Введение к работе
Актуальность проблемы. В естественных условиях произрастания растения часто оказываются под действием стрессов вызываемых засухой, засолением, избыточной освещенностью, высокими или низкими температурами и другими абиотическими факторами. Все абиотические воздействия сопровождаются образованием активных форм кислорода (АФК), токсичных для растительных клеток. Для нейтрализации АФК растения выработали целый ряд защитных механизмов. К ним относятся возрастание активности ферментов таких, как супероксиддисмутаза (EC 1.15.1.1, СОД), аскорбатпероксидаза (EC 1.11.1.11, АсП), глутатионредуктаза (EC 1.6.4.2, ГР) и другие, а также синтез низкомолекулярных антиоксидантов (аскорбат, глутатион, каротиноиды и антоцианины) (Inze D. and Van Montagu M., 1995).
Внедрение генов, кодирующих синтез антиокислительных ферментов, - перспективный способ получения растений, обладающих толерантностью ко многим стрессам (Gusta L.V. et al., 2009; Inze D. and Van Montagu M., 1995). В различных исследованиях было продемонстрировано, что повышенной устойчивостью к окислительному стрессу обладают растения-трансформанты с суперэкспрессией единичных генов супероксиддисмутазы, аскорбатпероксидазы, глутатион-S-трансферазы, глутатионредуктазы и др. В то же время, остается мало изученным действие окислительного стресса на основные структурно-функциональных системы индивидуальных клеток.
Настоящая работа направлена на решение одной из актуальных проблем современной биотехнологии – изучение клеточных механизмов, обеспечивающих защиту растений от действия оксидативного стресса.
Первичным ответом на действие АФК в клетке является синтез супероксиддисмутаз (СОД) (Fe-SOD, Mn-SOD и Cu/Zn-SOD), основная функция которых заключается в ферментативном превращении супероксида (О2-) и воды в перекись водорода (H2O2), нейтрализуемую затем другими ферментами, в частности, аскарбатпероксидазой. Хлоропласты наиболее подвержены риску токсических повреждений, вызываемых АФК, так как молекулярный кислород в процессе фотовосстановления, происходящего в фотосистеме I, получает дополнительный электрон и превращается в супероксид (О2-). В геноме арабидопсиса содержится 7 генов, кодирующих различные виды и изоформы СОД. Установлено, что Fe-SOD2 и Fe-SOD3 локализуются в хлоропластах. Показано, что они формируют гетеромерный белковый комплекс с нуклеоидом хлоропластов. Локализация Fe-SOD1, установленная путем трансляционного слияния с GFP белком, свидетельствует о его наличии в цитоплазме и ядре, причем установлено, что экспрессия Fe-SOD1 в антисенс-ориентации не приводит к нарушению структуры пластид, в отличие от аналогичных экспериментов с Fe-SOD2 и Fe-SOD3 (Myouga et al., 2008). В настоящее время остаются малоизученными многие аспекты, связанные с особенностями влияния локализации продуктов экспрессии введенных генов, а также с влиянием внедренных генов на структурную организацию клеточных компартментов. Исходя из роли супероксиддисмутаз в антиокислительной защите структурной организации пластид, принципиальное значение имеет вопрос - может ли экспрессия цитоплазматической Fe-SOD приводить к изменениям структуры компартментов клетки при перенаправлении ее в хлоропласт.
Цель работы - изучить влияние экспрессии гена Fe-зависимой супероксиддисмутазы с сигнальной последовательностью Rbsc на структурную организацию хлоропластов трансгенных растений табака и томата при действии окислительного стресса.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Получить трансгенные растения томата и табака, экспрессирующие ген Fe-SOD1, кодирующий цитоплазматическую Fe-зависимую супероксиддисмутазу из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. с сигнальной последовательстью гена rbsc гороха (Pisum sativum L.) для локализации продукта в хлоропластах;
-
Измерить активность супероксиддисмутазы у трансгенных растений томата и табака с экспрессией гена Fe-SOD;
-
Изучить влияние экспрессии гена Fe-SOD1 у трансгенных растений томата и табака на пролиферативную активность клеток меристемы корня;
-
Изучить влияние экспрессии гена Fe-SOD1 у трансгенных растений томата и табака при таргетинге продукта в пластиды на структурно-функциональную организацию клеток фотосинтезирующих тканей;
-
Изучить влияние экспрессии гена Fe-SOD1 на физиологические и структурные характеристики трансгенных растений томата при воздействии абиотических факторов (засоление, УФ-радиация), генерирующих образование в клетке АФК.
Научная новизна результатов и практическая значимость работы. Впервые на основе российского сорта томата и модельного растения табака (Nicotiana tabacum L.) были получены независимые трансгенные линии, содержащие ген Fe-SOD1 с сигнальной последовательностью, обеспечивающей накопление продукта в пластидах. Впервые продемонстрировано, что экспрессия гена Fe-SOD1 из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. в трансгенных растениях томата и табака вызывает увеличение суммарной активности супероксиддисмутазы, а также существенные структурные изменения (размера хлоропластов и структуры ламеллярных тилакоидов, количества и размера крахмальных зерен, пластоглобул, нуклеоидов на один срез) в пластидах клеток фотосинтезирующих тканей, а также пролиферативной активности клеток корня. Установлено, что экспрессия гена Fe-SOD1 в трансгенных растениях томата вызывает повышение устойчивости к УФ-облучению и солевому стрессу. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об эффективности применения стратегии изменения таргетинга цитоплазматической супероксиддисмутазы в пластиды. Трансгенные растения табака и томата могут быть использованы не только в различных фундаментальных исследованиях, но иметь и прикладное значение.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на IX молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2009), III Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010), международной научной конференции "Современные аспекты генетической инженерии растений" (2011), Всероссийской научной конференции с международном участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (2013), научной конференции «Физиология растений и микроорганизмов – взгляд в будущее» (2013), а также на Х Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (2013).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, а также списка цитируемой литературы. Работа изложена на 133 страницах, включает 25 рисунков и фотографий, 6 таблиц в тексте диссертационной работы. Библиографический указатель включает 277 источников, из них 259 на иностранном языке.
