работе
Актуальность. Эмбриональные стволовые (ЭС) клетки обладают плюрипотентными и даже тотипотептными свойствами, которые сохраняются при длительном культивировании invitro (Hogan etal., 1994; Smith, 2001; Carpenter etal., 2003; Ginis etal., 2003; Hubner etal., 2003; Toyooka etal., 2003; Geijsen etal., 2004). При комбинировании ЭС клеток с эмбрионами ранних стадий развития, ЭС клетки способны участвовать в формировании химер, причем вклад ЭС клеток прослеживается во всех соматических тканях и в зародышевом пути (Robertson et al., 1986; Allan, 1987; Robertson, 1987; Joyner, 1993; Hogan et al., 1994).
В 1996 году впервые была предпринята попытка использовать ЭС клетки для репрограммирования генома дифференцированных клеток. С этой целью плюрипотентные ЭС клетки мыши были слиты со спленоцитами взрослого животного. Полученные в этом эксперименте клеточные гибриды обладали плюрипотентными свойствами, сопоставимыми с ЭС клетками (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al,, 1998). Позднее эти данные получили подтверждение при анализе гибридов, полученных от слияния ЭС клеток с тимоцитами (Tada etal., 2001; 2003) или незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза или нейрогенеза (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). В недавно опубликованных данных по анализу гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток человека с человеческими фибробластами, также отмечается высокий уровень плюрипотентности, сходный с родительскими ЭС клетками (Cowan et al., 2005). Высокий потенциал гибридных клеток типа ЭС-соматическая клетка подразумевает доминирование плюрипотентности — ключевого свойства ЭС клеток. В свою очередь, это предполагает репрограммирование генома соматического партнера. Свидетельства репрограммирования аллелей соматического партнера для целого ряда генов были найдены в гибридах, полученных от слияния ЭС клеток Mus musculus domesticus и тимоцитов М. musculus molossinus (Tada et al., 2001; 2003; Hatano et al., 2005). Прямые доказательства масштабного репрограммирования генома соматического партнера (фибробласта) и связанного с этим изменения профиля экспрессирующихся генов (свыше 99%) по типу ЭС клеток были получены с помощью микрочиповой технологии при анализе гибридов ЭС клеток человека с фибробластами (Cowan et al.,
2005). Сопоставление процессов репрограммирования в ядрах дифференцированных клеток после их переноса в энуклеированный ооцит или яйцо с таковыми в гибридных клетках типа ЭС-соматическая клетка показывает значительное сходство и, следовательно, гибридные клетки являются новым перспективным инструментом изучения фундаментальных проблем репрограммирования и восстановления проспективных потенций генома дифференцированных клеток.
Однако при этом следует особо отметить, что для изучения молекулярных механизмов как поддержания плюрипотентности в гибридном геноме, так и репрограммирования генома соматического партнера необходимо знать хромосомный состав гибридных клеток. Между тем, до недавнего времени исследованиям этой важной характеристики гибридных клеток типа ЭС-дифференцировапная клетка не уделялось должного внимания. В ряде работ по слиянию ЭС и дифференцированных клеток авторы не исследовали кариотип гибридных клеток на том основании, что клетки имели тетраплоидный набор хромосом, что, как полагают авторы, свидетельствует об отсутствии сегрегации хромосом. Так, Тада и соавторы (Tada etal., 2001) описали в клеточных гибридах, полученных от слияния ЭС клеток и тимоцитов, околотетраплоидный набор хромосом, по их мнению, сохранившийся от момента слияния двух диплоидных клеток. Тетраплоидный набор хромосом был обнаружен в гибридных клетках, полученных от спонтанного слияния ЭС клеток со стволовыми клетками костного мозга или недифференцированными клетками головного мозга эмбрионов (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002). Однако, согласно более поздним данным Тада и соавторов (Tada et al., 2003), только 62% гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток мыши с тимоцитами, сохраняли тетраплоидный набор хромосом. Более того, интенсивная сегрегация хромосом была отмечена в гибридных клетках, полученных от слияния ЭС клеток и сплепоцитов, в результате чего кариотипы некоторых клонов гибридных клеток содержали околодиплоидный набор хромосом (Matveeva etal., 1998; Матвеева и др., 2001). Сходные данные были получены при исследовании количества хромосом в гибридных клетках, образовавшихся от спонтанного слияния in vivo незрелых клеток-предшественников гемопоэза с клетками печени (Wang et al., 2003).
Следует заметить, что применение цитогенетических методов для идентификации родительских хромосом внутривидовых и межвидовых гибридных клеток (полученных слиянием клеток от близких видов) затруднено или невозможно из-за морфологического сходства гомологичных хромосом. Между тем, дискриминация родительских хромосом возможна с использованием альтернативных методов, например, с помощью микросателлитов в качестве маркеров хромосом. Микросателлиты высокополиморфны у лабораторных линий мышей и равномерно распределены в геноме мыши (Dietrich etal., 1992; 1996), В 1998 году появилась одна из первых работ, в которой микросателлиты использовали для маркирования родительских хромосом у внутривидовых гибридных клеток (Hines etal., 1998). Авторы использовали набор микросателлитов, дискриминирующих все гомологичные хромосомы, представленные в геноме гибридных клеток от разных линий мышей. Анализ микросателлитов позволил выявить направленность сегрегации в зависимости от фенотипа гибридов.
При образовании гибридных клеток происходит объединение не только ядерных геномов, но и цитоплазмы родительских клеток. Как отмечалось выше, имеются противоречивые и неполные данные о судьбе родительских хромосом в геноме гибридной клетки. В то же время, сведения об организации гибридной цитоплазмы практически полностью отсутствуют. Учитывая способность митохондриальной ДНК (мтДНК) к репликации, представляется актуальным изучение взаимоотношений родительских митохондриальных геномов в гибридной цитоплазме, что может пролить свет на ее организацию. Следует также отметить, что, согласно некоторым данным, существует взаимосвязь между сегрегацией хромосом и митохондрий. Так, в гибридных клетках от слияния между клетками человека и мыши происходит сегрегация митохондрий того партнера, чьи хромосомы теряются (Francesco etal., 1980). Гибридные клетки от слияния клеток мыши и китайского хомячка, а также мыши и крысы, сохраняли как хромосомы, так и митохондрии обоих партнеров (Hayashi et aL, 1982; Zuckerman et al., 1984). В настоящее время отсутствуют данные о судьбе родительских митохондрий как во внутривидовых, так и межвидовых гибридных клетках, полученных от слияния диплоидных ЭС клеток с диплоидными дифференцированными клетками.
В свете выше изложенного, не вызывает сомнений актуальность изучения судьбы родительских хромосом в геноме гибридных клеток типа ЭС-дифференцированная клетка, полученных от слияния диплоидных клеток разных линий мышей или близких видов, с использованием микросателлитов, позволяющих дискриминировать родительские гомологи. Представляется не менее актуальным изучение поведения родительских митохондрий в цитоплазме гибридных клеток для установления причинно-следственных связей между формированием генома гибридной клетки и ее цитоплазмы. Знание о реальном соотношении родительских хромосом в ядерном геноме и о взаимоотношениях родительских митохондриальных геномов в цитоплазме необходимо при исследовании как плюрипотентности генома гибридных клеток, так и для понимания механизмов репрограммирования генома дифференцированных клеток.
Цели и задачи исследования
При выполнении работы преследовали две цели: 1) описать с помощью микросателлитов поведение родительских хромосом в гибридных клетках, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus линии 129/01а со спленоцитами или эмбриональными фибробластами мышей линии DD/c, и в наборе клонов межвидовых гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток М. musculus со спленоцитами М. caroli; 2) исследовать судьбу родительских митохондрий в цитоплазме внутри- и межвидовых гибридных клеток, используя анализ полиморфных районов родительских мтДНК.
Для достижения этих целей были поставлены следующие экспериментальные задачи:
1. Провести поиск полиморфных микросателлитов, способных дискриминировать каждую пару родительских хромосом у мышей линий 129/01а и DD/c (доноры ЭС клеток, спленоцитов и эмбриональных фибробластов) и у мышей линии 129/01а М, musculus и азиатской мыши М. caroli (доноры ЭС клеток и спленоцитов, соответственно). Оптимизировать условия полимеразной цепной реакции (ПЦР) для анализа аллельных вариантов микросателлитов и оценить чувствительность метода путем анализа искусственной смеси геномной ДНК мышей М musculus линии 129/01аиМ caroli.
2. Провести анализ микросателлитов, маркирующих каждую пару родительских хромосом, в 3-х клонах серии HESS, полученных от слияния ЭС клеток мышей 129/Ola и спленоцитов взрослой мыши DD/c, и в 5-ти клонах серии HESF, полученных от слияния ЭС клеток и эмбриональных фибробластов мышей DD/c, с целью описания их хромосомного состава.
Провести анализ микросателлитов, маркирующих каждую пару родительских хромосом, в 20-ти клонах серии НМС, полученных от слияния ЭС клеток М. musculus и спленоцитов азиатской мыши М. caroli, с целью описания их хромосомного состава.
Провести секвенирование D-петли, генов третьей субъединицы цитохромоксидазы, третьей и шестой субъединиц НАД-Н дегидрогеназы мтДНК у мышей линий 129/01а и DD/c с целью выявления нуклеотидных замещений, позволяющих дискриминировать их мтДНК.
5. Исследовать родительское происхождение мтДНК в 3-х клонах серии HESS, 5-ти клонах серии HESF и в 20-ти клонах серии НМС. Провести анализ мтДНК индивидуальных клеток в некоторых гибридных клонах для оценки межклоналыгой вариабельности.
Научная новизна и практическая значимость
В работе впервые подробно детализированы условия применения полиморфных микросателлитов в качестве маркеров родительских хромосом в меж- и внутривидовых гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных ЭС клеток со спленоцитами и эмбриональными фибробластами. Предлагаемый подход имеет хорошую воспроизводимость, менее трудоемок, чем цитогенетический анализ, и позволяет провести быструю оценку хромосомного состава гибридных клеток.
С помощью анализа микросателлитов впервые выявлено сохранение всех хромосом плюрипотентного и практически всех соматического партнера, за исключением хромосомы 14, во внутривидовых гибридных клетках ' мыши, полученных слиянием ЭС клеток с фибробластами, в противоположность выраженной потере соматических хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит. Важно подчеркнуть, что выявление такой сегрегации хромосом у внутривидовых гибридных клеток с помощью традиционных цитогенетических методов возможно лишь для единичных хромосом.
3. С помощью анализа мтДНК впервые показана предпочтительная сегрегация митохондрий соматического партнера в гибридных клетках, полученных слиянием
ЭС клеток со спленоцитами другой линии мышей и спленоцитами близкого вида, М. caroli.
Описанную сегрегацию родительских хромосом и митохондрий соматического партнера следует учитывать при оценке плюрипотентности гибридных клеток и в экспериментах, связанных с изучением механизмов репрограммирования.
Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).
Апробация работы и публикации.
Результаты работы были представлены на международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2002), на интеграционной междисциплинарной конференции молодых ученых СО РАН и высшей школы (Иркутск, 2003), на международной научной конференции молодых ученых и студентов (Алматы, 2003), на 1-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003), на международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004), на 3-ем съезде ВОГиС (Москва, 2004), на школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» (Москва, 2005), на VI международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Москва, 2005).
Материалы диссертации изложены в 2-х статьях, опубликованных в отечественном и международном журналах.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 103-х страницах, иллюстрирована 11-ю рисунками и содержит 13 таблиц.
Эмбриональные стволовые клетки как связующее звено исследований проблем эмбриональной диффереицировки в системах in vitro и in vivo
Первые культуры in vitro эмбриональных клеток были получены из тератокарциномной опухоли (Jacob et al., 1973). Такие клетки были названы эмбриональными карциномными (ЭК) клетками. Опухоли типа тератокарцином с большой частотой спонтанно возникают у мышей линии 129 из незрелых клеток яичников или семенников. Их также можно получить путем эктопической трансплантации бластоцист, эмбрионов на стадии яйцевого цилиндра или клеток полового валика под капсулу семенника (Stevens, 1967; 1975). ЭК клетки способны к неограниченной пролиферации в условиях in vitro, сохраняя при этом проспективные потенции и способность к спонтанной или индуцированной дифференцировке в различные типы клеток. Следует заметить, что различные линии ЭК клеток сильно отличаются по проспективным потенциям и, следовательно, по способности к дифференцировке как in vitro, так и in vivo (Rossant, Papaioannou, 1984). ,
Длительное культивирование ЭК клеток в суспензионной культуре или в моиослое может приводить к их спонтанной дифференцировке. Более того, добавлением в культуральную среду некоторых агентов, таких как ретиноевая кислота и диметилсульфоксид, можно индуцировать дифференцировку ЭК клеток. Разные линии ЭК клеток дают различные спектры дифференцированных клеток, одни способны давать начало разнообразным типам клеток, тогда как дифференцировка других ограничена образованием небольшого числа специализированных клеток (Rudnicki, McBurney, 1987). Подкожное введение большинства линий ЭК клеток иммунодефицитным или сингенным животным приводит к развитию опухолей, содержащих производные трех зародышевых листков, хотя введение некоторых линий ЭК клеток дает начало саркомам, представленным клетками одного типа. Неоднократно предпринимались попытки получения химерных животных путем инъекции ЭК клеток в полость бластоцисты, но лишь единичные опыты были успешными (Stewart, 1982). В большинстве случаев эти эксперименты заканчивались неудачно, возможно из-за апеуплоидии ЭК клеток и наличия хромосомных перестроек (Robertson, 1987).
Принципиально другим типом эмбриональных клеток являются эмбриональные стволовые (ЭС) клетки. Культуры ЭС клеток были впервые получены из клеток внутренней клеточной массы (ВКМ) в 1981 г. независимо двумя группами исследователей (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981). В первом случае с помощью гормонов была задержана имплантация бластоцисти, для того, чтобы увеличить количество клеток ВКМ. Затем «задержанные» бластоцисты помещали в условия in vitro и выделенные из ВКМ клетки культивировали на фидере, клетках первичных эмбриональных фибробластов. Полученные культуры ЭС клеток активно пролиферировали и, в отличие от соматических клеток, сохраняли высокий пролиферативный потенциал при культивировании в течение многих месяцев. В эксперименте Мартин (Martin, 1981), клетки ВКМ выделяли с помощью иммунохирургического метода из зрелых бластоцист, а выделенные клетки помещали в кондиционированную ЭК клетками среду. Полученные культуры ЭС клеток также сохраняли многие свойства, присущие клеткам ВКМ. Следует отметить, что культуры ЭС клеток относительно легко можно получить из мышей линии 129, тогда как другие линии мыши дают низкий выход ЭС клеток (например, мыши линии DBA/llacJ) (Roach et al., 1995).
Позднее были получены культуры клеток из зачатка первичных половых клеток полового валика. Эти клетки, способные к длительному культивированию in vitro, были названы эмбриональными герминалъными (ЭГ) клетками (Matsui et al., 1992; Resnick etal., 1992; Donovan, 1994). ЭГ клетки, выделенные в культуру, способны эффективно колонизовать ВКМ после их введения в полость бластоцисты и способны генерировать развитие химерных эмбрионов, включая и их гаметы (Labosky etal, 1994).
Все три типа стволовых клеток эмбрионального происхождения характеризуются малыми размерами, большим ядерно-цитоплазматическим соотношением, на фидерном слое формируют островки, состоящие из плотно прилежащих друг к другу клеток. В настоящее время ЭС клетки широко используются для изучения фундаментальных свойств эмбрионального генома, таких как тотипотентность и плюрипотентность, и как инструмент для изучения раннего развития млекопитающих. В связи с вышесказанным, имеет смысл более подробно рассмотреть свойства и характеристики ЭС клеток.
Основное качество ЭС клеток, отличающее их от соматических клеток, это их высокие плюрипотентные свойства. Как отмечено выше, ЭС клетки имеют характерные морфологические признаки. Однако для идентификации ЭС клеток требуется использование специфических молекулярных или белковых маркеров, особенно в смеси ЭС и разного рода соматических клеток.
Одним из надежных маркеров ЭС клеток является высокая активность щелочной фосфатазы (Wobus et al., 1984). Ряд поверхностных антигенов, свойственных клеткам ВКМ мыши, сохраняется в ЭС клетках при их культивировании in vitro. Наиболее часто используют иммуногистохимические методы выявления поверхностных гликопротеидов, таких как ЕСМА-7 или эмбриогликан SSEA-1 (Solter, Knowles, 1978). Для идентификации ЭС клеток используют также иммуногистохимическое выявление эмбриональных антигенов, таких как SSEA-3 и SSEA-4. Поскольку в культурах ЭС клеток нередко присутствуют производных их дифференцировки, эффективно используют так называемые негативные маркеры, то есть маркеры дифференцирующихся клеток, отсутствующие в ЭС клетках, такие как цитокератин 8, фибронектин, ламинин A (Mummery et al., 1990; Ginis etal., 2003). В последние годы для идентификации ЭС клеток чаще используют так называемые молекулярные маркеры плюрипотентиости, такие как гены Oct4 (Scholer, 1991) и Nanog (Chambers etal., 2003). Гены Oct4 и Nanog в нормальном развитии экс премируются в клетках ВКМ, но не в экстраэмбриональных тканях. Более того, экспрессия обоих генов прекращается после начала имплантации эмбриона и сохраняется только в первичных половых клетках зародышевого пути.
Гибридные клетки между стволовыми и дифференцированными клетками как модель для изучения процессов репрограммирования
Использование ЭС клеток позволило разработать уникальную технологию адресного изменения структуры гена-мишени в геноме млекопитающих, в том числе мыши. Технология получила название «ген-мишень» (geneargeting) или «выбивание гена» (knock out). Технология состоит из нескольких этапов: 1) в условиях культивирования in vitro в геном ЭС клеток вводится конструкция, состоящая из комплементарной последовательности к гену-мишени (не менее 2000 п.н.) и селективного маркера, чаще резистентности к неомицину. Трансформация ЭС клеток осуществляется с помощью электропорации. При попадании векторной ДИК в ядро, с редкой частотой происходит случайное встраивание конструкции в хромосомы ЭС клеток или, путем гомологичной рекомбинации, адресное встраивание в ген-мишень, благодаря образованию дуплекса между экзогенной векторной ДНК и комлементарной последовательностью гена-мишени. Трансформированные ЭС клетки приобретают способность расти в среде, содержащей G418 (гентицин), благодаря селективному маркеру резистентности к неомицину. Позитивные ЭС клетки тестируются с помощью ПЦР участков ДНК в пределах конструкции (вектора) и за пределами гена-мишени с целью идентификации клонов клеток, в которых произошла адресная встройка вектора. Такие клетки вводятся в полость бластоцисты для получения химерных мышей. Химерных мышей скрещивают с нормальными и в потомстве по генам окраски идентифицируют животных, имеющих генотип введенных трансформированных ЭС клеток. Таким образом, получают животных с мутацией в гене-мишени (knock out), поскольку векторная встройка нарушает нормальную структуру гена-мишени (Joyner, 1993). За последнее десятилетие получены сотни нокаутных линий мышей, позволяющих изучать эффекты мутаций любых генов, функции которых представляют интерес для исследователей.
Другая технология применяется для поиска и идентификации неизвестных генов, принимающих участие в раннем и позднем развитии. С этой целью ЭС клетки трансформируются конструкциями, включающими репортериый ген (чаще всего геи р-галактозидазы Escherichia colt) под контролем минимального конститутивного промотора. Экспрессия репортериого гена (появление окрашенных клеток) наблюдается только когда интеграция конструкции происходит в сайте, близко расположенном от энхансера (enhancerrap strategy). Затем проводится анализ структуры места встройки гена в ЭС клетках и экспрессии репортериого гена при дифференцировке клеток in vitro или in vivo в развитии химерных эмбрионов (Robertson et al., 1986; Gossler et al., 1989).
В 1996 г. были опубликованы первые эксперименты по использованию высоких проспективных способностей ЭС клеток для репрограммирования генома соматических клеток. С этой целью была применена клеточная гибридизация, слияние ЭС клеток со спленоцитами взрослого животного (Матвеева и др., 1996). Такие гибридные клетки имели сходные с ЭС клетками морфологию и ростовые характеристики и были позитивными по эмбриональному антигену ЕСМА-7, свойственному клеткам ВКМ на ранних стадиях развития. Позднее было показано, что гибридные клетки типа ЭС-спленоцит обладают плюрипотентными свойствами, включая способность участвовать в формировании химер (Matveeva et al., 1998).
Таким образом, было установлено, что гибридные клетки имеют сходный с родительскими ЭС клетками уровень плюрипотентности. Эти данные получили подтверждение при исследовании гибридных клеток, полученных слиянием ЭС клеток с тимоцитами (Tada et al., 2001; 2003). Высокий потенциал также имели гибридные клетки от спонтанного слияния in vitro между ЭС клетками и незрелыми эмбриональными нейральными клетками (Ying et al., 2002) или незрелыми клетками-предшественниками гемопоэза (Terada et al., 2002). Сохранение гибридными клетками плюрипотентности иа высоком уровне подразумевает, что соматический геном претерпевает процессы репрограммирования. Действительно, в исследованиях группы Тада (Tada et al., 2003; Hatano etal., 2005) была показана реактивация некоторых генов соматического генома в гибридных клетках типа ЭС-тимоцит. Таким образом, стало очевидным, что гибридные клетки, полученные слиянием ЭС и дифференцированных клеток, становятся новой экспериментальной моделью репрограммирования (Серов и др., 2003; Ambrosi, Rasmussen, 2005). При описании гибридных клеток типа ЭС-соматическая клетка мы будем использовать термин эмбриональные гибридные клетки, для того, чтобы отличать их от гибридных клеток, получаемых слиянием между соматическими клетками.
Следует упомянуть, что ранее проводились эксперименты по гибридизации ЭК клеток с соматическими клетками с целью репрограммирования генома последних. Эти исследования показали принципиальную возможность использования ЭК клеток для репрограммирования генома соматических клеток. В таблице 1 приведены данные по морфологической характеристике гибридных клеток типа ЭК-соматическая клетка. Видно, что в большинстве случаев гибриды имели морфологическое сходство с ЭК клетками. Репрограммирование генома было наиболее ярко показано на гибридных клетах типа ЭК-тимоцит, в которых наблюдали реактивацию ранее неактивной Х-хромосомы (Takagi, 1997).
Условия ПЦР для амплификации микросателлитов
При анализе микросателлитов с помощью ПЦР мы взяли за основу метод, описанный Дитрихом с соавторами, внеся некоторые модификации (Dietrich et al., 1992). Реакционная смесь для ПЦР в объеме 25 мкл содержала: ПЦР буфер (65 мМ Tris-HCl, рН 8,8, 16 мМ (NH4)2S04 и 0,01% Tween 20), 1,5-3,5 мМ MgCl2 (концентрацию ионов магния подбирали индивидуально для каждой пары праймеров, данные представлены в таблицах 5 и 6), 0,2 мМ каждого дезокешгуклеозидтрифосфата (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), по 1 мкМ прямого и обратного праймеров. В реакционную смесь добавляли 0,5 ед Taq ДНК полимеразы (Invitrogen) и 50-500 нг тестируемой геномной ДНК, Условия ПЦР были следующие: денатурация ДНК при 95С в течение 3 мин, с последующей амплификацией (30-40 циклов), денатурация при 95С - 15 сек, отжиг праймеров при температуре 51-60С -15 сек, элонгация при 72С - 20 сек (температуру отжига подбирали индивидуально для каждой пары праймеров, данные представлены в таблицах 5 и 6). После циклической амплификации следовала элонгация при 72С в течение 3 мин. ПЦР проводили в пробирках объемом 0,5 мл на автоматическом амплификаторе РТС-100 (MJ Research Inc.).
Разделение продуктов ПЦР размером от 90 до 250 п.н. проводили с помощью электрофореза в 3-4% агарозном геле (Invitrogen). В качестве электрофоретического и гелевого буфера использовали ТВЕ (0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 0, M EDTA-Na2). В гелевый буфер добавляли ОД мкг/мл бромистого этидия для окраски ДНК.
Для разделения ПЦР-продуктов, различающихся по длине менее чем на 4 п.н., использовали 10% денатурирующий полиакриламидный гель, содержащий 6,5 мл 10% акриламида (акриламид (Sigma) и бисакриламид (Sigma) в соотношении 20:1), 2,6 мл десятикратного ТВЕ, 16,9 мл 11 М мочевины, 214 мкл 10% ТЕМЭД (N,N,N ,N eTpaMeTM этилендиамип, Serva) и 212 мкл 10% ПСА (персульфат аммония, Sigma). При нанесении на гель к образцам добавляли краситель ксилен-цианол в глицерине (глицерин и вода в соотношении 1:2). Полиакриламидный гель после проведения электрофореза инкубировали в растворе 0,1 мкг/мл бромистого этидия для окрашивания ДНК. Гель просматривали в ультрафиолетовом свете и фотографировали на видеоустановке Biodoc 2. Присутствие или отсутствие аллельных вариантов микросателлитов в гибридных клонах определяли путем сравнения их электрофор етической подвижности с микросателлитами родительских линий или видов мышей.
Для реакции использовали стандартные наборы реактивов (Life Technology). Реакционная смесь ПЦР объемом 25 мкл содержала ПЦР буфер (20 mM Tris-HCl рН 8,4; 50 mM KCI), 2,0-3,0 мМ MgC (концентрация ионов магния для пар праймеров приведена в таблице 3), 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ), 1 мкМ прямого и обратного праймеров. В реакционную смесь добавляли 0,5 ед Tag ДНК полимеразы и 50-500 иг ДНК тестируемых видов или линий мышей. Условия ПЦР включали исходную денатурацию геномной ДНК при 95СС в течение 3 мин, с последующей амплификацией (30 циклов), денатурацию при 95С - 30 сек, отжиг праймеров при температуре 52-60С - 30 сек, элонгацию при 72С - 60 сек (температура отжига праймеров указана в таблице 3). После циклической амплификации следовала элонгация при 72С в течение 3 мин. ПЦР проводили на автоматическом амплификаторе РТС-100 (MJ Research Inc.).
Для секвенирования последовательности D-петли мтДНК мыши использовали последовательности праймеров (3, 4, 9В, L15320) согласно Прагеру с соавторами
(Prager et al., 1998). Последовательности праймеров для секвенировапия других районов мтДНК были подобраны с использованием программы Primer Premier 5.0. Названия и последовательность использованных праймеров приведены в таблице 2. Условия амплификации для пар праймеров приведены в таблице 3.
После проведения ПЦР реакционную смесь переносили в 1,5-миллилитровую пробирку и для осаждения ДНК добавляли 7,5 М ацетата аммония до конечной концентрации 2,5 М и два объема 95% этанола. Затем пробирки оставляли при 4С на 30 мин, после чего центрифугировали при 14000 об/мин в течение 25 мин при комнатной температуре. Супернатант удаляли, а осадок дважды промывали 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 20 мкл воды. Очищенные ПЦР-продукгы непосредственно использовали в реакции ПЦР для введения метки в последующем секвенировании (подробнее в разделе 2.5.3.) или дополнительно очищали путем выделения из геля.
Выделение интересующих фрагментов ДНК из геля проводили с помощью Concert Gel Extraction Systems (Life Technology). Фрагменты ДНК выделяли из 1,5% агарозного геля, приготовленного на буфере ТВЕ с добавлением 0,1 мкг/мл бромистого этидия, при нанесении на гель к 20 мкл образца добавляли краситель ксилен-циаиол. Гель просматривали в ультрафиолетовом свете и вырезали фрагмент с нужным ПЦР продуктом. Фрагмент геля взвешивали, помещали в 1,5 мл пробирку, добавляли по 30 мкл буфера для растворения геля (L1) на 10 мг геля. Пробирку помещали в термостат на 56С до растворения агарозного геля. Для связывания ДНК добавляли 1 мкл кремниевого носителя на 10 мг геля, раствор перемешивали. После инкубации в течение 15 мин при 56С осадок центрифугировали (30 сек 14000 об/мин при комнатной температуре на микроцентрифуге Eppendorf 5415С), а супернатант удаляли. Затем к осадку добавляли 30 мкл буфера (L1) для растворения остатков агарозного геля и дальнейшего их удаления. Вновь образованный осадок центрифугировали (30 сек 14000 об/мин), а супернатант удаляли. К осадку добавляли промывочный буфер (L2) из расчета 30 мкл на 10 мг геля, суспендировали и осаждали центрифугированием (30 сек 14000 об/мин). Супернатант убирали и повторяли промывку буфером L2. Осадок подсушивали на воздухе и добавляли 20 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1, 1 мМ EDTA-Na2, рН 8,0) для элюирования ДНК с кремниевого носителя. После суспендирования смесь инкубировали в течение 5 мин при 56С, а затем осаждали кремниевый носитель (30 сек 14000 об/мин). Полученный супернатант, содержащий очищенный фрагмент ДНК, переносили в новую пробирку.
Секвенирование интересующего фрагмента мтДНК проводили с использованием тех же праймеров, что и при ПЦР этого фрагмента. Реакционная смесь объемом 10,3 мкл содержала 30-100 нг ПЦР фрагмента мтДНК, 3,2 пкмоль прямого или обратного праймера, 4 мкл BigDye Terminator Ready Reaction Kit 3.0 фирмы Pelkin Elmer. Реакцию проводили в пробирке Eppendorf объемом 0,5 мл. Условия ПЦР включали 25 циклов амплификации: денатурацию при 96С - 30 сек, отжиг праймеров на матрице при температуре 50-60С — 15 сек и элонгацию при 60С -4 мин.
После амплификации продукты ПЦР переосаждали для очистки от невключившихся меченых дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Для переосаждения к реакционной смеси добавляли равный объем бидистиллированной воды, перемешивали и кратковременно центрифугировали. Смесь переносили в пробирку объемом 1,5 мл и добавляли 100% изопропанол до конечной концентрации 60%. Затем смесь перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 25 мин. ДНК осаждали центрифугированием в течение 25 мин 14000 об/мин при комнатной температуре на микроцентрифуге Eppendorf 5415 С. Супернатант аккуратно отбирали, осадок промывали 250-300 мкл 70% этанола и повторно центрифугировали в течение 10 мин при 14000 об/мин. Супернатант отбирали, а осадок подсушивали при комнатной температуре.
Идентификация родительских хромосом в гибридных клетках типа ЭС-спленоцит и ЭС-фибробласт с помощью полиморфных микросателлитов
Выбор микросателлитных маркеров, дискриминирующих гомологичные хромосомы мышей линий 129/Ola, DD/c и мышей М. caroli Подбор праймеров к микросателлитам для маркирования гомологичных хромосом в геноме гибридных клонов осуществляли с использованием базы данных Джексоновской лаборатории (Jackson Laboratory, http://www.informatics.jax.org). В базе данных находится информация по генетике и биологии мышей, включая описание полиморфизма по микросателлитам. На сегодняшний день эта база содержит информацию о более чем 6000 микросателлитных маркеров, равномерно распределенных на генетической карте мыши. Название каждого маркера содержит информацию о номере хромосомы, на которой локализован маркер, и о порядковом номере маркера в пределах хромосомы. Например, DlMit200 - означает: D - от английского слова "DNA", 1 - обозначает хромосому, на которой локализован маркер, Mit - сокращение от первых букв Massachusetts Institute of Technology, института, в котором проведено описание маркера, 200 - обозначает индивидуальный номер микросателлита. Для наиболее распространенных лабораторных линий мышей приведена информация о размере микросателлитов. Как отмечалось выше, предлагаемое исследование проводилось на гибридных клетках, полученных слиянием клеток, донорами которых были мыши линий 129/Ola, DD/c и М. caroli. К сожалению, в базе данных отсутствует информация о размерах и полиморфизме микросателлитов мышей линии DD/c М, musculus и близкого вида азиатской мыши М. caroli. Что касается мышей линии 129/01а, то имеются ограниченные сведения о полиморфизме микросателлитов в этой линии. В связи с этим, подбор праймеров для анализа микросателлитов с помощью ПЦР осуществляли, исходя из предположения, что шансы найти полиморфизм между интересующими нас линиями больше в том случае, когда имеются наибольшие различия в размере микросателлитов между исследованными линиями мышей. Всего нами было отобрано 86 пар праймеров для амплификации микросателлитов, маркирующих 19 аутосом и Х-хромосому мыши.
В таблице 4 представлены результаты анализа 86-ти микросателлитов мышей линий 129/OIa, DD/c и М. caroli. Как следует из данных этой таблицы, 29 микросателлитов позволяют различить гомологи 18-ти аутосом мышей линий 129/Ola и DD/c при их электрофорезе в агарозиом геле. Важно заметить, что различия в размерах линейно-специфичных микросателлитов выявляются в агарозном геле, что упрощает их анализ. Мы не нашли среди тестированных микросателлитов такие, которые бы надежно дискриминировали гомологи хромосом 11 и X между мышами линий 129/01а и DD/c из-за сходства электрофоретической подвижности аллельных продуктов ГЩР микросателлитов при анализе этих маркеров в 3-4% агарозном геле. Для выявления различий между микросателлитами гомологов хромосом 11 и X мышей линий 129/OIa и DD/c мы использовали электрофорез продуктов ПЦР в денатурирующем полиакриламидном геле. Следует отметить, что праймеры к микросателлитам D17Mit3, D17Mit 135 и D18Mit232 обеспечивали синтез ПЦР продукта только в линии 129/OIa, но не DD/c (таблица 4).
Из данных таблицы 4 можно также видеть, что 18 (21%) микросателлитов, из 86-ти исследованных, не выявляются в образцах ДНК М. caroli. Это показывает, что последовательности мышей М. caroli, гомологичные праймерам, существенно отличаются от таковых у мышей М. musculus. Тем не менее, нам удалось выбрать набор из 41-го микросателлита, позволяющий дискриминировать гомеологи всех хромосом М. musculus и М. caroli, за исключением Y-хромосомы (таблица 4). Более того, были найдены маркеры, дискриминирующие гомеологичные хромосомы не только М. musculus и М. caroli, но, одновременно, и мышей линий 129/OIa и DD/c. Таким образом, в результате поиска среди 86-ти микросателлитов были отобраны маркеры, позволяющие различать гомеологи всех хромосом как М. musculus и М. caroli, так и мышей линий 129/OIa и DD/c и, следовательно, пригодные для идентификации родительских хромосом в гибридных клетках, полученных слиянием клеток с генотипами 129/01а и DD/c или 129/01а и М. caroli.
Праймеры для микросателлитов, опубликованные в базе данных Джексоновской лаборатории (Jackson Laboratory, http://www.informatics.jax.org), были разработаны с перспективой автоматизации процесса анализа гибридов, полученных от скрещивания разных линий мышей. Для того чтобы обеспечить удобство применения праймеров, их последовательности выбирали так, чтобы получать продукты ПЦР при «стандартных» для большинства маркеров условиях ПЦР, Однако гомологичные праймерам последовательности ДНК, фланкирующие микросателлиты,
могут различаться у разных линий и, тем более, видов мышей, что может быть причиной отсутствия продукта ПЦР в «стандартных» условиях (Dietrich etal., 1992). Результаты, представленные в таблице 4, согласуются с этими данными.
При анализе клеточных гибридов с помощью молекулярных маркеров следует иметь в виду еще один аспект. Как описано в разделе «Обзор литературы», в гибридных клетках наблюдается сегрегация хромосом одного из партнеров по слиянию (Рингерц, Сэвидж, 1979). Таким образом, индивидуальные хромосомы в гибридных клонах могут присутствовать не во всех клетках, а только в какой-то их части, причем в разных клонах соотношение клеток, содержащих ту или иную хромосому, может значительно варьировать. Из этого следует, что микросателлиты, маркирующие такие родительские хромосомы, будут представлены в различном количественном соотношении, то есть разным числом копий, в разных клонах.
Сегрегация хромосом и различная эффективность амплификации микросателлитов разного родительского происхождения создают реальную проблему при использовании микросателлитов для маркировки родительских хромосом в гибридном геноме. В связи с этим возникла необходимость в адаптации метода ПЦР микросателлитов для их использования в качестве маркеров родительских хромосом в геноме гибридных клеток. С этой целью, для каждого маркера были индивидуально подобраны условия ПЦР - температура отжига праймеров и концентрация MgCl2. Целью оптимизации было нахождение таких условий ПЦР, при которых синтез (амплификация) обоих аллелыгых вариантов микро сателлитов осуществлялся бы с равной или близкой к этому эффективностью и в достаточном количестве.
Для оптимизации условий проводили ПЦР смеси ДНК исходных линий мышей 129/01а и DD/c в соотношении 1:1. Условия ПЦР включали исходную денатурацию геномной ДНК при 95С в течение 3 мин, с последующей амплификацией (30 циклов), денатурацию при 95С - 15 сек, отжиг праймеров при температурах 52С, 55С и 58С - 15 сек, элонгацию при 72СС - 20 сек. По окончании процесса циклической амплификации следовала трехминутная заключительная элонгация. Для каждого маркера варьировали температуру отжига праймеров и концентрацию MgC . На первом этапе проводили реакции ПЦР с тремя температурами отжига праймеров и концентрациями MgCl2 1,5 мМ, 2,5 мМ и 3,5 мМ. На втором этапе для выбранной температуры отжига уточняли концентрацию MgC с шагом в 0,3-0,5 мМ. Были выбраны условия амплификации, при которых наблюдали равное или близкое к этому количество аллельных продуктов амплификации при достаточном количестве продуктов ПЦР
Похожие диссертации на Сегрегация хромосом и митохондрий во внутри- и межвидовых эмбриональных гибридных клетках мыши
