Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Краткая характеристика ультрафиолетового излучения... 11
1.2. Биологические эффекты УФА-излучения 16
1.3. Механизмы образования повреждений ДНК при воздействии УФА-излучения 21
1.4. Заключение 34
Глава 2. Материал и методы 36
Объект исследований 36
Иммобилизация клеток в агарозу 36
Получение нуклеоидов 37
Условия облучения 37
Воздействие п ерекиси водорода 39
Влияние тоничности раствора NaCl 40
Метод ДНК-комет 41
Метод ДНК-га ло 43
Статистический анализ полученных данных 45
Глава 3. Результаты и обсуждение 46
3.1. Сравнительный анализ однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека, подвергшихся воздействию 365 нм УФ-излучения, рентгеновского излучения и перекиси водорода .46
3.2. Сравнительная оценка повреждений ДНК, индуцированных различными генотоксическими агентами, с помощью метода ДНК гало .. 53
3.3. Влияние скавенжеров активных форм кислорода на повреждаемость ДНК в нуклеоидах лимфоцитов крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения.. 59
3.4. Исследование влияния инкубации в гипертонических
растворах NaCl на выход ОР и ЩС ДНК.. 67
Выводы 73
Приложение 1 75
Список литературы
- Биологические эффекты УФА-излучения
- Механизмы образования повреждений ДНК при воздействии УФА-излучения
- Воздействие п ерекиси водорода
- Сравнительная оценка повреждений ДНК, индуцированных различными генотоксическими агентами, с помощью метода ДНК гало
Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно современной международной классификации, УФ-излучение делится на три диапазона: коротковолновый (УФС, 200–280 нм), средневолновый (УФВ, 280–320 нм) и длинноволновый (УФА, 320–400 нм). УФС- и УФВ-фотоны поглощаются ДНК и индуцируют в основном такие повреждения, как циклобутан-пиримидиновые димеры (CPD) и пиримидин-(6-4)-пиримидон фотопродукты ((6-4)-PD) (Mitchell and Karentz, 1993; You et al, 2000; Friedberg et al, 2000; Yoon et al, 2000; Clingen et al, 1995). Однако весь спектр УФС- и ~ 90 % УФB-излучения поглощается озоновым слоем и атмосферой земли. Длинноволновое УФА-излучение, 90 % которого достигает земной поверхности, почти не поглощается ДНК, но передаёт энергию различным хромофорам, таким как меланин, порфирины, хиноны, флавины и т.д., которые действуют как эндогенные фотосенсибилизаторы. В ходе фотоокислительных реакций II типа происходит образование активных форм кислорода (АФК), таких как синг-летный кислород, cупероксид-анион-радикал, гидроксил-радикал и пероксид водорода (Cadet et al, 2009; Cadet and Douki, 2011; Swalwell et al, 2012). Эти реакции протекают одновременно, однако отношение скоростей этих реакций зависит от природы фотосенсибилизатора и субстрата (Dougherty et al, 1998).
Показано, что длительное воздействие УФА-излучения вызывает лизосомальную дисфункцию в фибробластах кожи человека (Lamore et al, 2013), онкотрансформацию в культивируемых кератиноцитах человека (He et al, 2006) и развитие сарком кожи у «голых» мышей (de Laat et al, 1997). Неясна роль УФА-излучения в развитии меланом. Экспериментальные работы свидетельствуют о том, что УФА-излучение не индицирует ме-ланомы у модельных животных (Mitchell et al, 2010), тогда как эпидемиологические данные говорят о наличии положительной корреляции между количеством посещений солярия и частотой заболеваний меланомой у человека (Autier et al, 2011). УФА-излучение, а именно 340–400 нм (известное также как УФА1-излучение), используется для терапевтических процедур (Kerr et al, 2012) и в соляриях. На 365 нм приходится пик фототерапии УФА1-излучением. При этом существуют данные о том, что 365 нм УФ-излучение может иметь даже больший канцерогенный эффект, чем УФВ-излучение (de Laat et al, 1997). Показано, что при этой длине волны наблюдается максимум увеличения частоты заболеваний меланомой (Setlow et al, 1993).
Большинство работ по изучению биологического действия УФА-излучения выполняется на клетках базального слоя кожи. При воздействии УФА-излучения происходит облучение клеток периферической крови, в том числе и лимфоцитов, поскольку дерма богата капиллярами. Лимфоциты периферической крови обладают высокой чувствительностью к генотоксикантам, большой продолжительностью жизни и возможностью перемещения по организму. Показано, что после острого УФА-облучения кожи в относительно низких дозах (10–20 кДж/м2) в лимфоцитах периферической крови голых
мышей регистрируется повышенное количество повреждений ДНК (Svobodov et al, 2012). При наличии заболеваний, ассоциированных с нарушениями работы защитных молекулярных и клеточных систем, наблюдается повышенная чувствительность лимфоцитов к УФА-излучению. Так, лимфоциты периферической крови онкологических больных или пациентов в предраковом состоянии гораздо чувствительнее к УФА-излучению, чем лимфоциты здоровых доноров (Najafzadeh et al, 2012). Тем не менее, до настоящего времени работы, посвящённые изучению ДНК-повреждающего действия УФА-излучения на лимфоциты периферической крови человека, практически отсутствовали в доступной литературе. Отдельные работы по этой теме стали появляться лишь в последнее время (Najafzadeh et al, 2012; Svobodov et al, 2012). Поэтому представлялось актуальным изучить особенности индукции повреждений ДНК лимфоцитов периферической крови человека при воздействии УФА-излучения.
Цель работы состояла в изучении закономерностей образования однонитевых разрывов (ОР) и щелочнолабильных сайтов (ЩС) ДНК в лимфоцитах крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Провести анализ зависимости «доза-эффект» образования ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения;
Сравнить количественный выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в лимфоцитах крови человека с выходом данных повреждений при воздействии рентгеновского излучения и перекиси водорода;
Исследовать влияние скавенджеров гидроксил-радикала (НО) и синглетного кислорода (1О2) на выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения;
Изучить влияние инкубации лимфоцитов крови в гипертонических растворах NaCl, вызывающих ступенчатую депротеинизацию хроматина, на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением.
Положения, выносимые на защиту:
-
365 нм УФ-излучение вызывает дозозависимое увеличение однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека;
-
Основными источниками однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучение являются гидроксил-радикал и синглетный кислород;
-
Количественный выход однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением в лимфоцитах периферической
крови человека, зависит от структурной организации хроматина, защищающего ДНК от атак активных форм кислорода.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведён сравнительный анализ образования ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии трёх различных повреждающих агентов: 365 нм УФ-излучения, рентгеновского излучения и перекиси водорода. Исследовано влияние ска-венджеров гидроксил-радикала – диметилсульфоксида, и синглетного кислорода – азида натрия, на выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. Получены результаты, свидетельствующие о важной роли гидроксил-радикала и синглетного кислорода в образовании этих повреждений ДНК при воздействии 365 нм УФ-излучения. Изучено влияние инкубации в гипертонических растворах NaCl на повреждаемость ДНК лимфоцитов крови человека 365 нм УФ-излучением. Показано, что по сравнению c эффектами в клетках, инкубированных в изотоническом растворе NaCl, статистически достоверное увеличение выхода как спонтанных, так и индуцированных УФA-излучением повреждений ДНК наблюдается при концентрации NaCl, вызывающей диссоциацию линкерного гистона Н1 (0,5 моль/л). Разработана простая, чувствительная и хорошо воспроизводимая модификация метода ДНК-гало для анализа ОР и ЩС ДНК в живых клетках.
Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведённых лабораторией радиационной биофизики ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна с личным вкладом диссертанта в получение представленных в работе материалов не менее 70 %. Результаты работы получены лично автором или же при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной конференции молодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2013) и XIII международной молодёжной научной школы «Проблемы фундаментальной и прикладной радиобиологии (г. Обнинск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 5 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 100 страницах машинописного текста и включают 33 рисунков, 4 таблицы, 1 приложение. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список цитируемой литературы», который содержит 195 ссылок, из них 190 на иностранном языке.
Биологические эффекты УФА-излучения
Положения, выносимые на защиту:
1) 365-нм УФ излучение вызывает дозозависимое увеличение одно-нитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека;
2) Основными источниками однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии 365-нм УФ излучение являются гидроксил радикал и синглетный кислород;
3) Количественный выход однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК, индуцированных 365-нм УФ излучением в лимфоцитах периферической крови человека, зависит от структурной организации хроматина, защищающего ДНК от атак активных форм кислорода. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведён сравнительный анализ образования ОР и ЩС ДНК в лимфоцитах периферической крови человека при воздействии трёх различных повреждающих агентов: 365 нм УФ-излучения, рентгеновского излучения и перекиси водорода. Исследовано влияние скавенжера гидроксил радикала – диметилсульфоксида, и синглетного кислорода – азида натрия, на выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. Получены результаты, свидетельствующие о важной роли гидроксил радикала и синглетного кислорода в образовании этих повреждений ДНК при воздействии 365 нм УФ-излучения. Изучено влияние инкубации в гипертонических растворах NaCl на повреждаемость ДНК лимфоцитов крови человека 365 нм УФ-излучением. Показано, что по сравнению c эффектами в клетках, инкубированных в изотоническом растворе NaCl, статистически достоверное увеличение выхода как спонтанных, так и индуцированных УФA-излучением повреждений ДНК наблюдается при концентрации NaCl, вызывающей диссоциацию линкерного гистона Н1 (0,5 моль/л). Разработана простая, чувствительная и хорошо воспроизводимая модификация метода ДНК-гало для анализа ОР и ЩС в живых клетках.
Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведённых лабораторией радиационной биофизики ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России с личным вкладом диссертанта в получение представленных в работе материалов не менее 70 %. Результаты работы получены лично автором или же при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на международной конференции молодых учёных «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2013) и XIII международной молодёжной научной школы «Проблемы фундаментальной и прикладной радиобиологии (г. Обнинск, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 5 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 100 страницах машинописного текста и включают 33 рисунка, 1 приложение. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Список цитируемой литературы», который содержит 200 ссылок, из них 197 на иностранном языке.
Солнечный свет состоит из непрерывного спектра электромагнитного излучения, который подразделяется на три основных диапазона: ультрафиолетовый, видимый и инфракрасный диапазоны. Ультрафиолетовая область располагается между длинами волн в 100 и 400 нм (Табл. 1). Согласно современной международной классификации, УФ-излучение делится на три диапазона: коротковолновый (УФС, 200-280 нм), средневолновый (УФВ, 280-315 нм) и длинноволновый (УФА, 315-400 нм). УФА-излучение, в свою очередь, подразделяется на УФА2 с длинами волн 315-340 нм и УФА1 с длинами волн 340-400 нм.
Механизмы образования повреждений ДНК при воздействии УФА-излучения
Во время репликации 8-дезоксо-гуанин генерирует трансверсию GC TA в паре с аденином вместо цитозина (Melnikova and Ananthaswamy, 2005; Pinnell, 2003).
Также 8-oxodGuo встречается при окислении ДНК в результате реакций ОН радикала, одно-электронного окислителя или синглетного кислорода с остатком 2-деоксигуанозина (Cadet et al, 1997; Cadet et al, 2003). Жан-Поль Поже и др. (Pouget et al, 2000) показали, что количество образованного FapyGua по сравнению с 8-oxodGua намного меньше в ДНК клеток, облученных УФА-излучением, чем при воздействии гамма-излучения. Жан-Люк Раванат и др. (Ravanat, 2001) предполагают, что основные окислительные реакции, вызванные УФА-излучением, протекают по второму типу фотосенсибилизируемых реакций, то есть, образуя синглетный кислород.
Кроме ядерной ДНК, под действием окислительного стресса, индуцированного УФ-излучением, может изменяться и митохондриальная ДНК. Поскольку репарация ДНК в митохондриях менее эффективна по сравнению с ядром, мутации накапливаются относительно быстро. Мутации, обнаруженные при этом, делеции могут быть опосредованы синглетным кислородом, индуцированным УФА-излучением (Pinnell, 2003).
Образование пиримидиновых ди меров
Поскольку УФС- и УФВ-излучения поглощаются ДНК, то основными образованиями являются циклобутановые пиримидиновые димеры (CPDs) (рис. 11), пиримидин-6,4-пиримидоновые фотопродукты (6-4PPs) и их валентные изомеры Дьюара (P.M. Girard, 2011). Рис. 11. Образование циклобутанового димера тимина. В ходе этой реакции происходит соединение двух оснований по 5,6-двойной углеродной связи с образованием кольца циклобутанового типа.
Маловероятно, что эти фотопродукты образуются при УФА-излучении, так как ДНК не способно поглощать в этом диапазоне. Однако группа Тиррела (Tyrrell) обнаружила индукцию CPDs у бактерий при воздействии 365-нм УФА-излучения (Tyrrell, 1973). Позже было показано, что УФА-излучение индуцирует CPD в клетках млекопитающих (Perdiz et al, 2000; Besaratinia et al, 2005; Besaratinia, et al 2011; Freeman et al, 1990; Rochette et al, 2003; Zhang et al, 1997) и в коже человека (Mouret et al, 2006; Young et al, 1998; Freeman et al, 1989; Mouret et al, 2011; Tewari et al, 2013).
УФА-излучение примерно в 20 раз интенсивнее УФВ-излучения на земной поверхности, поэтому CPD образуются при УФА-излучении при непосредственном поглощении излучения (Mouret et al, 2010; Douki et al, 2003; Mouret et al, 2006; Jiang et al, 2009; Girard et al, 2011).
В таблице 3 представлено распределение пиримидиновых димеров (ТТ – тимин-тимин, ТС – тимин-цитозин) внутри ДНК клеток CHO при воздействии УФА- и УФВ-излучений, выраженное в количестве повреждений на 109 пар оснований.
Таблица. 3. Распределение пиримидиновых димеров, индуцированных УФА- и УФВ-излучением, в ДНК клеток CHO, выраженные в количестве поражений на 109 пар оснований (
Так же показано, что при УФА-излучении выход CPD намного больше, чем выход повреждений, образуемых окислением, таких как 8-оксогуанин (Kielbassa et al, 1997; Douki et al, 2003; Mouret et al, 2006; Courdavault et al, 2004). Отношение этих выходов приблизительно равно 5 и слабо зависит от типа клеток, однако для меланоцитов это отношение равно 1,4 (Mouret et al, 2012). Неправильная репарация этих повреждений приводит к мутациям в эпидермальных клетках, которые вызывают развитие опухолевых клеток. Было показано, что среди циклобутановых димеров тимина, тимин-цитозин (ТС) и цитозин-цитозин (СС) димеры самые мутагенные. В гене р53 облученных УФ-излучением опухолевых клеток чаще всего обнаруживают мутации ТС TT и CC TT (Ischihashi et al, 2003).
Недавние исследования подтвердили, что УФА- и УФВ-излучения индуцируют мутации по схожим механизмам (Kappes et al, 2006). Авторы выдвинули гипотезу, по которой УФА-излучение более мутагенно из-за менее выраженного защитного ответа на повреждение ДНК. Бесаратиния с соавт. Показали, что хотя CPD и образуется в гене р53 при воздействии УФА- и УФВ-излучений, однако специфичные сайты повреждений различны, таким образом механизм образования CPD различен для этих двух диапазонов длин волн (Besaratinia et al, 2005).
Образование однонитевых разрывов и щелочнолабильных сайтов ДНК Многие работы показывают, что УФ-излучение индуцирует однонитевые разрывы ДНК, которые образуются из щелочно-лабильных повреждений ДНК после облучения (Van Kuijik 1991; Fredrick 1993). Tyrrell доложил об индукции однонитевых разрывов (щелочно-лабильные связи) при воздействии УФА-излучения у ДНК-содержащих фагов (Tyrrell, 1974). Повреждения ДНК, индуцированные УФА- и УФВ-излучением, увеличиваются в дозой излучения (Lehmann et al, 1998). Для УФВ-излучения однонитевые разрывы ДНК обусловлены образованием димерных фотопродуктов между соседними пиримидиновыми основаниями на одной и той же цепи ДНК (Ichihashi et al. 2003). С другой стороны ОР ДНК при УФВ-излучении могут возникать из-за отрыва водорода, опосредованного ОН-радикалом, от С3, С4 и С5 атома углерода 2-дезоксирибозы (Douki et al, 1999; Kielbassa et al, 1997; Pfaum et al, 1998). При УФА-излучении ОН-радикал окисляет пуриновые основания, в то время как отрыв водорода внутри сахаров приводит в большинстве случаем в образованих разрывов цепей (Douki et al, 2004). Синглетный кислород образует 8-оксигуанин как в изолированной, так и в клеточной ДНК, без образования разрывов цепей (Ravanat et al, 2004).
В своей работе Peak и Peak (Peak and Peak, 1991) сравнили выход ОР ДНК на примере клеток P3 при воздействии различных излучений (табл. 4). Очевидно, что при УФА-излучении прямой механизм повреждений меняется на косвенный механизм, механизм сенсибилизации (Peak et al., 1987; Kochevar, 1987; Peak and Peak, 1986).
Воздействие п ерекиси водорода
В данной главе представлены результаты исследования влияния скавенжеров активных форм кислорода (АФК) на выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов крови человека при воздействии 365 нм УФ-излучения. Задачей исследования было изучение вклада основных АФК, повреждающих ДНК при УФА-облучении клеток, а именно гидроксил радикала (HО) и синглетного кислорода (1О2), на выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека. В качестве скавенджера HО был взят диметилсульфоксид (ДМСО), а в качестве скавенджера 1О2 – азид натрия (NaN3). Для оценки степени повреждённости генома, обусловленной ОР и ЩС ДНК, использовали метод ДНК-комет и метод ДНК-гало. Выбор нуклеоидов в качестве модели был обусловлен несколькими причинами:
1) Хотя облучение лимфоцитов проводилось при низкой температуре (4С), когда метаболические процессы клеток сильно замедленны, мы не могли полностью исключить вклад эксцизионной репарации ДНК и свободных радикалов, продуцируемых в митохондриях, в наблюдаемые эффекты. Так, в работе Bock et al (1999) было показано, что в культуре лимфобластов человека эффективная репарации УФА-индуцированных повреждений ДНК происходит даже при 4С;
2) NaN3 и ДМСО в высоких концентрациях цитотоксичны, что не может не иметь своего влияния на наблюдаемые нами эффекты.
Поэтому исследования влияния скавенжеров АФК на повреждаемость ДНК 365 нм УФ-излучением проводились на нуклеоидах лимфоцитов в буфере, содержащем ингибитор нуклеаз (Na2ЭДТА), то есть на модели и в условиях, где вышеперечисленные процессы были полностью исключены.
Результаты исследований показали, что 365 нм УФ-излучение в дозах 10, 20 и 50 кДж/м2 индуцирует доза-зависимое увеличение ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах, регистрируемых методом ДНК-комет (рис. 28, кривая 1). Добавление в буфер для облучения скавенджеров АФК заметно снижало выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах (рис. 28, кривые 2 и 3).
Рис. 28. Зависимости изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без скавенджеров АФК (1), с добавлением 100 ммоль/л азида натрия (2), с 10% ДМСО (3), полученные с помощью метода ДНК-комет. Сравнение линейных угловых коэффициентов, характеризующих прирост эффекта на единицу дозы, показывает, что азид натрия и ДМСО снижают выход ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением в нуклеоидах лимфоцитов, в 2,5 и 2,8 раз соответственно (Рис. 29).
Рис. 29. Зависимости изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных 365 нм УФ-излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без скавенджеров АФК (1), с добавлением 100 ммоль/л азида натрия (2), и с 10% ДМСО (23), полученные с помощью метода ДНК-гало. Результаты, полученные с использованием скавенджера HO, были в определённой мере предсказуемы. Известно, что HO без какой бы то ни было селективности повреждает основания ДНК и индуцирует ОР и ЩС (Kawanishi and Hiraku, 2001; Cadet et al, 2009). И хотя выход HO при УФА-облучении невысок, считается, что именно этот высокоактивный радикал главным образом ответственен за индукцию ОР и ЩС ДНК при УФА-облучении (Petersen et al, 2000), в то время как данные, полученные с использованием скавенджера 1О2, были неожиданными. Согласно современным представлениям, 1О2 повреждает преимущественно гуанин с образованием 8-оксо-гуанина (Cadet and Douki, 2011). Однако есть данные, показывающие, что синглетный кислород кроме модификаций оснований способен индуцировать другие типы повреждений ДНК: апуриновые/апиримидиновые сайты (Blazek et al, 1989; Boye and Moan, 1980; Epe et al, 1993) и однонитевые и двунитевые разрывы ДНК (Di Mascio et al., 1990, Devasagayam et al, 1991; Ribeiro et al, 1992). Показано, что однонитевые молекулы ДНК более реакционноспособны с синглетным кислородом, чем двунитевые (Devasagayam and Kamat, 2002), что может привести к двунитевому разрыву в случае атаки однонитевых участков ДНК, образующихся в процессе нормального функционирования хроматина (транскрипция, репликация, репарация) (Gulston, 2004; Eccles, 2011; Holt, 2009). В своей работе Р. Грейнерт и др. показали, что при воздействии УФА-излучения индуцируются дозо-зависимые ДР в G1-синхронизированных кератиноцитах человека (HaCaT) и первичных фибробластах кожи человека (Greinert et al, 2012).
При воздействии УФА-излучения до 80 % повреждений ДНК в живых клетках индуцируется именно 1О2 (Pouget et al, 2000). С учётом того факта, что примерно 30 % повреждений ДНК, индуцированных 1О2, представляют собой ЩС (Nieuwint et al, 1985; Lafleur et al, 1987), а ещё 2–5 % ОР (Di Mascio et al, 1989), можно заключить, что при воздействии УФА-62 излучения 1О2 является не менее важным источником ОР и ЩС ДНК, чем HO, что и было продемонстрировано в наших исследованиях.
На рис. 30 представлены результаты исследований выхода ОР и ЩС ДНК нуклеоидов в зависимости от рентгеновского излучения в дозах 1, 2 и 3 Гр, при этом наблюдается доза-зависимое увеличение ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах, регистрируемых методом ДНК-комет (рис. 30, кривая 1). Добавление в буфер для облучения скавенджеров АФК заметно снижало выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах (рис. 30, кривые 2 и 3).
Рис. 30. Зависимости изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК, индуцированных рентгеновским излучением, в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без скавенджеров АФК (1), с добавлением 100 ммоль/л азида натрия (2), с 10% ДМСО (3), полученные с помощью метода ДНК-комет. Результаты с рентгеновским излучением подтверждают тот факт, что ионизирующее излучение индуцирует свободные радикалы, такие как НО радикал и синглетный кислород.
Результаты исследований исследований выхода ОР и ЩС ДНК нуклеоидов в зависимости от концентрации перекиси водорода представлены на рис. 28. Добавление в буфер скавендера НО радикала заметно снижало выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах (рис. 31, кривая 3), в то время как добавление азида натрия приводило в заметному увеличению выхода ОР и ЩС ДНК (рис. 31, кривая 4).
Сравнительная оценка повреждений ДНК, индуцированных различными генотоксическими агентами, с помощью метода ДНК гало
Результаты с рентгеновским излучением подтверждают тот факт, что ионизирующее излучение индуцирует свободные радикалы, такие как НО радикал и синглетный кислород. Результаты исследований исследований выхода ОР и ЩС ДНК нуклеоидов в зависимости от концентрации перекиси водорода представлены на рис. 28. Добавление в буфер скавендера НО радикала заметно снижало выход ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах (рис. 31, кривая 3), в то время как добавление азида натрия приводило в заметному увеличению выхода ОР и ЩС ДНК (рис. 31, кривая 4).
Зависимости изменений относительного количества ОР и ЩС ДНК при воздействии перекиси водорода в нуклеоидах лимфоцитов периферической крови человека при облучении в буфере без скавенджеров АФК (1), с добавлением 100 ммоль/л азида натрия (2), с 10% ДМСО (3), полученные с помощью метода ДНК-комет. В экспериментах с перекисью водорода в присутствии ДМСО было показано снижение выхода ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов, поскольку известно, что перекись водорода в реакциях Фентона и Габер-Вейса генерирует НО радикал. В присутствии азида натрия наблюдалась обратная реакция – повышение выхода ОР и ЩС ДНК. С одной стороны азид натрия является физическим перехватчиком синглетного кислорода, а с другой стороны, взаимодействуя с НО радикалом, образует азидил радикал (Roberts, 1979; Land and Prutz, 1979; Ali et al, 2005), который в свою очередь вступает в реакцию с кислородом и образует NO. Таким образом, кроме АФК образуются и АФА. А ДНК – основная цель для свободных радикалов, в результате образуются многочисленные повреждения, в том числе одно- и двунитевые разрывы ДНК, различные формы повреждения оснований, такие как 8-оксоГуа, а также сшивки ДНК-белок. Для образования азидил радикала необходимы большие концентрации азида натрия и перекиси водорода (Chen et al, 1999), поэтому такой эффект не наблюдался при воздействии УФА-излучении.
С другой стороны известно, что азид натрия ингибирует каталазу (Bergmeyer et al, 1983), фермент, катализирующий разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. В наших условиях (лизирующий буфер с рН 10, температура 4 С), происходит растворение пероксисомы, в которой находится каталаза. Хотя оптимальное рН для человеческой каталазы - примерно 7,7 (Maehly and Chance, 1954), есть данные, что активность каталазы остается высокой при рН от 4 до 10 (Hochman and Shemesh, 1987; Scott and Hummer, 1960). Таким образом, увеличение повреждающего эффекта перекиси водорода в присутствии азида натрия, по всей видимости объясняется прежде всего ингибированием каталазы. В целом, резкое снижение выхода УФА-индуцированных ОР и ЩС ДНК в нуклеоидах лимфоцитов в присутствии азида натрия и ДМСО свидетельствует о ведущей роли 1О2 и НО в образовании этих повреждений ДНК при воздействии 365 нм УФ-излучения. Повышенная продукция НО и 1О2, повреждающих ДНК лимфоцитов крови при воздействии 365 нм УФ-излучения, косвенно свидетельствует о высокой концентрации в этих клетках хромофоров с максимумом поглощения при этой длине волны. 3.4. Исследование влияния инкубации в гипертонических растворах NaCl на выход ОР и ЩС ДНК.
Как правило, при рассмотрении клеточной защиты от повреждающего действия активных форм кислорода и азота основное внимание обращают на механизмы нейтрализации/детоксикации свободных радикалов, в которые вовлечены ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.), хелаторы редокс-активных металлов, низкомолекулярные антиоксиданты (витамины Е и С, каротин, глутатион и др.), белки с высоким содержанием SH-групп (например, металлотионеины) и т.д. (Blokhina et al, 2003). Гораздо меньше внимания обращают на конформационную защиту хроматина. В то же время хорошо известно, что активный хроматин (эухроматин) в большей степени повреждается свободными радикалами, чем неактивный (гетерохроматин) (Oleinick et al, 1984). Это обусловлено тем, что активно транскрибируемые последовательности не защищены от атак свободных радикалов структурными белками хроматина. Основой процесса самоорганизации хроматина являются слабые взаимодействия его базовых структурных компонентов – ДНК и белков. Изменение ионной силы, например с помощью гипертонических растворов NaCl, приводит к нарушению этих взаимодействий и депротеинизации хроматина (Kobori et al, 2007). Использование растворов NaCl c постепенно повышающейся тоничностью позволят проводить своеобразное, ступенчатое «раздевание» хроматина: при концентрации NaCl 0,35 моль/л происходит диссоциация негистоновых белков; 0,5–0,6 моль/л – негистоновых белков и линкерного гистона; 1,2 моль/л – негистоновых белков, линкерного гистона и коровых гистонов H2A-Н2B; 2 моль/л – полная депротеинизация хроматина (Elia and Bradley, 1992). Использование этого подхода позволяет изучать роль конформации хроматина в защите ДНК от повреждающего действия свободных радикалов.
