Содержание к диссертации
Введение
Часть I. Обзор литературы 12
Глава I. Сестринские хроматидные обмены 12
1.1. Существуют ли спонтанные сестринские хроматидные обмены? 13
1.2. Роль бромдезоксиуридина в образовании сестринских хроматидных обменов 14
1.3. Первичные повреждения ДНК, индуцирующие сест-ринские хроматидные обмены 16
1.4. Репликация и образование сестринских хроматидных обменов 2.1
1.5. Участие репарационных процессов в образовании сестринских хроматидных обменов 24
1.6. Модификаторы процесса образования сестринских хроматидных обменов 28
1.7. Модели механизмов образования сестринских хроматидных обменов 30
Глава 2. Псоралени как ДЖ-повреждающие агенты 35
2.1. Свойства псораленов, не активированных УФ-излучением 35
2.2. Фотохимическая реакция псораленов с ДНК 41
2.3. Биологическое действие активированного светом псоралена 4?
2.4. Мутационное действие псораленов 54
Часть II. Собственные исследования 54
Глава 3. Материалы и методы 54
3.1. Объекты исследования 54
3.2. Фиксация и приготовление препаратов ^5
3.3. Дифференциальное окрашивание хромосом 55
3.4. Анализ распределения сестринских хроматидных обменов по длине хромосомы 56
3.5. Индукция моноадцуктов и меш-штевых сшивок в ДНК in vitro и в ДНК клеток, культивированных in vitro 57
3.6. Выделение ДНК 60
3.7. Гидролиз ДНК 61
3.8. Спектрофотометрия 61
3.9. Измерение радиоактивности 61
3.10. Тонкослойная хроматография 62.
3.11. Электронная микроскопия ДНК в тотально денатурирующих условиях 62.
3.12. Определение дополнительного синтеза ДНК, ин-дуцированного моноаддуктами 65
3.13. Математическая обработка 64-
Глава 4. Экспериментальная часть 65
4.1. Исследование фотохимических реакций 8-меток- сипсоралена с ДНК 65
4.1.1. Изучение динамики образования моноадцуктов ДНК 66
4.1.2. Определение параметров фотореакции трансформации моноадцуктов в межнитевые сшивки
ДНК 75
4.2. Изучение эффективности моноадцуктов и межни- тевых сшивок ДНК в индукции СХО &7
4.3. Зависимость частоты образования СХО от величины мутагенной нагрузки 92
4.4. Образование СХО в ряду клеточных поколений 9?
4.5. Феномен из о окрашивания Ю5"
4.6. Исследование распределений сестринских хро-матидных обменов 1\5
4.6.1. Распределение сестринских хроматидных обменов по клеткам 115
4.6.2. Сравнение распределений спонтанных, индуцированных моноаддуктами и межнитевыми сшивками ДНК сестринских хроматидных обменов по длине первой хромосомы клеток китайского хомячка 12D
Глава 5. Заключение 1~>о
Выводы 144
Список литературы
- Существуют ли спонтанные сестринские хроматидные обмены?
- Свойства псораленов, не активированных УФ-излучением
- Фиксация и приготовление препаратов
- Исследование фотохимических реакций 8-меток- сипсоралена с ДНК
Введение к работе
Актуальность темы. Нет необходимости доказывать, что исследование процессов, происходящих на поврежденной ДНК, имеет в настоящее время большое теоретическое и прикладное значение. Одним из следствий этих процессов, достаточно легко выявляемым на цитологическом уровне, являются сестринские хроматидные обмены (СХО), представляющие собой симметричные внутрихромосом-ные межхроматидные обмены. Сестринские хроматидные обмены индуцируются широким классом мутагенов и канцерогенов (Latt, 1974; Perry, Evans, 1975), и в настоящее время СХО используются как высокочувствительный тест на ДНК-повревдающее воздействие (perry, Evans, 1975; веек, ОЪе, 1975; Wolff, 1979).
Хотя механизм образования сестринских хроматидных обменов неизвестен, в настоящее время нет никаких сомнений в том, что индукция обменов связана с процессом репликации ДНК и прямо или косвенно - с репарацией первичных повреждений ДНК. Именно первичные повреждения ДНК являются причиной, запускающей цепь биохимических реакций, приводящих к индуцированному сестринскому хроматидному обмену. Кажешся естественным начинать изучение феномена индуцированных сестринских хроматидных обменов с качественного и количественного анализа первичных повреждений с тем, чтобы в дальнейшем попытаться проследить всю последовательность их трансформаций. Эта задача, однако, наталкивается на ряд трудностей принципиального характера. Во-первых, большинство известных ДНК-повреждающих агентов индуцируют несколько типов первичных повреждений, и вследствие этого вычленить вклад одного из типов первичных повреждений оказывается сложным. Во-вторых, количественные методы учета большинства типов первичных
повреждений, как правило, нуждаются в совершенствовании. Решение этих двух задач позволило бы поднять изучение молекулярных механизмов СХО и других явлений, происходящих вследствие поражения ДНК, на качественно новую ступень.
В последнее время в исследованиях молекулярных механизмов процессов, протекающих на пораженной ДНК, большое место занимают системы, принципиально позволяющие оценивать вклад первичных повреждений определенного типа в конечный биологический эффект. Классическим примером исследования такого рода является изучение вклада пиримидиновых димеров в индукцию точковых мутаций и структурных хромосомных перестроек, основанное на использовании фотореактивации - вида репарации, селективно устраняющей именно этот тип первичных повреждений. В отличие от всех других видов репарации, для фотореактивации необходимо облучение видимым светом, и клетки, инкубированные на свету, отличаются от содержащихся в темноте в тех же условиях только по количеству пиримидиновых димеров. Эта система была использована в ряде работ для изучения индукции сестринских хроматидных обменов пиримиди-новыми димерами ( Kato, I974d; Kanjc et al., 1980? Wolff, 1982).
Существует также возможность изучать роль однонитевых разрывов в образовании того или иного биологического эффекта, поскольку воздействие УФ-излучения с длиной волны 313 mi на ДНК, содержащую бромдезоксиуридин (БУдР), вызывает только этот тип первичных повреждений.
Наконец, существует класс мутагенов, способных индуцировать строго один или два типа первичных повреждений ДНК, к которому относится большое количество агентов, образующих межни-тевые сшивки ДНК и их монофункциональные производные. Среди них наиболее перспективными являются фурокумарини - производные
псоралена, способные ковалентно присоединяться к ДНК при воздействии длинноволнового УФ-излучения. Важно, что посредством дозирования облучения можно точно и воспроизводимо индуцировать определенное количество повреждений. Монофункциональные производные псоралена, такие как ксантилетин, 5,7-диметоксикумарин, 3-карбоксипсорален, способны индуцировать только моноаддукты, в то время как бифункциональные могут присоединяться к пирими-динам, находящимся в разных цепях ДНК, и образовывать таким образом межнитевую сшивку.
После того как был обнаружен метод индукции в ДЖ практически исключительно моноаддуктов при использовании бифункциональных псораленов, активированных коротким (15 не) импульсом УФ-лазера, появилась уникальная возможность отделить вклад моноаддуктов и межнитевых сшивок в различные биологические эффекты. Сопоставление эффектов от этих двух различных типов первичных повреждений представляет особый интерес, поскольку последствия возникновения в ДНК межнитевых сшивок изучены значительно меньше, чем различные биологические эффекты от моноаддуктов. Так, не вполне ясно: являются ли сшивки эффективными индукторами сестринских хроматидных обменов, как считают некоторые авторы (shafer, 1977; Latt, 1974; Капо, Pujiwara, 1981), или, наоборот, они лишь слабо индуцируют обмены (саггапо et al., 1979. Wolff, 1978); каковы точные механизмы удаления межнитевых сшивок из генома эукариотов и мутагенные последствия этого процесса.
Между тем, межнитевые сшивки представляют собой весьма важный и потенциально опасный тип первичных повреждений, поскольку повреждаются обе нити ДЖ практически в одном сайте. Можно полагать, что репарация такого повреждения может быть му-
тационной и в ряде случаев приводить к появлению полного разрыва молекулы ДНК. Очевидно, что межнитевая сшивка, физически связывая две нити ДНК, препятствует процессу репликации. Следовательно, репликация участка, содержащего межнитевую сшивку, может произойти лишь после некоторых энзиматических реакций, связанных с разрывами ДНК в районе повреждений. Поскольку образование сестринских хроматидных обменов происходит именно в S-фазе и для этого необходимы разрывы в родительских нитях ДНК, ясно, что межнитевые сшивки представляют особый интерес при исследованиях молекулярных механизмов СХО.
Целью работы являлось исследование механизмов образования спонтанных, индуцированных моноаддуктами и межнитевыми сшивками ДНК сестринских хроматидных обменов. При этом ставились следующие основные задачи:
Разработать количественные методы учета моноаддуктов и межнитевых сшивок ДНК и на их основе определить эффективность этих первичных повреждений в индукции сестринских хроматидных обменов.
Проанализировать распределения спонтанных, индуцированных моноаддуктами и межнитевыми сшивками ДНК сестринских хроматидных обменов по длине хромосомы, выявить их особенности и различия между собой.
Оценить роль репарации этих первичных повреждений в индукции сестринских хроматидных обменов.
На основе полученных результатов построить модели индукции сестринских хроматидных обменов мелшитевыми сшивками ДНК и моноаддуктами.
Научная новизна работы. Данные, полученные в настоящей работе, расширяют наши знания о механизмах образования сестрине-
ких хроматидных обменов, возникающих на базе двух типов первичных повреждений - моноаддуктов 8-метоксипсоралена и межнитевых сшивок ДНК.
Впервые определена абсолютная эффективность этих двух типов первичных повреждений в индукции сестринских хроматидных обменов в клетках китайского хомячка.
Цитогенетическими методами показаны различия в процессах образования спонтанных, индуцированных моноаддуктами и межните-выми сшивками ДНК сестринских хроматидных обменов. В частности показано, что моноаддукты являются длительноживущими повреждениями и реализуются в сестринские хроматидные обмены на протяжении, по крайней мере, трех клеточных циклов, тогда как межни-тевые сшивки - в течение первых двух клеточных циклов после индукции первичных повреждений.
Обнаружен неаддитивный эффект первичных повреждений изучаемых типов.
На основе полученных экспериментальных результатов и литературных данных, предложены новые схемы индукции сестринских хроматидных обменов моноаддуктами и межнитевыми сшивками ДНК.
Практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных исследований и может быть использована в практике научных исследований в различных лабораториях.
Способ определения количества моноаддуктов и межнитевых сшивок ДНК, разработанный соискателем, может быть использован при исследованиях эффективности этих первичных повреждений в индукции различных типов мутаций и канцерогенеза.
Закономерности образования сестринских хроматидных обменов, индуцированных межнитевыми сшивками, исследованные в настоящей
- II -
работе, могут служить основой тест-систем, направленных на выявление агентов, индуцирующих этот тип первичных повреждений ДНК.
Результаты, представленные в работе, могут быть также использованы для совершенствования сестринских хроматидных обменов как теста на ДНК-повреждающие агенты, использующегося для анализа загрязнений окружающей среды.
Существуют ли спонтанные сестринские хроматидные обмены?
Почти все методы, использующиеся для регистрации сестринских хроматидных обменов, с неизбежностью включают в себя обработку клеток веществами, которые могут сами индуцировать СХО. Поэтому существование спонтанных СХО требует специальных доказательств. Результаты исследований в этой области противоречивы. С одной стороны, изучение зависимости уровня сестринских хроматидных обменов от концентрации бромдезоксиуридина (БУдР) показало, что экстраполяция к нулевым дозам, как правило, дает заметно превышающий нуль уровень СХО как в клетках, культивируемых in vitro (Жлоба, 1984; Kato, 1974. Galloway, Evans, 1975:
Abe, Sasaki, 1977), так И в системах ±п v±vo (Tice et al., 1976; Kanda, 1982). Аналогичные данные были получены и в случае при-менения Н-тимидина для дифференцировки хроматид (Kato, 1973). Однако существуют и работы, в которых обнаружено существенное уменьшение количества СХО при снижении концентрации БУдР в области малых доз в клетках СНО (Wolff, Perry, 1974) и даже снижение ДО нуля В клетках Drosophila raelanogaster (Gatti et al., 1979). Возможно, впрочем, что этот вид представляет собой исключение с нарушенным механизмом спонтанных обменов. В пользу этого предположения, по мнению Шонберга, говорит атипичная ориентация интерфазных хромосом Drosophila meianogaster, ЧТО может свидетельствовать об отсутствии спаривания гомологов и митоти-ческого кроссинговера, механизмы которого, возможно, обусловливают также и образование СХО (schonberg, 1980).
Ряд исследователей считает, что существование спонтанных сестринских хроматидных обменов доказывает образование дицент-рических хромосомных колец из кольцевых хромосом, которое происходит в результате сестринского хроматидного обмена в отсутствие индукторов GX0, как это зафиксировано, например, в работе Бревена и Пикока (urewen, Peacock, 1969). Однако и это не является надежным доказательством существования спонтанных сестринских хроматидных обменов, так как механизмы образования СХО в кольцевых хромосомах могут принципиально отличаться от таковых в линейных хромосомах (Gatti, 1982).
Таким образом, вопрос о существовании спонтанных СХО остается открытым. Ясно, что в формировании СХО определенную роль играет БУдР, использующийся в большинстве современных методов их регистрации.
Рассмотрим подробнее значение этого аналога тимидина в образовании индуцированных и неиндуцированных СХО. Известно, что УФ-облучение клеток, содержащих в ДНК этот аналог основания, приводит к образованию однонитевых разрывов, и вследствие этого не вызывает удивления то, что образование сестринских хроматид ных обменов, безусловно, связано с содержанием БУдР в ДНК (Maz-rima, stetka, 1978). Анализ СХО, образующихся в клетках больных, страдающих синдромом Блюма, показал, что их частота повышается в 12 раз, когда репликация протекает на ДНК, содержащей БУдР, при этом в культуральнои среде его не содержалось (siiiraishi et al., 1983). Это также указывает на роль в образовании СХО молекул БУдР, инкорпорированных в геном, по крайней мере в этом патологическом случае.
Свойства псораленов, не активированных УФ-излучением
Вещества псораленового ряда относятся к классу фурокума-ринов, в молекулы которых входят кумарин - бензо- d -пирон (рис. I, а) и фурановые пятичленные циклы. Молекулы псораленов содержат один фурановый цикл и один кумарин. Молекула псорале-на, родоначальника ряда, изображена на рисунке I, в. К группе псораленоподобных веществ, способных к фотореакции с ДНК, относятся не только фурокумарини, имеющие линейную структуру, но и некоторые их изомеры, у которых фурановое кольцо присоединено не по 6-7 связи кумарина, а, например, по 7-8 связи, подобно ангелицину (см. рис. I, г). Хуже изучен сходный класс молекул, в структуре которых кумарин (бензо- Ф -пирон) заменен хромоном (бензо- -пирон; см. рис. І, б). Ряд авторов считает их фотонеактивными (scott et al. 1976). По другим данным, по крайней мере, некоторые из них, например келлин, обладают фотохимической активностью (Cassuto et aL., 1977).
Наиболее известные фотохимически активные фурокумарини -8-метоксипсорален - 8-М0ЇЇ (см. рис. I, д) и 4,5,8-триметилпсо-рален (триоксален, ТШ) - применяются в настоящее время в медицинской практике ряда стран (Bridges et al., 1981), в том числе и в Советском Союзе (Машковский, 1978), для лечения кожных болезней - витилиго и псориаза.
Изучение взаимодействия псораленов с клетками началось с осознания в 30-40-х годах факта существенного влияния УФ-излу-чения на реакцию фурокумаринов с биологическим материалом. Однако надежные и однозначно трактуемые результаты, приведшие к современному представлению о фотохимических реакциях фурокумаринов в клетке, были получены только в 60-70-х годах. Эксперименты показали, что в широком диапазоне концентраций активных веществ псораленового ряда они без дополнительного облучения светом не оказывают заметного влияния на Физиологию клеток (Burger, Simons, 1979; Scheney, Hsie, 1981). В результате экспериментов подобного рода сложилось представление, что свет является своего рода активатором молекул псораленов. Для успешного протекания фотореакции необходима некоторая инкубация клеток в присутствии псоралена; видимо, в это время происходят важные темновые реакции между псораленом и клеточными компонентами.
Важным для понимания существа процессов, происходящих в клетке при обработке псораленом без облучения светом, явилось обнаружение факта значительного повышения растворимости псора -Зелена в водной фазе в случае добавления туда ДНК, тогда как в присутствии белков и РНК растворимость псоралена не возрастает (Musa«jo, Rodighiero, 1970). Очевидно, это происходит из-за взаимодействия молекул псораленов и ДНК. Данная реакция носит обратимый характер (мивадо et al., 1966; Ashwood-Sraith, Grant, 1977). Поскольку структура молекулы псоралена напоминает таковую молекул типичных интеркаляторов, естественно было предположить, что обратимое связывание псораленов с ДНК в темноте также является интеркаляцией. В пользу этого предположения говорит повышение температуры плавления ДНК в растворе производных псоралена на 1-1,5 (Dall Acqua, Rodigiero, 1966). Интеркаляци-онный механизм взаимодействия псораленов с ДНК был установлен в 1966 г. (Dall Acqua et al., 1966) и затем, на основании дополнительных данных, полученных методами спектроскопии, равновесного диализа и линейного дихроизма, подробно описан в 1978 году (Ball Acqua et al., 1978).
Возникает вопрос о возможном поражении клеток, не подвергающихся облучению светом. Слабое взаимодействие в темноте псораленов с ДНК позволяет предполагать, что поражение ее будет крайне незначительным (Dall Acqua, 1978). Это предположение подверглось тщательной проверке. Поскольку токсического влияния псораленов на клетки в отсутствие света обнаружить не удалось, особое внимание было обращено на возможное мутагенное действие псораленов.
Известно, что интеркаляторы способны вызывать мутации типа сдвига рамки считывания. Псоралени, в особенности 8-МОП и триоксален, были протестированы на эту способность на бактериях. Результаты исследований такого рода не вполне согласуются друг с другом.
Фиксация и приготовление препаратов
Клетки китайского хомячка. В работе использовались две ан-еуплоидные линии клеток китайского хомячка - Bild-Ii-F$28: клон 237 и GH0-KI.
Клетки китайского хомячка, клон 237, выращивали на среде, содержащей 45 % среды Игла, 45 % среды 199 и 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота при температуре 37 С с продолжительностью клеточного цикла, равной 16 ч, и модальным числом хромосом
Клетки CH0-KI (номер в Американской коллекции клеточных культур - GOL 61) были адаптированы нами к росту в среде, состоящей из 45 % среды Игла, 45 % среды 199 и 10 % фетальной сыворотки. В наших условиях культивирования средняя продолжительность цикла составляла 12-16 ч, в зависимости от серии используемых сред. Модальное число хромосом - 20.
В опытах с использованием БУдР и (или) 8-МОП клетки выращивали в бюксах, находящихся в светонепроницаемых чехлах, и все операции с клетками проводили в условиях минимальной освещенности.
Лейкоциты человека. Для культивирования лейкоцитов человека нами применялась следующая методика. Цельную кровь, стерильно взятую от здорового донора, в объеме 50 мл с гепарином отстаивали в течение ночи при температуре 4 С. Слой лейкоцитов с небольшим количеством эритроцитов и 15 мл плазмы отбирали в стерильную посуду и добавляли 0,8 мл ФГА фирмы "Wellcome" (Анг
лия). Затем к клеткам приливали 65 мл культуральной среды следующего состава: 40 % среды Игла, 40 % среды 199 и 20 % феталь-ной сыворотки. Взвесь клеток, после тщательного пипетирования, разливали во флаконы вместимостью 100 мл и помещали в термостат с температурой 37 С.
Перед фиксацией на последние 3 ч роста клеток в культураль-ную среду добавляли колцемид ("Coibiochem", США) в концентрации 0,1 мкг/мл. Затем суспензию клеток инкубировали в гипотоническом растворе 0,075 моль/л К-Ol при температуре 37 С в течение 16 мин (клетки китайского хомячка)
Фиксацию осуществляли посредством смеси ледяной уксусной кислоты и этанола в соотношении 1:3, предварительно охлавденной до _18 С. Первичную фиксацию проводили в течение 20 мин; после вторичной замены фиксатора клетки оставляли на ночь при температуре 4 С.
Препараты клеток приготовляли путем раскапывания суспензии клеток в фиксаторе на чистые сухие предметные стекла, охлажденные до -18 С с последующей сушкой теплым воздухом.
Препараты клеток, которые по условиям эксперимента росли в присутствии БУдР (5 мкг/мл) в течение двух или трех последних циклов, окрашивали для выявления СХО по модифицированной ФПГ-технике, предложенной Сафроновым и соавт. (Сафронов и др.,1981). Окрашивание проводили не ранее чем через 3 сут после приготовления препаратов. На препараты наносили небольшое количество буфера Мак-Илвейна (2 моль/л аарНРОи и I моль/л лимонная кисло та, смешанные в соотношении 19,4:0,6), сверху накрывали покров стеклами, ныШ№"о"блучали двумя УФ-облучателями 0КН-ІІ с лампами ДРТ-220 на расстоянии 20 см в течение 30-40 мин. Препараты постоянно охлаждали холодным воздухом. После промывания дистиллированной водой и сушки теплым воздухом препараты окрашивали по Гимза стандартным методом (3 % раствор Гимза в I/I5 моль/л фосфатном буфере; рН 6,8) в течение 15 мин. Некоторые препараты перед окраской инкубировали в растворе 2xssc при температуре 60 С в течение 30 мин.
Для получения поперечной исчерченности хромосом (G-брэнд инг) препараты перед окрашиванием обрабатывали 0,05 % раствором трипсина (Difco, США.) в I/I5 моль/л фосфатном буфере.
Исследование фотохимических реакций 8-меток- сипсоралена с ДНК
Реакция фотосвязывания молекул 8-M01I с ДНК зависит от многих факторов, в том числе от длины волны излучения и длительности импульса облучающего света. Варьируя эти параметры, удается получить либо исключительно моноаддукты (при облучении одиночным импульсом лазера с длительностью импульса не более 15 не или при облучении светом с длиной волны не менее 390 нм), либо смесь моноаддуктов и межнитевых сшивок ДНК. Следовательно, эффективность образования этих двух типов первичных повреждений ДНК зависит как от режима светового воздействия, так и от длины волны используемого света. Кроме того, световое облучение индуцирует ещё два процесса - отщепление молекул 8-М0ЇЇ от пиримиди-нов ДНК и фотодеградацию молекул 8-М0П, - каждый из которых имеет свой специфический оптимум.
Не ясно также, как изменяется соотношение между моноаддук-тами, способными к образованию межнитевых сшивок (4,5-моноад-дукты), и моноаддуктами, которые не могут быть предшественниками этого типа первичных повреждений (3,4-моноаддукты), в зависимости от длины волны облучающего света.
Учет всех этих параметров является весьма существенным при проведении качественных и особенно количественных экспериментов по выяснению эффективности моноаддуктов и межнитевых сшивок ДНК при образовании точковых мутаций и хромосомных перестроек, в том числе и СХО.
Нами были поставлены эксперименты, в которых изучены процессы присоединения молекул 8-М0ЇЇ к тинину и ДНК, эффективность ее отмывания от не связанного ковалентно 8-МОП, трансформация моноаддуктов в межнитевые сшивки ДНК.
В модельном эксперименте мы исследовали фотоприсоединение молекул 8-М0ЇЇ к тимину. Поскольку отделение несвязанного псора-лена от тимина и продуктов фотореакции проводить достаточно сложно, условия облучения подбирали такті образом, чтобы обеспечить переход в связанное состояние возможно большей доли молекул 8-МОП. Для облучения использовали прибор 0КН-ІІ с лампой ДРШ-220 (расстояние - 35 см, длительность облучения -1ч). Крышка чашки Петри, в которой облучали смесь тимина с 8-МОП, служила фильтром, селективно ослабляющим, в основном, коротковолновое излучение. Это повышало выход фотопродуктов, поскольку известно, что наиболее эффективно фотореакция проходит при УФ-облучении с длиной волны 320-380 нм, а коротковолновое излучение ( X = 254 нм), наоборот, приводит к обратной реакции, т. е. разрыву ковалентной связи между 8-МОП и пиримидиновым основанием. Спектральная характеристика пропускания крышки чашки Петри приведена на рисунке 3. Облучаемый раствор содержал 1,3 мг/мл тимина и 37 мкг/гдл 8-МОП. Облучение проводили в тонком слое для обеспечения равномерности фотореакции по объему раствора (толщина слоя I мм, коэффициент пропускания 80 %). Температуру облучаемого раствора поддерживали на уровне около 0 С.
УФ-спектры облученного и необлученного растворов, а также спектр тимина, приведены на рисунке 4. Спектр 8-МОП показан на рисунке 5. Видно, что для облученного раствора характерно общее уменьшение оптической плотности в области 300-360 нм. Тем не менее, поглощение связанных ковалентно молекул тимина и 8-МШ в этой области превышает значение поглощения тимина. Эти данные хорошо согласуются с полученными Гойялом и Гросевейнером (Goyal, Grossweimer, 1979), показавшими, что в результате фотоприсоединения молекулы 8-МОП ее максимум поглощения в УФ-обдасти сдви гается с 302 до 310 нм, и величина максимума поглощения уменьшается на 37/0.
На рисунке 6 изображены спектры ДНК, облученной с 8-МОП УФ-излучением лазера и отмытой от несвязанного 8-МОП, и чистой ДНК, а также спектр раствора, содержащего ДНК и 8-МОП, не связанные между собой ковалентно. При сравнении этих спектров между собой можно обнаружить те же характерные изменения, которые происходят в результате УФ-облучения смеси тимина и 8-МОП.
Поскольку известно, что в фотореакции 8-МОП с ДНК принимает участие в основном тимин (Musajo, Kodighiero, 1972; Кашіе et al., 1982), можно заключить, что в наших экспериментальных условиях идет эффективная фотореакция 8-МОП с тшлиновыми основаниями ДНК. Об этом также свидетельствует то, что спектр ДНК содержащий фотоаддукты 8-МОП, полученный Оу и соавт. (ou et al., 1978), во всех характерных деталях совпадает со спектром ДНК, облученной УФ-излучением лазера в присутствии 8-МОП и отмытой от не связанного ковалентно молекул псоралена.
Количество молекул 8-МОП, ковалентно присоединившихся к участку ДІЖ единичное длины, определяли с помощью Н-8-М0П.
Для корректности результатов радиоизотопного анализа необходимо, чтобы меченный по тритию препарат 8-МОП по химической чистоте был аналогичен используемому в других экспериментах не-меченному 8-МОП. Особенно важно отсутствие потенциально фотоак-тивных радиоактивных примесей в используемом Н-8-М0П, которые могут возникать при распаде молекул 8-МОП в процессе мечения и приводить к ошибкам при определении количества молекул, присоединившихся к ДНК.
