Содержание к диссертации
Введение
Глава I. МУТАГЕННОЕ ДЕЙСТШЕ ИНКОШОРИРОВАННЫХ РАДИОНУКЛИДОВ НА СОМАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЩЙХ (обзор литературы) - 16
1.1. Особенности мутагенного действия инкорпорированных радионуклидов 16
1.2. Методы и модели исследования мутагенного действия радиации - 19
1.2.1. Наиболее распространенные методы исследования мутагенеза - 19
1.2.2. Лимфоциты крови - универсальная тест-система для изучения мутагенного действия радиации - 22
1.2.3. Хромосомные аберрации - индикатор мутагенного действия радиации - 26
1.3. Цитогенетическое исследование мутагенного действия внешнего облучения и инкорпориро ванных радионуклидов - 30
1.3.1. Спонтанный уровень хромосомных аберраций и сестринских хроматидных обменов в соматических клетках человека и экспериментальных животных - 30
1.3.2. Цитогенетическое исследование мутагенного действия внешнего облучения и инкорпорированных радионуклидов в эксперименте - 32
1.3.3. Цитогенетическое исследование мутагенного действия внешнего облучения и инкорпорированных радионуклидов у людей - 38
1.3.4. Влияние внешнего облучения и инкорпорированных радионуклидов на частоту сестринских хроматидных обменов в соматических клетках млекопитающих- : - 41
1.4. Цитогенетические изменения и их связь с другими постлучевыми эффектами - 43
I.4.I. Образование аномальных клонов соматических клеток и канцерогенный эффект - 43
1.4.2. Хромосомные аберрации в соматических клетках организма, старение и продолжительность жизни - 49
1.5. Экстраполяция экспериментальных цитогенетических данных на человека - 53
3аклгочение - 54
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ - 57
2.1. Материал исследования и схема эксперимента 57
2.2. Методы исследования - 60
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ - 69
3.1. Цитогенетичеокое исследование мутагенногодействия изучаемых радионуклидов по хромосомным нарушениям, выявляемым при общей окраске хромосом 69
. З.І.І. Цитогенетичеокое исследование действия инкорпорированных Ч9Сси , ,г,У и их
сочетаний - 69
3.1.2. Цитогенетичеокое исследование сочетанного действия 9Sr и /50 - 96
3.1.3. Цитогенетичеокое исследование сочетанного действия инкорпорированных 9SCa с ,37Сд
и изолированного действия 9,У - 102
3.1.4. Цитогенетичеокое исследование действия инкорпорированной JSS - 104
3.2. Цитогенетичеокое исследование мутагенного действия изучаемых радионуклидов по хромосомным нарушениям, выявляемым при дифференциальной окраске хромосом на сегменты - 114
3.3. Сопоставление патогенетических данных с выходом опухолей у опытных животных - 116
3.4. Сопоставление патогенетических данных с гематологическими и с продолжительностью
жизни опытных животных - 121
3.5. Цитогенетическое исследование мутагенного действия изучаемых радионуклидов по количеству сестринских хроматидных обменов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Особенности мутагенного действия инкорпорированных радионуклидов
- Материал исследования и схема эксперимента
- Цитогенетичеокое исследование мутагенногодействия изучаемых радионуклидов по хромосомным нарушениям, выявляемым при общей окраске хромосом
Введение к работе
В настоящее время различные радионуклиды (РН) находят все большее применение в хозяйственной деятельности человека, и их количество растет в окружающей среде: в воде, воздухе, в почве. Это увеличение обусловлено рядом причин: испытанием атомного оружия, увеличением количества АЭС, расширением производства и применения РН в различных отраслях народного хозяйства и в медицине, все большим использованием полезных ископаемых, при котором высвобождается значительное количество естественных РН.
В связи с увеличением количества РН в биосфере возрастает поступление их в организм человека. В то же время известно (Л.М.Грачева, В.Г.Королев, 1977; Т.А.Норец с соавт., 1977; iCcl ВсшЖ ео.,1980 и др.), что инкорпорированные РН обладают мутагенным действием, т.е. индуцируют различные нарушения в генетическом материале клеток. Причем, многие из них, при одинаковой с внешним облучением поглощенной дозе, обладают в несколько раз большим мутагенным эффектом.
Таким образом, в настоящее время, когда использование РН и других видов радиации в хозяйственной деятельности человека постоянно растет, наряду с ростом в окружающей среде и количества химических мутагенов, дополнительное к спонтанному уровню количество индуцированных цитогенетических изменений в клетках организма является для человеческой популяции особенно опасным.
Н.П.Бочков (1983) отмечает, что "пополнение новых мутаций при спонтанном мутационном процессе уравновешено элиминацией, и популяция сохраняет стабильное состояние. Но, если интенсивность мутационного процесса будет повышена, что неизбежно при расширении контакта людей с мутагенами, то приспособленность популяции снизится в квадратичной зависимости".
Наше государство постоянно уделяет большое внимание охране здоровья советских людей. В Постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР от 01.12.1978 г. отмечалось, что важнейшей задачей науки на современном этапе является "разработка методов прогнозирования и оценки возможных генетических последствий загрязнения окружающей среды".
Этим целям отвечает и современное определение величины здоровья человека, разработанное в Ленинградском научно-исследовательском институте радиационной гигиены Минздрава РСФСР П.В.Рамзаевым с соавт. (1978). По формуле величины здоровья, предложенной авторами, можно прогнозировать состояние организма, используя и патогенетические данные, характеризующие степень мутагенного действия загрязнителей окружающей человека среды и коррелирующие с такими показателями, как канцерогенный эффект и продолжительность жизни, которые входят в формулу величины здоровья. К настоящему времени мутагенный эффект инкорпорированных РН на млекопитающих изучен в меньшей степени по сравнению с таковым при внешнем облучении организмов.
На соматических клетках человека и животных мутагенный эффект выявляется патогенетическими методами анафазного и ме-тафазного анализа или при помощи микроядерного теста. Наиболее информативным и широко распространенным является метафазный метод цитогенетического исследования. Выявляемый этим методом мутагенный эффект характеризуется различными хромосомными и геномными нарушениями в клетках организма.
Чем опасны такие нарушения в соматических клетках для живого организма? 0 чем они свидетельствуют? Такие вопросы, видимо, возникали сразу же после обнаружения этого эффекта, но до сих пор остаются недостаточно изученными.
Хромосомные аберрации (ХА) реализуются в клетках в первые часы после воздействия на организм вредного фактора, т.е. хромосомные нарушения являются одним из наиболее ранних признаков поражения организма. В то же время ХА индуцируются вредными агентами в минимальных дозах. Поэтому их можно считать одним из наиболее чувствительных тестов на химическое или радиационное воздействие.
Со временем индуцированные ХА частично элиминируются из организма с гибнущими клетками. Но часть из них (стабильные цитогенетическяе изменения) способны сохраняться в организме длительное время и передаваться в клеточных поколениях, из-за чего в организме могут накапливаться клоны клеток с измененным генетическим материалом. То есть со временем может изменяться как количество первично возникших хромосомных и геномных нарушений, так и их качество (Н.П.Бочков, 1978).
Цитогенетические нарушения, возникающие под действием любых видов ионизирующей радиации, как отмечает Н.П.Бочков (1971), необходимо изучать по двум обстоятельствам, придающим особую важность этим проблемам и указывающим на срочную необходимость их разработки.
Во-первых, в последние 20 лет твердо установлено (Н.П.Дубинин с соавт., 1962; Н.П.Кулешов с соавт., 1975; Н.П.Дубинин, 1977; Б.Н.Ильин с соавт., 1983 и др.), что хромосомные и геномные мутации играют существенную роль в патологии организма человека. Уже сейчас известно большое количество различных форм хромосомных аномалий у человека. Хромосомные и геномные мутации резко влияют на развитие организма. Не исключено, что радиащонно-индунированные рак и лейкемии являются поздним следствием патогенетических эффектов в соматических клетках. Имеются данные о длительной иммунодепрессии при цитогенетичес-ких нарушениях в лимфоцитах крови и последующем увеличении различных заболеваний облученного организма (А.А.Яршшн с соавт., 1979, 1982; Т.А.Норец с соавт., 1980 и др.). И, наконец, накапливаются данные о влиянии хромосомных нарушений в различных соматических клетках на сокращение продолжительности жизни организма (С;Н.Александров, 1965, 1978; М.М.Виленчик, 1978; Е.К.Хандогина с соавт., 1980 и др.).
Во-вторых, установлено, что хромосомы человека и животных отличаются высокой радиочувствительностью и длительно сохраняют повреждения в некоторых соматических клетках, что приводит к функциональной неполноценности этих клеток и нарушению работы соответствующего органа или системы (Г.И.Козинец,1974; Ю.Н.Анохин, 1980 и др.). Поэтому для более полной характеристики мутагенного эффекта, для выявления его возможной связи с нарушением работы различных органов и систем и с последующими отдаленными неблагоприятными последствиями для всего организма: с канцерогенезом, с сокращением продолжительности жизни -исследование этого эффекта важно проводить в динамике на индивидуальном организме с его специфическим метаболизмом и иммунной системой, которые значительно влияют, как на сам чужеродный агент, так и на процесс реализации его воздействия. Кроме того, только при исследований мутагенного эффекта в динамике можно охарактеризовать его для того или иного инкорпорированного РН, ибо инкорпорированные РН обладают пролонгированным действием на клетки организма, т.е. длительное время индуцируют такой эффект.
В последних рекомендациях (Публикация № 30, 1982) Международная комиссия по радиологической защите (МКРЗ) отошла от принципа лимитирования дозы облучения на критический орган и рекомендует взвешивать стохатический риск облучения отдельных органов и тканей, соизмеримый с риском облучения всего тела. Такой подход оправдан особенно в случае инкорпорирования в организм РН, так как даже при высокой избирательной степени депонирования в определенном органе их влияние не ограничивается тканями только этого органа. При любом пути попадания РН в организм большинство из них в первую очередь контактирует с клетками крови и затем с током крови проходит по многим органам и системам прежде чем в основном инкорпорируется в определенном органе. За время нахождения в крови РН, в зависимости от их физико-химических свойств, способны воздействовать не только на клетки крови, но и на клетки тех органов и систем, в которых они проходят с кровью. Однако в первые часы после попадания в организм наибольшее влияние каждый РН оказывает прежде всего на клетки крови. Клетки крови могут подвергаться облучению нуклидом постоянно, вплоть до его распада, когда проходят через органы и ткани, в которых нуклид инкорпорируется. Из клеток крови лимфоциты являются наиболее радиочувствительными клетками организма (Г.И.Козинец, 1974). Кроме того, лимфоциты крови являются и наиболее удобной классической моделью для изучения мутагенного действия радиации на соматические клетки в условиях in vWo (Н.П.Бочков с соавт., 1975; Л.П.Дубинина, 1977 и др.). Характер хромосомных и геномных нарушений в лимфоцитах крови отражает возможное действие инкорпорированных РН на любые соматические клетки организма.
Исследования мутагенного действия радиации на людях - II - весьма ограничены (проводятся у части профессионалов и изредка при рентгено- и радиодиагностике и терапии). В то же время в СССР отсутствует доступный онтогенетический метод прижизненного исследования хромосом в соматических клетках мелких лабораторных животных, которые наиболее широко используются в токсикологических экспериментах (мышах, крысах и хомячках). Зарубежные сведения по такому методу ( Рсщрио/, /ІЩпхЖо, 1970; "fctK/wuf t а., 1975; Тііушцп t а., 1975) ограничены или трудновоспроизводимы.
Некоторые цитогенетические прижизненные исследования проводятся на кроликах и обезьянах (Л.П.Косиченко, Л.Ф.Семенов, 1975; З.А.Джемилев, М.Г.Мочавариани, 1976; Н.П.Бочков с соавт., 1982 и др.). Но такие исследования малочисленны, так как обезьяны являются дефицитными, а кролики, по некоторым важным показателям, малопригодными для этих целей животными ( tyecafc, АоілАМлЛ, 1980).
В то же время такие исследования важны как для разработки теоретических положений, так и для практического применения, особенно в гигиенических исследованиях, в токсикологии и биодозиметрии.
Таким образом, являются актуальными: I) разработка метода прижизненного цитогенетического исследования соматических клеток мелких экспериментальных животных; 2) определение уровня и характера цитогенетических изменений в соматических клетках таких животных при действии инкорпорированных РН; 3) сопоставление наблюдаемых цитогенетических изменений в соматических клетках экспериментальных животных с выходом у них опухолей, продолжительностью жизни и другими биологическими и медицинскими показателями состояния организма.
Цель работы. Определить уровень и характер мутагенного действия инкорпорированных РН в соматических клетках (лимфоцитах крови) экспериментальных животных (крыс) и его связь с продолжительностью жизни, выходом опухолей и другими биологически важными показателями.
Задачи исследования:
Разработать метод прижизненного исследования хромосомных и геномных нарушений в лимфоцитах крови крыс.
Исследовать в динамике цитогенетические изменения в лимфоцитах крови крыс с инкорпорированными РН.
Определить степень корреляционной связи между патогенетическими изменениями в лимфоцитах крови опытных крыс, лим-фопенией, выходом опухолей и сокращением продолжительности жизни животных.
Научная новизна работы: впервые в стране разработан патогенетический метод прижизненного исследования мутагенного действия вредных факторов на мелких лабораторных животных (на крысах); впервые на лимфоцитах периферической крови крыс в прижизненном эксперименте в динамике проведено патогенетическое исследование мутагенного действия инкорпорированных РН; показано, что уже в ранние сроки (1-30 сутки) Ccr , и смеси нуклидов /3*С1Ъ1У с 90Sr индуцируют в лимфоцитах крови крыс стабильные хромосомные и геномные нарушения (симметричные транслокации, гипер- и полиплоидии), количество которых при действии Lcf , і/ и ^ в отдаленные сроки увеличивается; - ІЗ - при действии инкорпорированных Са и S показано развитие клонов аномальных клеток в отдаленные сроки (у 60 и 80$ этих животных соответственно), и у этих же животных (соответственно у 32 и 6С$) в последующем развивались различные опухоли; впервые показана высокоположительная корреляция между количеством стабильных цитогенетических изменений, образующихся в отдаленные сроки в лимфоцитах крови животных с инкорпорированными РН, и выходом у этих животных опухолей, а также между количеством аберрантных лимфоцитов в крови животных через сутки после введения в их организм РН, уровнем лимфопении в ранние сроки и сокращением продолжительности жизни опытных животных; впервые показано, что мутагенный эффект, выявляемый по хромосомным аберрациям в лимфоцитах крови крыс, при сочетанном введении в различные сроки исследования в 1,5-2 раза меньше суммарного.
На защиту выносятся следующие положения:
Микрометод взятия и культивирования крови крыс дает возможность прижизненно оценивать мутагенное действие инкорпорированных РН на соматические клетки животных, сопоставлять этот эффект с другими последствиями действия нуклидов в том же организме (например, с лимфопенией, выходом опухолей, сокращением продолжительности жизни), которые раскрывают значимость мутагенного эффекта для состояния организма.
Установление высокоположительной корреляции между мутагенным эффектом инкорпорированных РН и уровнем лимфопении, сокращения продолжительности жизни, выходом опухолей у одних и тех же животных позволяет использовать показатель цитогене- тических нарушений как прогностический в отношении таких последствий.
3. Иод-131 при сочетанном его введении с кальцием-45 ослабляет действие последнего, и общий мутагенный эффект при одновременном присутствии в организме этих нуклидов меньше суммарного.
Возможная область применения и Формы внедрения:
По методу, разработанному и примененному в данной работе, подготовлены "Методические рекомендации по прижизненному цито-генетическому исследованию мутагенеза у мелких лабораторных животных (крыс и кроликов)", которые утверждены Главным санитарно-эпидемиологическим управлением министерства здравоохранения СССР ($ 2937-83). Метод внедрен в НИИ общей и коммунальной гигиены им.А.Н.Сысина АМН СССР и в Институте генетики и цитологии АН БССР, а также апробирован в ряде институтов: Всесоюзном НИИ сельскохозяйственной радиологии, НИИ медицинской радиологии АМН СССР, Институте медицинской генетики АМН СССР и в Институте цитологии АН СССР.
Материалы данного исследования могут быть использованы для раннего прогнозирования отдаленных неблагоприятных последствий, которые могут развиться в организме млекопитающих при попадании в них РН различной органотропности.
Материалы диссертации доложены на II координационном совещании по мутагенному действию физических факторов и надежности функционирования процессов репарации ДНК (Пущшо Московской области, 1980 г.), Ленинградском научном обществе рентгенологов и радиологов (1981 г.), Всесоюзном обществе генетиков и селекционеров (Ленинград, 1981 г.), Всероссийском научном обществе гигиенистов и санитарных врачей (Ленинград, 1981, 1982 гг.), заседаниях Секции генетических аспектов проблемы "Чело- век и биосфера" (Паланга, 1982 г.. , Кемерово, 1983 г., Иркутск, 1984 г.), Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы канцерогенеза и антиканцерогенеза" (Ленинград, 1982 г.), X Всесоюзном симнозиуме по радиационной генетике (Пущино Московской области, 1984 г.).
По материалам диссертации опубликовано II печатных работ.
Особенности мутагенного действия инкорпорированных радионуклидов
Как показали многие исследователи (Л.М.Грачева, В.Г.Королев, 1977; В.Ф.Степаненко, А.В.Севанькаев, 1980; Т.И.Урядниц-кая, К.Н.Муксинова, 1982), биологическое и в том числе цитогенетическое действие инкорпорированных РН, в значительной степени отличается от действия внешнего облучения на организм.
Большинство исследований мутагенного действия инкорпорированных РН, проведенных на различных биологических объектах с 1950 по 1975 гг., проанализировано Л.М.Грачевой и В.Г.Королевым (1977). Как отмечают авторы, РН представляют собой для биологической системы особый вид радиации. Если РН не имеет преимущественной локализации в организме и не связывается с биологически важными молекулами, то эффект его радиационного распада почти не отличается от эффекта в результате внешнего облучения организма в той же дозе.
Особенностью обладают те РН, которые инкорпорируются в ДНК клеток. Распад РН, внедрившегося в молекулу ДНК клетки, как правило, приводит к ее летальному повреждению или видоизменению, т.е. к мутагенному эффекту. Причем физико-химическую природу повреждения ДНК определенным РН можно с достаточной точностью предсказать и, таким образом, связать типы возникающих мутаций с химическими изменениями ДНК.
Обладая способностью инкорпорироваться в строго фиксированных положениях ДНК,РН могут индуцировать высокоспецифичный метагенез.
При однократном поступлении в организм человека или экспериментальных животных мощность дозы облучения РН вначале максимальна, а поглощенная доза - минимальна; затем, по мере его распада, мощность дозы уменьшается, а поглощенная доза, к моменту полного выведения или распада нуклида, достигает максимума. Поэтому, даже при однократном поступлении РН в организм, вплоть до его полного распада и выведения, он производит пролонгированное воздействие на клетки организма.
Основная часть РН, включающихся в биологические процессы в клетках СИ, ,ЧС, »7 33/ ъ% ггА/сі, ч Со,, n5J, ,гі3, Srt 895г ), являются fi -излучателями. Вклад распада нуклида в биологический эффект определяется энергией излучаемых ft -частиц и трансмутационной составляющей. При включении РН в ДНК клеток их эффект по влиянию на частоту ХА значительно превосходит эффект внешнего облучения при той же поглощенной дозе. Так, например, для показано (В.Г.Королев, Л.М.Грачева, 1974), что при одинаковой дозе на ядро клетки, ее мутагенный эффект в 15 раз больше, чем эффект только fi -излучения, т.е. показано, что эффект воздействия 3 S на клетки определяется в основном трансмутационной составляющей.
Материал исследования и схема эксперимента
В работе изучалось мутагенное действие РН, широко применяемых в медицинской практике и в производственных процессах, или тех, количество которых увеличивается в окружавдей человека среде, особенно после испытаний атомного оружия (Публикации МКРЗ № 17, 1974; № 25, 1978; И.Я.Василенко, 1978): кальция-45, йода-131, серы-35, стронция-90, цезия-137, иттрия-91. Краткая физико-химическая характеристика этих РН приведена в табл.2.1.
Вводимое количество РН выбиралось с таким расчетом, чтобы, во-первых, в момент формирования максимальной поглощенной дозы не было ранней массовой гибели животных, как при раздельном, так и при сочетанном поступлении РН, и, во-вторых, поглощенные дозы должны быть близкими к оптимальным бластомогенным, чтобы отдаленные эффекты в виде новообразований были значимыми в количественном отношении. Исходя из этих условий, на основании литературных данных (Н.А.Запольская с соавт., 1976,1978) были определены вводимые количества 4SCQ , /3/ / , і/ ,
Sr и Cs , которые соответственно формировали в организме крыс дозы, равные 1/4 Д%о/30# я вводимое количество было выбрано с таким расчетом, чтобы была возможность проводить надежные радиометрические измерения на измерителе низкоэнергетических бета-излучателей, разработанном Е.И.Долгиревым с соавт. (1978).
Цитогенетическое исследование мутагенного действия вводимых РН и их сочетаний проводили на лимфоцитах периферической крови крыс прижизненно метафазным методом анализа в наиболее ранние после начала воздействия сроки и в сроки, предшествующие или совпадающие с наибольшей гибелью животных или большим образованием у них опухолей (Н.А.Запольская с соавт., 1975, 1976,1978,1980). При изучении мутагенного действия 4SCa , ; ;Э и их сочетания исследование проводили в большее количество сроков (табл.2.2). В каждый срок цитогенетически обследовалось 4-8 крыс.
Цитогенетичеокое исследование мутагенногодействия изучаемых радионуклидов по хромосомным нарушениям, выявляемым при общей окраске хромосом
При фоновом цитогенетическом обследовании животных У, УІ и УЕ групп, перед введением им РН, в лимфоцитах периферической крови было выявлено 0,8-1,5$ хромосомных нарушений (хроматидные разрывы, одиночные фрагменты, единичные хромосомные разрывы и полиплоидии) - табл.3,1, 3.4 и 3.7.
При обследовании контрольных животных в разные сроки, вплоть до 920 суток, было выявлено не более 4$ ХА и единичные геномные нарушения (табл.3.1, 3.4, 3.7, 3.8, 3.10, З.ІІ, 3.12 и 3.16). Эти данные согласуются с литературными по количеству ХА в клетках КМ (О.В.Курлов с соавт., 1968; Д.С.Маркарян,1972; А.Б.Бигалиев с соавт., 1977; К.Н.Муксинова, Т.И.Урядницкая, 1980) и лимфоцитах крови контрольных крыс (А.С.Монахов, 1981).
Цитогенетическое исследование лимфоцитов крови крыс после введения им Сс/ в количестве 207 кБк/г (табл.2.2) показало (табл.3.1 и рис.3.1), что уже в течение первых суток при максимальной мощности дозы, а к концу первых суток и максимальной поглощенной дозе в крови, величины которых приведены в табл. 3.2, в большом количестве лимфоцитов (33,6$) возникло значительное количество хромосомных и геномных нарушений (39,4$), причем в некоторых клетках было по несколько таких нарушений (среднее количество ХА на клетку составляло 1,17).
