Содержание к диссертации
Введение 4
Обзор литературы. 12
Влияние низкодозового облучения людей на частоту хромосомных аберраций в отдаленные сроки после лучевого воздействия.
Влияние низкодозового облучения людей на радиочувствительность хромосом в отдаленные сроки после лучевого воздействия.
Влияние возрастного фактора на спонтанную частоту генетических нарушений в клетках человека.
Влияние возрастного фактора на чувствительность генома человека к мутагенам.
Материалы и методы. 65
Характеристика обследованных групп людей. 65
Приготовление метафазных препаратов лимфоцитов крови.
Облучение образцов крови. 71
Получение биотинилированных ДНК зондов, специфичных к хромосомам человека.
Приготовление препаратов метафазных хромосом методом флуоресцентной гибридизации in situ.
Статистическая обработка результатов. 75
Результаты и обсуждение. 76
Частота спонтанных хромосомных аберраций нестабильного типа в лимфоцитах людей контрольной и экспонированной групп.
1. Влияние низкодозового облучения на частоту спонтанных ХА. 76
2. Влияние возраста на частоту спонтанных ХА. 80
Частота стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах людей контрольной и экспонированной групп.
1. Влияние низкодозового облучения на частоту стабильных ХА. 95
2. Влияние возраста на частоту стабильных ХА. 98
Частота хромосомных аберраций, индуцированных при облучении лимфоцитов in vitro, у людей контрольной и экспонированной групп.
1. Влияние низкодозового облучения людей на частоту индуцированных in vitro ХА.
Влияние возраста на частоту индуцированных in vitro ХА.
Заключение. 118
Выводы. 126
Список литературы. 127
Введение к работе
Актуальность проблемы. Использование в 20 веке ионизирующей радиации в военных, промышленных и медицинских целях привело к повышению радиационной нагрузки на отдельные контингенты людей. Различные аварийные ситуации ещё больше увеличили радиационный фон планеты и массовость облучения людей, что потребовало прогнозов в отношении возможных отдаленных медико-биологических эффектов для человеческой популяции. Последствия действия на человека ионизирующей радиации в относительно больших дозах достаточно хорошо изучены. Однако большинство радиационных воздействий от техногенных источников характеризуются малыми дозами и малыми мощностями доз. В этом случае трудно оценить риск негативных эффектов для здоровья человека с помощью прямых эпидемиологических наблюдений. Изучение нарушений, которые возникают в клетках в ответ на такое облучение, становится весьма актуальным, так как оно позволяет понять начальные этапы процессов, приводящих в дальнейшем к развитию опухолевых и неопухолевых форм отдаленной лучевой патологии.
A priori понятно, что повреждения ДНК не могут не отражаться на функциях клетки, на ее жизнеспособности, а следовательно, и на полноценности тканей и, в конечном итоге, на состоянии здоровья. Комплексная и мониторная оценка состояния клеточного генома людей, подвергшихся низкодозному облучению, по уровню ХА представляется продуктивным подходом к оценке потенциальной опасности этого воздействия для облучённых людей.
Помимо морфологической характеристики генома облучённых людей по уровню ХА представляется актуальным для эпидемиологических прогнозов исследование его функциональной полноценности. Одним из подходов к решению этого вопроса является, на наш взгляд, изучение стабильности хромосом лимфоцитов при тестирующем облучении этих клеток in vitro. Исследования такого рода весьма немногочисленны (Бочков Н. П., Пилосов Р. А., 1968; Чудина А. П., 1968; Sasaki М. S. et al, 1970; Воробцова И. Е. и др., 1995 Ь; Колюбаева С. Н. и др., 1995; Кузьмина Н. С, Сусков И. И., 2002; Аклеев А. В. и др., 2004).
По мере увеличения срока между имевшим место низкодозовым облучением и сроком регистрации различных нарушений генома существенное значение для оценки цитогенетических последствий такого воздействия может приобретать возраст обследуемых лиц. Известно, что в процессе естественного старения, так же как и после радиационного воздействия, в клетках увеличивается пул мутационных событий (Кузнецов А. И. и др., 1980; Воробцова И. Е. и др., 2000; Мельнов С. Б. и др., 2004; Воробцова И. Е. и др., 2004 a; Bender М. et al, 1989; Cole J. et al, 1991; King С M. et al, 1994; Tucker J. D. et al, 1994). Сравнительное исследование возрастной динамики уровня различных ХА у лиц, в прошлом облучённых, и контрольных позволит оценить вклад факторов «облучение» и «возраст» в наблюдаемые эффекты. При этом влияние этих факторов может быть неодинаковым на различные типы ХА: стабильные - нестабильные; спонтанные - индуцированные in vitro.
В настоящее время показано, что спонтанная частота ХА является показателем риска развития онкологических и других заболеваний у человека (Hagmar L. et al, 1994; Smerhovsky Zs. et al, 2001; Воробцова И. E., Семенов А. В., 2006), то есть существует связь между уровнем первичных нарушений в клетках (ХА, мутации, нестабильность) и состоянием здоровья. Выявление роли экзогенных (облучение) и эндогенных (возраст) факторов в возникновении этих нарушений и, как следствие, в формировании медико-биологических последствий низкодозового облучения для человека является актуальной задачей радиационной медицины. Представление о спонтанном уровне различных ХА (стабильных и нестабильных) необходимо и в практической радиобиологии для проведения корректной биодозиметрии как в ранние (по частоте нестабильных ХА), так и в отдаленные (по частоте стабильных ХА) сроки после облучения с учетом возрастного уровня этих аберраций.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось установление закономерности влияния низкодозового радиационного воздействия и возраста на базовый уровень ХА в лимфоцитах человека и на стабильность их генома при облучении in vitro.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Оценить спонтанную частоту нестабильных ХА, выявляемых рутинным методом, в лимфоцитах лиц, подвергавшихся в прошлом неконтролируемому низкодозовому радиационному воздействию (экспонированная группа), по сравнению с людьми контрольной выборки;
2. Сравнить уровень стабильных ХА, выявляемых методом FISH, у лиц экспонированной и контрольной выборок;
3. Оценить радиочувствительность (стабильность) генома лимфоцитов по частоте индуцированных ХА при облучении in vitro в дозе 1,5 Гр гамма-излучения у этих же групп людей;
4. Изучить влияние возраста на частоту указанных типов ХА в обеих группах.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в рамках одной работы проведено параллельное исследование влияния двух факторов: экзогенного (низкодозового облучения) и эндогенного (возраста) на базовый уровень различных ХА (нестабильного и стабильного типов) в лимфоцитах человека и на стабильность их генома, оценённую по критерию частоты ХА, индуцированных гамма-излучением in vitro. Показано, что: - возрастное накопление ХА более выражено у лиц экспонированной группы по сравнению с контрольной, при этом в обеих группах уровень стабильных ХА увеличивается с возрастом быстрее, чем уровень нестабильных ХА;
- в контрольной группе наблюдается тенденция к возрастному увеличению радиочувствительности лимфоцитов по критерию нестабильных ХА;
- в экспонированной группе радиочувствительность лимфоцитов достоверно уменьшается с возрастом из-за разнонаправленного характера её изменения у детей и взрослых: у детей радиочувствительность лимфоцитов повышена по сравнению с детьми контрольной группы, а у взрослых - снижена по сравнению с соответствующей контрольной группой;
- низкодозовое облучение людей меняет возрастную динамику как спонтанных ХА, так и индуцированных in vitro.
Теоретическое значение работы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что низкодозовое облучение ускоряет процесс естественного старения человека, оцениваемого по уровню стабильных и нестабильных ХА в лимфоцитах крови, и меняет возрастную динамику стабильности генома, оценённую по частоте индуцированных in vitro ХА.
Практическая значимость результатов.
- Данные по возрастной динамике спонтанного уровня ХА необходимо учитывать при установлении факта неконтролированного облучения человека, особенно если оно осуществляется на основе уровня стабильных ХА.
- Тестирующее облучение лимфоцитов человека in vitro может быть использовано в качестве экспресс-метода для выявления скрытой нестабильности генома. - Нестабильность генома детей, подвергавшихся низкодозовому облучению, может служить основанием для отнесения их к группе повышенного риска развития негативных медицинских последствий, в частности канцерогенных. Положения, выносимые на зашиту.
1. У лиц, подвергавшихся неконтролируемому радиационному воздействию, наблюдается долговременное (даже спустя десятилетия) повышение частоты нестабильных ХА.
2. В отдаленные сроки после облучения частота стабильных ХА повышена у подвергавшихся неконтролируемому радиационному воздействию людей по сравнению с людьми контрольной группы.
3. Возрастное накопление ХА более выражено у лиц экспонированной группы по сравнению с контрольной, при этом в обеих группах уровень стабильных ХА увеличивается с возрастом быстрее, чем уровень нестабильных ХА.
4. Выявлен разнонаправленный характер изменения радиочувствительности лимфоцитов у лиц разного возраста экспонированной группы: у детей радиочувствительность лимфоцитов повышена по сравнению с детьми контрольной группы, у взрослых -снижена по сравнению с соответствующим возрастным контролем.
Апробация работы. Предварительная защита диссертации состоялась на заседании проблемной комиссии отдела клинической радиобиологии ФГУ РНЦ РХТ Росмедтехнологий. Работа была апробирована на V международном экологическом форуме стран Балтийского региона «Экобалтика-2004» (16-18 июня 2004 г., Санкт-Петербург, Россия); Всероссийской научно-практической конференции «Чернобыль: 20 лет спустя. «Социально-правовые и медицинские проблемы граждан, пострадавших в радиационных авариях и катастрофах»» (5-6 апреля 2006 г., Санкт-Петербург, Россия); V Съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (10-14 апреля 2006 г., Москва, Россия); Международной научно-практической конференции (23-25 мая 2007 г., Киев, Украина); Международной конференции «Новые направления в радиобиологии» (6-7 июня 2007 г., Москва, Россия); VI Европейском конгрессе "Healthy and active ageing for all Europeans" (5-8 июля 2007 г., Санкт-Петербург, Россия); Международной школе-конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.Е. Лобашева «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов» (10-13 ноября 2007 г., Санкт-Петербург, Россия).
Публикации. Основные положения диссертации отражены в 9 публикациях: 2 статьях, 7 тезисах докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, методической части, результатов исследования и обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц и 7 рисунков. Список цитированной литературы включает 198 источника, из них 125 иностранных.
