Содержание к диссертации
I. ВВЕДЕНИЕ 4
И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
II. 1. ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ 7
II. 1.1. История развития метода 7
И. 1.2. Стимуляция суперовуляции в программе ЭКО и ПЭ 9
II. 1.3. Эмбриологические аспекты программы ЭКО 11
Уровень рН. 11
Осмолярность 11
Ионный состав 12
П.2. НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ДОИМПЛАНТАЦИОННОГО
ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ 14
И.2.1. Активация генома зародыша млекопитающих 14
П.2.2. Нарушения раннего эмбрионального развития млекопитающих и
их причины 15
Н.2.3. Характерные черты апоптоза и некроза
соматических клеток 19
Краткая характеристика некроза 20
П.2.4. Гибель клеток путем апоптоза 22
Морфологические черты клеток, вступивших в апоптоз 22
Биохимические особенности клеток, вступивших в апоптоз 23
Пути реализации апоптоза 23
И.2.5. Клеточная гибель в раннем развитии млекопитающих 28
Фрагментация доимплантационных
эмбрионов млекопитающих 30
И.З. ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ 32
И.З. 1. Генная терапия 33
П.3.2. Способы и механизмы ингибирования экспрессии генов 34
Трансгенные технологии 34
Олигонуклеотидные технологии 35
Смысловые олигонуклеотиды 35
Антисмысловые олигонуклеотиды 37
Рибозимы и ДНК энзимы 39
Интерференционная малая РНК 40
И.3.3. Химические модификации антисмысловых
олигонуклеотидов 43
«Первое поколение» АсОДН 43
«Второе поколение» АсОДН 45
«Третье поколение» АсОДН 46
И.3.4. Способы доставки нуклеотидов в клетки-мишени 48
Ш.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52
III. 1. МАТЕРИАЛЫ 52
III. 1.1. Животные и получение эмбрионов 52
ПІЛ.2. Среды 52
III. 1.3. Олигонуклеотидные последовательности 52
Ш.2. ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 59
Ш.2.1. Анализ поступления АсОДН в бластомеры эмбрионов мыши
методом конфокальной микроскопии 59
Ш.2.2. Культивирование эмбрионов мыши в среде с добавлением
АсОДН к мРНК генов HRK и FASL человека 60
Ш.2.3. Трансплантация бластоцист мыши в матку 64
Ш.2.4. Анализ плодов мыши на присутствие аномалий развития 64
Ш.З. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 66
Ш.3.1 .Группы 66
Ш.3.2. Индукция суперовуляции 67
Ш.3.3. Оплодотворение in vitro 67
Ш.З.4. Культивирование и оценка качества эмбрионов 67
Ш.З.5. Криоконсервация эмбрионов 71
III.4. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 71
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ 73
IV.1. ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 73
IV. 1.1. Анализ поступления АсОДН в бластомеры эмбрионов мыши
методом конфокальной микроскопии 73
IV.1.2. Культивирование эмбрионов мыши в среде с добавлением АсОДН к мРНК генов HRK и FAS человека и некомплементарной
олигонуклеотидной последовательности 75
IV.2. КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 81
IV.2.1. Сравнение клинико-эмбриологических
показателей в группах 81
IV.2.2. Культивирование ооцитов и эмбрионов человека в среде с
добавлением АсОДН кмРНК гена HRK человека 85
Уменьшение аномалий и фрагментации эмбрионов in vitro 85
Наступление беременности 88
IV.2.3. Культивирование ооцитов и эмбрионов человека в среде с
добавлением АсОДН к мРНК гена FASL человека 91
Уменьшение аномалий и фрагментации эмбрионов in vitro 91
Наступление беременности 91
IV.2.4. Культивирование ооцитов и эмбрионов человека в среде с
добавлением смеси АсОДН к мРНК генов HRK и FASL человека
(HRK№2 + HRK№3+FASL№2+FASL№3) 93
Выявление специфического эффекта смеси олигонуклеотидных
последовательностей 93
Сравнение качества эмбрионов (норма, аномалия) между
группами на 2 и 3 сутки развития 95
Наступление беременности 96
V. ОБСУЖДЕНИЕ 98
VI. ВЫВОДЫ 119
VII. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 121
VIII. ПРИЛОЖЕНИЯ 142
Введение к работе
Лечение мужского и женского бесплодия методами
вспомогательных репродуктивных технологий в настоящее время
является наиболее эффективным. Успех программы
экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от причин бесплодия, возраста пациентки, от количества и качества полученных и трансплантированных в матку эмбрионов. Низкая результативность лечения данным методом, как правило, наблюдается у пациенток старшей возрастной группы (35 лет и старше) и у женщин с неадекватным ответом яичников на гормональную стимуляцию (низкий ответ, синдром гиперстимуляции яичников). В таких случаях число полученных ооцитов может быть невелико, качество ооцитов и эмбрионов и, как следствие, их жизнеспособность значительно снижены.
Повышение жизнеспособности эмбрионов in vitro - одна из ключевых задач современной репродуктивной медицины. Значительная часть исследований в данной области посвящена разработке модификаций культуральных сред и условий культивирования с целью улучшения качества ооцитов и эмбрионов in vitro (Behr et ah, 2004; Quinn, 2004; Summers et al, 2003). Многими исследователями было показано, что нарушения развития и снижение качества эмбрионов (в том числе остановка в развитии, фрагментация и др.), полученных в программах ЭКО, является следствием апоптоза отдельных бластомеров или целых эмбрионов.
При лечении бесплодия методом ЭКО созревание большого количества ооцитов индуцируют повышенными дозами гонадотропных гормонов, многие пациентки имеют нарушения иммунной системы, страдают заболеваниями репродуктивной и эндокринной систем. Эти
факторы могут являться причиной сверхэкспрессии некоторых генов апоптоза в ходе оогенеза (Chi et al., 2000; Dharma et al., 2003; Perez et al., 1997;Katagiriefa/., 1997).
Открытиями последних десятилетий в области генетики и молекулярной биологии показана возможность модуляции генной экспрессии экзогенными генетическими конструкциями (Gleave et al., 2005; Morishita et al., 2003; Putnam, 1996). Это положило начало развитию нового направления молекулярной медицины - генной терапии, одним из методов которой является применение антисмысловых олигонуклеотидов. Преимущество подхода антисмыслового ингибирования на посттранскрипционном уровне перед другими методами генной терапии заключается в том, что в результате воздействия терапевтического агента (антисмысловой олиго-дезоксинуклеотидной последовательности - АсОДН) не затрагивается целостность генома, так как все биохимические процессы протекают вне ядра: в клетку вводится АсОДН, идентичная участку кодирующей части гена-мишени, которая комплементарно связывается с мРНК данного гена в цитоплазме, образуя двуцепочечный комплекс, что препятствует синтезу белка (Putnam, 1996; Tomita et al., 2003).
Использование АсОДН в генной терапии для лечения различных заболеваний обсуждается с конца семидесятых годов прошлого века. В настоящее время уже проводятся клинические испытания препаратов АсОДН для лечения таких заболеваний, как раковые поражения органов и их систем, сердечно-сосудистые патологии, ревматоидные артриты, псориаз, астма, гепатит С, СПИД, и многие другие (Kurreck, 2003). В данном исследовании нами была предложена методика применения АсОДН для регуляции генной экспрессии на доимплантационных стадиях развития эмбрионов человека.
Целью данного исследования являлось изучение возможности
использования АсОДН как действующих агентов для генной терапии на
ранних эмбриональных стадиях развития. В связи с этим были
поставлены следующие задачи: исследовать возможные
эмбриотоксические эффекты воздействия АсОДН на
доимплантационные эмбрионы млекопитающих при культивировании in vitro и возможные отсроченные тератогенные эффекты после воздействия АсОДН на доимплантационных стадиях развития (модельный объект - мышь); исследовать проникновение и распределение АсОДН в клетках доимплантационных эмбрионов при культивировании in vitro (модельный объект - мышь); исследовать возможность повышения качества эмбрионов человека при культивировании in vitro в среде с добавлением АсОДН к мРНК генов HRK и FASL, индуцирующих апоптоз.
![Морфологические варианты комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс]](/i/i/4419/185836.png "Морфологические варианты комплекса ооцит-кумулус, зигот, эмбрионов человека и критерии прогноза успешности экстракорпорального оплодотворения [Электронный ресурс] Высоцкий Александр Юрьевич")
