Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы.
1.1. Основные аспекты программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов человека 11
1.1.1. Причины женского бесплодия и экстракорпоральное оплодотворение человека 12
1.1.2. Гормональная стимуляция овуляции пациенток . 13
1.1.3. Условия культивирования эмбрионов человека in vitro 18
1.1.4. Подготовка сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения человека 20
1.1.5. Этапы развития эмбрионов человека и перенос эмбрионов 22
1.1.6. Этические и правовые аспекты репродуктивных технологий 25
1.2. Метод медленного замораживания 30
1.3. Метод витрификации 38
Глава II. Материалы и методы исследования.
2.1. Материалы исследования 48
2.2. Методы исследования
2.2.1. Программа экстракорпорального оплодотворения и перенос эмбрионов человека 49
2.2.2. Метод медленной криоконсервации 55
2.2.3. Метод витрификации 58
Глава III. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1. Сравнение частоты наступления беременностей и частоты имплантации в результате переноса медленно криоконсервированных и витрифицированных бластоцист в крио циклах 65
3.2. Применение метода витрификации ооцитов человека 73
3.3. Разработка модификации метода витрификации 75
Заключение 79
Выводы 80
Список литературы 81
- Подготовка сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения человека
- Этические и правовые аспекты репродуктивных технологий
- Программа экстракорпорального оплодотворения и перенос эмбрионов человека
- Сравнение частоты наступления беременностей и частоты имплантации в результате переноса медленно криоконсервированных и витрифицированных бластоцист в крио циклах
Введение к работе
* Актуальность темы
В наши дни бесплодие среди супружеских пар достигает 15%, а экстракорпоральное оплодотворение преовуляторных ооцитов (ЭКО) и перенос эмбрионов (ПЭ) женщине приобретают все большее значение в лечении женского и мужского бесплодия. Бесплодие может развиваться вследствие генетических и инфекционных факторов, эндокринной недостаточности, а также анатомических особенностей пациента. Одними из наиболее серьезных причин бесплодия женщины являются синдром поликистозных яичников (СПКЯ), эндометриоз, функциональная недостаточность яичников. Мужское бесплодие может иметь место вследствие нарушения сперматогенеза, развивающегося в свою очередь из-за гормональных, инфекционных или иных воздействий. Генетические
факторы играют существенную роль в развитии как мужского, так и
4 женского бесплодия, и это направление исследований стало одним из
ведущих в мире в последние несколько десятилетий [Курило Л.Ф., Шилейко Л.В. и др., 1997; Курило Л.Ф., Шилейко Л.В. и др., 2000]. В результате применения метода ЭКО и ПЭ большое количество детей (более 200 тысяч в год), зачатых in vitro, рождается во многих странах мира. Развитие и совершенствование ЭКО и ПЭ дали начало таким методам как ИКСИ (интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида в яйцеклетку) [Van Steirteghem, A. et al., 1993; Van Steirteghem, A. et a!., 1994], ПГД (преимплантационная генетическая диагностика), FISH (флуоресцентная in situ гибридизация) [Берлинский Ю., 1996], а также методам замораживания эмбрионов и ооцитов в жидком азоте для их использования в будущем [Whittingham D. et al., 1972; Wilmut I., 1972].
Появление метода криоконсервации эмбрионов человека и его
успешное применение [Trounson A., Mohr L., 1983] позволило специалистам
* решить ряд важных проблем. В циклах стимуляции суперовуляции
пациенток с СПКЯ часто используют криоконсервацию эмбрионов для их переноса в естественном цикле [СЫап R. et al., 2001]. Такой же подход применяют при развитии синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) [Ferraretti A. et ah, 1999].
По одной из широко применяемых классификаций градации эмбрионы делятся на классы: "А"; "В"; "С"; "D", в зависимости от быстроты и качества их развития, соответственно. К классу "А" относят эмбрионы с достаточным количеством одинаковых по размеру бластомеров (2-4 бластомера на день 2, 6-12 бластомеров на день 3, компактизация бластомеров и гладкая структура морулы на день 4, формирование бластоцисты (эмбриобласта и трофобласта) на день 5; фрагментация составляет менее 5% от общего объема эмбриона. Эмбрионы класса "В" также имеют достаточное количество бластомеров на день 2 и день 3, бластомеры могут немного отличаться по размеру, либо фрагментация составляет 5-10% от общего объема эмбриона, компактную структуру морулы на день 4 с фрагментацией 5-10% от общего объема эмбриона, на день 5 эмбрион все еще находится на стадии морулы. Эмбрионы класса "С" характеризуются недостаточным количеством бластомеров в эмбрионе, неодинаковыми по размеру бластомерами, отсутствием структур морулы и бластоцисты на день 4 и на день 5, соответственно, и фрагментацией 15-25% от общего объема эмбриона. К классу "D" относят эмбрионы, которые сильно отстают в развитии и почти полностью фрагментированы (более 25% от общего объема эмбриона). [AHkani М. et al., 1999; Claman P. et al., 1987; Desai N. et al., 2000; Hardarson T. et al., 2001; Lewin A. et al., 1994].
Выбор дня ПЭ зависит от количества эмбрионов, их градации, а также от статистических показателей успешных ЭКО и ПЭ в различных лабораториях. В некоторых лабораториях предпочтение отдается ранним дням ПЭ (второму или третьему). В этих случаях переносят лишь часть эмбрионов, а оставшиеся эмбрионы классов "А" и "В" замораживают для переноса их в следующих циклах (крио циклах). Во многих лабораториях
выбор ПЭ ложится на пятый день. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты на пятый день, в своем большинстве относятся к классу "А" [Dokras A. et аЦ 1993]. Неиспользованные после ПЭ бластоцисты и эмбрионы, из которых сформировались бластоцисты на шестой день (такие эмбрионы относятся к классу "В") также подвергают криоконсервации.
В то время как метод медленного замораживания клеток и эмбрионов существует уже 20 лет и характеризуется медленным вытеснением воды криопротекторами с последующим медленным понижением температуры (от комнатной температуры до температуры жидкого азота, — 196С) [Menezo У. et al., 1992; Virant-Klun I. et al., 2003], метод витрификации (метод быстрой криоконсервации) еще недостаточно разработан и изучен и представляет большой интерес как в плане снижения стоимости метода, так и в плане быстроты его выполнения, а также результатов хранения в криоконсервации и последствий размораживания [Liebermann J. et al., 2002b; Trounson A. et al., 1987]. В нашей лаборатории был применен и модифицирован метод витрификации, разработанный д.б.н. М. Куваямой в клинике Като, специализирующейся по ЭКО (Токио, Япония) [Kuwayama М., 2001]. Метод витрификации основан на быстром воздействии криопротекторов вследствии их повышенной концентрации и на быстром понижении температуры. При витрификации происходит быстрое вытеснение воды из эмбрионов для предотвращения ее кристаллизации в клетках с последующим моментальным переносом эмбрионов в жидкий азот. Многие исследования отмечали значительное возрастание частоты выживаемости эмбрионов при использовании техники витрификации [Е1-Danasouri I. et al., 2001].
В наши дни криоконсервация эмбрионов является обычным методом программы ЭКО. Однако замораживание ооцитов для использования их затем в ЭКО до сих пор применяется редко и представляет скорее метод экспериментальный, чем клинический, в то время как проблема старения яйцеклетки и становления ее нефункциональности была и остается одной из
наиболее серьезных проблем медицины. Поэтому, разработка модификаций метода криоконсервации яйцеклеток и эмбрионов и установление наиболее оптимальных условий его протекания является одним из самых важных направлений программы ЭКО.
Таким образом, целью нашего исследования явилось оценить эффективность метода витрификации эмбрионов и ооцитов человека с помощью сравнения методов медленного замораживания и витрификации, установить наиболее оптимальные условия для успешного проведения витрификации с целью повышения частоты наступления беременностей и имплантации в программе ЭКО и ПЭ.
Для решения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
Применить метод витрификации и метод медленного замораживания на бластоцистах человека (дня 5 и дня 6 развития).
Сравнить частоту выживаемости бластоцист при витрификации и методе медленного замораживания.
Сравнить частоту наступления клинической беременности и частоту имплантации при ПЭ после витрификации бластоцист и после использования метода медленного замораживания бластоцист с частотой наступления клинической беременности и имплантации перенесенных бластоцист и морул на день 5 в циклах ЭКО.
Сравнить схемы подготовки пациенток к переносу размороженных после медленной криоконсервации эмбрионов и после витрификации.
Применить метод витрификации ооцитов и оценить его результаты.
Разработать оптимальные условия витрификации ооцитов и эмбрионов человека.
9 Научная новизна
Применен модифицированный метод витрификации эмбрионов и ооцитов человека. Выявлена высокая частота выживаемости эмбрионов; частоты имплантации и наступления клинической беременности при витрификации по сравнению с методом медленного замораживания. Разработаны условия проведения витрификации, при которых возрастает количество жизнеспособных клеток в каждом эмбрионе.
Практическая значимость
Метод витрификации ооцитов и эмбрионов человека занимает 10-15 минут, в то время как вся процедура медленного замораживания протекает в течение 3-х часов. Таким образом, витрификация позволяет экономить время, а также обходиться без использования дорогостоящего морозильного оборудования. Доля выживших эмбрионов человека при использовании метода витрификации составляет 100%. При витрификации частота наступления беременностей возрастает в 2.4 раза, а частота имплантации - в 4.3 раза по сравнению с методом медленного замораживания.
До настоящего времени пациенты, имеющие замороженные эмбрионы с помощью техники медленной криоконсервации и проходящие цикл стимуляции, всегда шли на риск потери эмбрионов из-за их возможной невыживаемости при их размораживании в день ПЭ. Теперь эта проблема может быть решена, так как при витрифицировании эмбрионов частота их выживаемости заметно возрастает.
Высокие показатели выживаемости яйцеклеток (92.4%) и доли их нормального оплодотворения (83.6%) после витрификации играют важную роль в дальнейшем совершенствовании программы ЭКО в будущем.
«
Положения, выносимые на защиту:
При оптимизации условий проведения витрификации, основанной на понижении токсичности высоких концентраций криопротекторов, возрастает количество таких эмбрионов, в которых большее число клеток сохраняет жизнеспособность.
Метод витрификации, как альтернативный метод криоконсервации эмбрионов, является более эффективным чем метод медленного замораживания, что установлено при сравнении результатов частоты выживаемости эмбрионов и ооцитов человека, частоты имплантации и наступления беременностей.
Частота имплантации и наступления беременностей не зависит от выбранных схем подготовки пациенток (таких как естественный цикл, а также циклы с применением препаратов фолликул о стимулирующего гормона (ФСГ) и препаратов Lupron / Эстроген) к переносу размороженных после криоконсервации эмбрионов.
Витрификация ооцитов до сих пор является экспериментальным методом и требует статистически значимых цифр по результатам исследований для оценки его эффективности и использования в клинической практике. В настоящей работе получены обнадеживающие результаты частоты выживаемости витрифицированных ооцитов и частоты их оплодотворения.
'I
Подготовка сперматозоидов для экстракорпорального оплодотворения человека
В процесс подготовки пациентки для программы ЭКО входит комплекс важных исследований. Изучение гормонального статуса является одним из наиболее необходимых исследований для установления состояния менструальной и репродуктивной функций. У женщины гипоталамус является органом, обеспечивающим функционирование и поддержание гомеостаза репродуктивной системы на протяжении всей жизни.
Механизмы регуляции репродуктивной системы и других эндокринных функций организма сходны вследствие значимости и физиологии гипоталамических и гипофизарньгх структур. В гипоталамусе вырабатывается рилизинг — гормон (люлиберин — ЛГ-РГ гонадолиберин — ГЛ), дающий начало синтезу и освобождению гонадотропинов (ГТ) — фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и лютей низирующего гормона (ЛГ) клетками аденогипофиза - гонадотрофами [Knobil Е. 1980]. Гормон роста (СТГ) - соматотропин, вырабатывается в гипофизе и также влияет на функционирование репродуктивной системы [Руководство по эндокринной гинекологии 1997. Endocrinology, 1997]. В печени синтезируются инсулиноподобные факторы роста (ИФР), или соматомедины, которые регулируют пролиферацию и дифференциацию клеток посредством связывания со специфическими рецепторами. Также важна регуляция синтеза адренокортикотропного гормона (АКТГ) и секреции кортизола [Endocrinology, 1997; Speroff L. et al, 1994].
При естественном менструальном цикле женщины (как и у представителей других видов млекопитающих) в начале цикла при фолликулярной (фолликулиновой) фазе в рост вступает до 10-15 фолликулов в результате влияния ФСГ. Один из первых созревших фолликулов (доминантный) овулирует, а остальные фолликулы из этой кагорты подвергаются атрезии. Доминантный фолликул продуцирует эстрадиол (Е2), который отвечает за секреторную трансформацию эндометрия и имплантацию эмбриона. При критическом уровне Е2 в крови возрастает концентрация ЛГ, что приводит к стимуляции овуляции преовуляторного фолликула и лютеинизации его фолликулярных клеток [Fritz М., Speroff L., 1983]. Установление уровня Е2 необходимо для определения функциональной зрелости доминантного фолликула [Анашкина Г. и др. 1986]. На месте "овулировавшего" фолликула образуется желтое тело, которое определяет изменение концентраций Е2 и прогестерона (П) в лютеиновой фазе.
Одним из серьезных осложнений программы ЭКО и ПЭ является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ), который характеризуется нарушением этапов созревания фолликулов и вступлением в рост одновременно большего чем в норме (10-15) числа фолликулов с их последующей лютеинизацией [Navot D., 1997]. При развитии СГЯ увеличивается концентрация Е2, создаются неблагоприятные условия для имплантации и развития эмбриона и плода, что часто приводит к самопроизвольным выкидышам [Cole Н., Hart G., 1930; Dolian G. et al., 1991]. В этом случае потери плода можно избежать, криоконсервируя эмбрионы для переноса их женщине в крио циклах.
Таким образом, до того как выбрать схему стимуляции суперовуляции необходимо предварительное гормональное обследование пациенток для установления прохождения секреции гонадотропных гормонов аденогипофиза (Гн), СТГ, активности желтого тела, функционирования щитовидной железы, так как отклонение этих показателей может стать причиной осложнений в программе ЭКО и ПЭ.
В период стимуляции овуляции проводят ультразвуковое обследование (УЗИ) матки и яичников для установления их состояния, а также определяют концентрацию гормонов в плазме крови.
Успешное прохождение программы ЭКО и ПЭ в первую очередь зависит от качества и количества сформировавшихся фолликулов и, следовательно, ооцитов [Steptoe P. et al., 1986]. Для стимуляции фолликулогенеза и получения нескольких преовуляторных ооцитов в качестве гормональных препаратов используют антагонисты эстрогенов, препараты человеческого менопаузального гонадотропина (чМГ), которые содержат ФСГ и ЛГ, а также препараты ФСГ. Для стимуляции овуляции используют хорионический гонадотропин (ХГ), который представляет собой ЛГ - подобный препарат. Через 36 часов после введения ХГ проводят трансвагинальную пункцию яичников (ТВП) для аспирации зрелых ооцитов.
Существует несколько различных схем стимуляции суперовуляции, которые делятся на короткие и длинные схемы. Короткие схемы гормональной стимуляции используют для пациенток с возрастным фактором, а также пациенток с неудачными попытками стимуляции в предыдущих циклах. Самой простой из схем является схема с использованием препаратов нестероидных антиэстрогенов, таких как кломифен цитрат. Кломифен цитрат обычно начинают вводить с 5-го дня менструального цикла. Недостатком этой схемы стимуляции суперовуляции является то, что кломифен цитрат недостаточно эффективен из-за повышенного уровня ЛГ в процессе стимуляции, и, соответственно, существует риск его преждевременного выброса. Кломифен цитрат также может отрицательно повлиять на имплантацию в результате антиэстрогенного воздействия на эндометрий [Howies С, Macnamee., 1989].
Поэтому, в настоящее время основными препаратами, используемыми для стимуляции суперовуляции, являются фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и человеческий менопаузальный гонадотропин (чМГ), а также их комбинации.
По одной из существующих схем стимуляции суперовуляции, основанных на ФСГ и чМГ, применение препаратов ФСГ (или чМГ) начинают со 2-го или 3-го дня менструального цикла. Так как реакция каждого организма на препараты ФСГ и чМГ индивидуальна, их дозы варьируют и могут изменяться в процессе стимуляции в зависимости от эффективности протекания стимуляции суперовуляции [Blankstein J., QuigleyM., 1991].
Также существуют схемы стимуляции суперовуляции с различной комбинацией ФСГ, чМГ и кломифен цитрата. Иногда используется схема с чередованием препаратов кломифен цитрата (со 2-го дня менструального цикла в течение нескольких дней), а потом применением препаратов чМГ до конца стимуляции. Кроме того, существуют схемы стимуляции суперовуляции, в которых препараты кломифен цитрата и чМГ вводятся одновременно со 2-го дня менструального цикла в течение нескольких дней, после чего прекращают введение кломифен цитрата и продолжают вводить лишь чМГ до конца стимуляции.
Этические и правовые аспекты репродуктивных технологий
Очень важными представляются этические аспекты программы ЭКО и ПЭ. Первоначально программа ЭКО применялась как метод, позволяющий забеременнеть пациенткам, у которых диагностирована непроходимость маточных труб (трубный фактор), и сперматозоиды не могли достичь ооцита. С тех пор перечень причин бесплодия значительно расширился, и в 1997 году в мире родилось около 200 тысяч детей в результате применения программы ЭКО и ПЭ [Organon, 1997]. В наши дни много споров вызывают такие биомедицинские технологии, как технология клонирования человека [Klotzko А., 1997], определение пола плода [Dawson К., Trounson А., 1996], донация гамет [Assisted reproductive technologies: analysis and recommendations for public policy 1998] и многие другие экспериментальные направления программы ЭКО. С появлением метода клонирования остались нерешенными такие проблемы, как возможность влияния биологического возраста ядра соматической клетки-донора генома на клонированный организм; наличие эпигенетических факторов; эффект влияния импринтированных генов [Курило Л. Ф., Шилейко Л.В., 2002]. В настоящее время большинство ученых выступает против клонирования человека, считая, что это направление биомедицинских технологий отнимает у человека право на личную неприкосновенность [Иванов В. И. и др., 2002]. С появлением методов ИКСИ, МЕЗА, ПЕЗА, ТЕЗЕ, ТЕЗА возникли две основные проблемы. Первая заключалась в возможном генетическом риске ИКСИ. Это предположение не было оправдано результатами проведенного исследования кариотипов детей, рожденных с помощью ИКСИ и детей, зачатых естественным путем, так как была выявлена примерно одинаковая частота хромосомных нарушений в кариотипах детей первой и второй групп [Nagy Z. et al., 1998]. Вторая проблема возникла в результате выявления высокого риска бесплодия у сыновей из-за микроделеции в субрегионах AZF а, в, с У-хромосомы [Page D. et al., 1999]. В этих случаях супружеским парам предлагается применение метода ПГД в программе ЭКО для переноса эмбрионов только женского пола, но здесь опять встает вопрос об определении пола преимплантационного эмбриона, а также о разрушении незатребованных эмбрионов, или предоставления эмбрионов для различных экспериментальных исследований, что в наши дни вызывает широкое обсуждение и не приводит членов общества к единому мнению [Dawson К., 1990]. В настоящее время поднимаются вопросы о статусе эмбриона человека, то есть об определении стадии развития эмбриона, при котором он приобретает статус человека, человеческой личности, имеющей право на уважение его человеческого достоинства и на защиту его жизни и здоровья. Широко обсуждается предельный возраст эмбриона, допустимый для использования эмбриона в эксперименте. Подчеркивают, что это, как правило, период от момента оплодотворения до 14-го дня (начало формирования первичной полоски, элементов нервной системы) [Cohen J., Edwards R. 1986]. Из-за недостаточной изученности медицинских, биологических, правовых, социальных и морально-этических аспектов данной проблемы невозможно прогнозировать последствия манипуляций с эмбрионами человека. Это является основной причиной отсутствия единой оценки правового "статуса" эмбриона человека [Курило Л. Ф., 1997]. Кроме того, в разных странах проводят широкое о допустимости разрушения неиспользованных эмбрионов и проведения исследований с эмбрионами [Курило Л. Ф., 2003].
Ранее, при отсутствии метода криоконсервации, супружеские пары с оставшимися после ПЭ эмбрионами имели 3 выбора: разрушить эмбрионы; передать эмбрионы другим, нуждающимся в эмбрионах, супружеским парам для ПЭ без финансовой выгоды; передать эмбрионы для проведения на них строго ограниченных исследований: либо для отработки условий программы ЭКО, в том числе методов криоконсервации, либо для отработки условий преимплантационной генетической диагностики. Каждый из этих выборов имеет ряд недостатков в зависимости от взглядов отдельных супружеских пар. Относительно этических и правовых (законодательных) проблем, возникающих перед врачами и их пациентами, перед обществом в целом, при осуществлении репродуктивных технологий (РТ), вопрос о выборе пациентами определенной позиции по этим сложным и важным проблемам упирается в проблему их информированности по обсуждаемой теме. Кроме того, пациенты могут поменять свое решение некоторое время спустя после сделанного выбора, т.к. одно из главных правил биомедицинской этики — они имеют право отозвать свое информированное согласие на проведение определенной процедуры РТ, как и любого медицинского вмешательства вообще. Криоконсервация дает возможность вернуться к решению вопроса о судьбе эмбрионов в будущем. Пациентки, не забеременевшие в циклах программы ЭКО, могут предпочесть использование своих замороженных эмбрионов в следующих циклах. Кроме того, при желании пациентов отдать свои криоконсервированные эмбрионы другим супружеским парам, отпадает необходимость строгой временной координации циклов пациенток и реципиентов.
В намерения любой пациентки, проходящей программу ЭКО и ПЭ, входит по-возможности повысить эффективность программы ЭКО. Поэтому многие из них принимают решение перенести большое количество эмбрионов в полость матки за один цикл. Это повышает риск наступления многоплодной беременности, и, следовательно, повышает вероятность самопроизвольных выкидышей, подвергая опасности жизнь и здоровье матери и эмбрионов [Леонов Б. В. и др., 1995]. При наступлении многоплодной беременности ранее рекомендовали применение метода редукции избыточного количества эмбрионов, который неоднократно обсуждался и являлся неоднозначным в этическом плане. Некоторые супружеские пары не дают своего согласия на проведение редукции числа имплантированных эмбрионов из-за религиозных или иных взглядов, тем самым подвергая риску здоровье пациентки и риску нарушения нормального протекания беременности. В настоящее время большинством соответствующих международных институтов рекомендовано переносить 2-3 эмбриона с учетом индивидуальных особенностей женщины [Englert J. et al., 2003]. С появлением криоконсервации появилась возможность переносить женщинам лишь 2-3 эмбриона, а остальные подвергать замораживанию для использования в будущем в последующих циклах, что позволяет снизить риск развития многоплодной беременности.
Программа экстракорпорального оплодотворения и перенос эмбрионов человека
При гормональной стимуляции суперовуляции пациенток в программе ЭКО и ПЭ использовали различные комбинации препаратов. Для пациенток с возрастом 33 лет и моложе после овуляции применяли Lupron (фирмы Esurge) 225 единиц один раз в день (или 300 единиц, в зависимости от протекания стимуляции). Для пациенток старше 33 лет стимуляцию суперовуляции проводили двумя способами: либо с использованием Lupron после овуляции 225 единиц дважды в день в течение 10-ти дней; либо с применением таблеток препаратов эстрогена (фирмы Freedom Drug) в течение 4-х недель и 225 единиц микро-Lupron или Antigon (фирмы Organon) после овуляции 225 единиц дважды в день в течение 10-ти дней. В процессе стимуляции суперовуляции проводили гормональный и УЗ-мониторинг пациенток.
При размере фолликулов 17-20 млм и (или) при показателе Е2=1600-1800 пг/мл, вводили хорионический гонадотропин (XT) Profaci (фирмы Serono), и через 36 часов проводили трансвагинальную пункцию яичников (ТВП) с помощью игл Asch Ovum Needle (фирмы Cook, Obgyn). Приготовление всех сред проводили за день до ТВП для достижения их необходимой эквилибрации в инкубаторах в присутствии 5.5% С02 в воздухе при температуре 37.1С и влажности 91-93% [Bongso А., 1999; Keel В. et al., 2000]. Во время аспирации фолликулов использовали среду с гепарином HTF-Hepes-буфер (фирмы Sage). При низком количестве фолликулов промывали каждый фолликул 2-3 раза для сбора всех ооцитов без потерь. Ооциты идентифицировали под микроскопом фирмы Nikon/Fryer Co., отмывали их в среде аспирации Asp media (фирмы Vitrolife) в чашках Falcon 3002 (фирмы Mid Atlantic Diagnostics). С помощью пастеровских пипеток (фирмы Fisher) ооциты переносили в чашки Falcon 3037 (фирмы Mid Atlantic Diagnostics), содержащие среду для оплодотворения G-Fert (фирмы Vitrolife). Все среды, используемые для ооцитов и эмбрионов, покрывали слоем эквилибрированного минерального масла (фирмы Sage).
В тех случаях, когда ооциты подвергали витрификации, очищение от клеток яйценосного бугорка проводили с помощью фермента гиалуронидазы (hyaluronidase) (фирмы Sigma), после чего ооциты витрифицировали и хранили в жидком азоте для использования их в крио цикле (группа 4). Анализ эякулята проводили по стандартной методике ВОЗ [World Health Organization, 1999]. Эякулят центрифугировали в градиенте Перколла [Gorus F., Pipeleers D., 1981] с использованием 45% и 90% Перколла ( фирмы Conception Technologies), либо применяли метод swim up, либо просто промывали средой G-Fert при низких показателях эякулята. В тех случаях, когда эякулят имел нормальные параметры, такие как концентрация сперматозоидов: 20 и более млн/мл [World Health Organization 1999] , подвижность: 40% и более [Jeulin С. et al., 1986], частота проникновения сперматозоидов в ооцит составляла 25% и более [Liu D., Baker Н., 1994], а также доля нормальной морфологии сперматозоидов: 15% норм, и более [Jeulin С. et al., 1986; Krueger Т. et al., 1988; Liu D., Baker R, 1992], проводили простое оплодотворение. Эякулят добавляли в чашки, содержащие ооциты в среде G-Fert, в расчете 50-100 тыс. на 1 мл среды. Оплодотворение ооцитов проводили через 4-6 часов после ТВП.
При наличии медицинских показаний для проведения ИКСИ с целью удаления клеток cumulus oophorus использовали фермент гиалуронидазу и полимер ПВП (фирмы Medicult) для отбора сперматозоидов. ИКСИ проводили по стандартной применяемой методике с помощью инвертированного микроскопа фирмы Nikon/Fryer Со. с оптикой Намарского, имеющего стойки для микроманипуляторов и подогреваемый столик [Palermo G. et al., 1992]. Для выполнения ИКСИ использовали 2 инъектора: присоска слева, holding pipet, (фирмы Humagen), контролируемая подачей минерального масла Sage, необходимая для удержания ооцита в нужном положении (полярное тельце в положении 7 или 11 часов) [Blake М. et al., 2000], и микроигла, ICSI pipet, (фирмы Humagen), контролируемая N02 газом. В центре чашки ИКСИ Falcon 1009 (фирмы Mid Atlantic Diagnostics) помещали каплю ПВП со сперматозоидами, а вокруг нее - пронумерованные капли с ооцитом в каждой из них в среде для микроманипуляции G-Mops (фирмы Vitrolife). Сперматозоид обездвиживали с помощью микроиглы, засасывали в микроиглу со стороны хвоста и осуществляли активацию цитоплазмы ооцита и инъекцию сперматозоида в ооцит.
Через 16-18 часов после оплодотворения оценивали результаты. При обычном оплодотворении очищение от клеток cumulus oophorus проводили с помощью микропипеток с диаметром кончика 150 мкм (фирмы Mid Atlantic Diagnostics). Эмбрионы, содержащие 2 пронуклеуса, отмывали от сперматозоидов и переносили в чашки Falcon 3037 со средой для роста G1 (фирмы Vitrolife). Для установления результатов ИКСИ эмбрионы с 2 пронуклеусами, уже лишенные клеток cumulus oophorus, также переносили в среду G1. При малом количестве эмбрионов у пациентки (от 1-го - до 4-х) ПЭ обычно проводили на 2-ой или 3-ий дни. В основном, если было получено большое количество эмбрионов, на 3-ий день эмбрионы, содержащие 6 и более клеток, переносили в среду роста G2 (фирмы Vitrolife) с помощью микропипеток с диаметром кончика 200 мкм (фирмы Mid Atlantic Diagnostics). ПЭ осуществляли на день 5 (группа 3) с выбором лучших 2-3 бластоцист (класс А) или морул (класс В).
Перед ПЭ проводили микроманипуляционный хетчинг (assisted hatching) для пациенток с ИКСИ, пациенток с возрастным фактором, пациенток, имевших 3 и более неудачных попыток ЭКО и ПЭ, а также при низких морфологических показателях эмбрионов. С этой целью выбранные для ПЭ эмбрионы помещали в каплю среды G-Mops, покрытую минеральным маслом в чашке Falcon 1009. На микроманипуляционном инвертированном микроскопе использовали присоску для удержания эмбриона в нужном положении; а с помощью иглы, PZD pipet, (фирмы Humagen) прокалывали zona pellucida в положении от 2-х до 10-ти часов; освобождали эмбрион от присоски и делали разрез проколотого участка эмбриона за счет его трения об острый угол присоски.
Сравнение частоты наступления беременностей и частоты имплантации в результате переноса медленно криоконсервированных и витрифицированных бластоцист в крио циклах
Исходя из полученных р-величин можно заключить, что значимыми различиями характеризуются результаты частоты наступления беременностей в группах 1 и 2 и в группах 1 и 3, как и частоты имплантации в группах 1 и 2 и в группах 1 и 3. При оценке р-величины данных в группах 2 и 3 при частоте наступления беременностей и имплантации выявляются сходные результаты. Частота наступления беременностей в группе 2 возрастает в 2.4 раза по сравнению с группой 1, в группе 3 - в 2.8 раза по сравнению с группой 1. Что касается имплантации, то ее частота возрастает в 4.3 раза в группе 2 по сравнению с группой 1, а в группе 3 — в 5.4 раза по сравнению с группой 1.
Возрастание частоты наступления беременностей (в 1.2 раза) и имплантации (в 1.3 раза) в контрольной группе 3 по сравнению с группой 2 не является статистически значимым и имеет несколько объяснений. Во-первых, как уже было отмечено, эмбрионы с лучшей морфологией были перенесены в полость матки в предыдущем цикле ЭКО, а во-вторых, эмбрионы при криоконсервации подвергаются воздействию криопротекторов и изменениям температуры, что само по себе является дополнительным стрессом и отражается на их жизнеспособности.
Высокая частота выживаемости витрифицированных бластоцист (100%) позволяет размораживать лишь необходимые для ПЭ эмбрионы; планировать дальнейшие крио циклы пациенток в зависимости от количества имеющихся у них замороженных эмбрионов, а также прогнозировать частоту наступления беременностей и частоту имплантации, основываясь на результатах их предыдущих циклов и на градации витрифицированных эмбрионов.
Как видно из таблицы 7, при переносе размороженных витрифицированных бластоцист достаточно переносить в полость матки в среднем 2.2 эмбриона с такими результатами, как частота наступления беременностей, составляющая 42.9% (п=35); частота имплантации - 29.9% (п=77). Таким образом предотвращается риск многоплодной беременности. Эти высокие показатели позволят повысить эффективность циклов ЭКО пациенток с СПКЯ и СГЯ, а данный подход к программе ЭКО, то есть перенос не более 2-3 эмбрионов с учетом индивидуальных особенностей женщины, рекомендуется соответствующими международными институтами [Englert J. et al, 2003].
В соответствии с литературными данными, 40-50% эмбрионов от общего полученного количества эмбрионов способны формировать бластоцисты к дням 5 и 6; а примерно 40-50% от этих сформированных бластоцист успешно имплантируются и дают начало развитию плода [Dokras A. et al., 1993; Hardy К., 1993; Janny L., Menezo Y., 1994; Janny L., Menezo Y., 1996]. Следовательно, можно предположить, что одного цикла ЭКО, то есть одной трансвагинальной пункции яичников будет достаточным для наступления 2-х — 3-х беременностей. При высокой частоте выживаемости эмбрионов пациентки будут иметь больше шансов на успех в крио циклах, а также возможность планировать семью. Можно предположить, что применение витрификации, как единственного метода криоконсервации ооцитов и эмбрионов в программе ЭКО и ПЭ, позволит повысить частоту наступления беременностей и частоту имплантации почти до традиционных уровней в циклах ЭКО.
При анализе результатов криоконсервации бластоцист было уделено большое внимание методам подготовки пациенток 1 -ой и 2-ой группы к крио циклам, которые приведены в таблице 10,
Из полученных нами данных некорректно делать какие-либо обоснованные выводы, поскольку приведено не высокое число случаев, и частота наступления беременностей в зависимости от метода подготовки пациенток к крио циклам практически не отличается между группами. Представляется интересным вернуться к этой теме в будущем при наличии большего количества наблюдений.
В настоящей работе группа 4 состояла из 10 пациенток, 7 из которых являлись реципиентами (со средним возрастом 41 год) и использовали донорские витрифицированные ооциты (со средним возрастом доноров при криоконсервации их яйцеклеток 27.4 лет). У 3-х пациенток были использованы их собственные ооциты, замороженные методом витрификации. Средний возраст этих пациенток составил 31 год. Все ооциты были разморожены, оплодотворены с помощью ИКСИ с проведением ПЭ на день 2 или 3, с результатами, представленными в таблице 11.
Градация перенесенных эмбрионов в группе 4 распределилась следующим образом: 14 эмбрионов класса А, 21 эмбрион класса В и 5 эмбрионов класса С.
К сожалению, из-за небольшого количества пациенток и использованных витрифицированных ооцитов, а также из-за переноса эмбрионов в группе 4 на их ранних стадиях развития не представляется возможным сравнивать результаты по женщинам группы 4 с таковыми контрольной группы 3 с применением статистических функций. Однако в данном исследовании стоит обратить внимание на частоту выживаемости ооцитов и их оплодотворения. В соответствии с приведенными ранее публикациями частота выживаемости медленно криоконсервированных ооцитов составляет 20-30% [Porcu Е. et al., 1997; Tucker М. et al., 1996; Tucker M. et al., 1998; Young E. et al., 1998]. С помощью применения метода витрификации в группе 4 выжили 61 из 66 ооцитов (92.4%). Также на основании литературных данных частота оплодотворения зрелых ооцитов в программе ЭКО составляет 80-90% [Liu J. et al., 1995]. В нашей работе частота оплодотворения размороженных ооцитов составила 83.6%, что является нормальным результатом программы ЭКО.
