Введение к работе
Актуальность проблемы. Возрастающий риск облучения человека, связанный с бурно развивающейся атомной энергетикой и широким применением в медицине радиоизотопных методов диагностики и лечения приводит к необходимости исследования эффектов радиационного воздействия. После крупных радиационных инцидентов прошлых лет: атомной бомбардировки городов Хиросимы и Нагасаки, аварии на ЧАЭС, радиоактивного загрязнения вод р. Теча, ставшего результатом деятельности ПО «МАЯК», а также в связи с произошедшей в 2011 году радиационной аварией на Фукусиме-1, - особое место занимает проблема отдаленных эффектов радиационного воздействия на человека.
Известно, что ионизирующие излучение индуцируют комплекс цитогенетиче-ских, биохимических и биофизических изменений в клетках организма животных и человека (Пелевина И. И. и др., 2003, Бурлакова Е. Б. и др., 1996), в том числе изменяет состояние клеточных защитных механизмов: систем антиоксидатной защиты, систем репарации, клеточного цикла (Пелевина И. И. и др., 2000, Серебряный А. М. и др., 2004). Один из основных механизмов «радиационной защиты» клетки направленных на предотвращение деления клеток с повреждениями ДНК - блок клеточного цикла (Кудряшов Ю. Б., 2004). В случае нарушения этого защитного механизма, повреждения ДНК, возникающие при длительном облучении, могут быть реализованы в виде соматических мутаций, что, в конечном счете, может привести к продукции пула дефектных, структурно и функционально неполноценных клеток (Veremeyeva G.A. et. al., 2010). Особенно актуально это в отношении радиочувствительных гемопоэтиче-ских клеток красного костного мозга (ККМ).
В ряде экспериментальных работ показано, что у хронически облученных животных выявлено изменение митотического цикла клеток ККМ (красного костного мозга) и их пролиферативной активности. Однако вопрос об экспрессии белка Chk2 (как маркера блока клеточного цикла) у хронически облученных людей ранее не рассматривался.
У пострадавших при атомных бомбардировках в Японии (Kyoizumi S. et. al., 1990), ликвидаторов ЧАЭС (Замулаева И. А. и др., 2006), у работников атомной промышленности (Смирнов и др. 2005; Костюк С. В. и др. 2008) выявлено увеличение частоты мутаций в генах Т-клеточного рецептора (TCR). Но пока остаётся неясным какова частота мутаций в генах TCR у хронически облученных людей в отдаленные сроки от начала радиационного воздействия (более 60 лет). В связи с этим особый интерес может представлять изучение частоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ), пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови (ПК) и час-
тоты CD3-CD4+ лимфоцитов у облученных жителей прибрежных сел р. Теча, в отдаленные сроки. Район реки Теча является единственным регионом в мире, где, начиная с 1949 г., в результате производственной деятельности комбината "Маяк" сложились аварийные условия многолетнего облучения значительного по численности контингента населения в широком диапазоне доз (Аклеев А. В., 2005). Особенно актуально, оценить данные параметры в период, когда большая часть облученных людей достигла пожилого возраста, характеризующегося снижением адаптационных резервов, ослаблением систем контроля клеточного цикла, репарации, спонтанным увеличением частоты соматических мутаций.
Цель исследования - оценить пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови (ЛПК), частоту лимфоцитов с блоком клеточного цикла (БКЦ) и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у людей, проживавших в прибрежных селах р. Теча и подвергшихся хроническому радиационному воздействию
В задачи работы входило:
Исследовать пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ методом проточной цитометрии (по экспрессии белков Chk2 и Ki-67), а также частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у хронически облученных людей в отдаленные сроки после начала радиационного воздействия.
Оценить пролиферативную активность, долю лимфоцитов с БКЦ, и частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь (ХЛБ).
Проанализировать пролиферативную активность и долю лимфоцитов с БКЦ, частоту CD3-CD4+ лимфоцитов у облученных людей, имеющих лейкопению в отдаленные сроки радиационного воздействия.
Оценить зависимость пролиферативной активности и доли лимфоцитов с БКЦ, частоты CD3-CD4+ лимфоцитов от дозы облучения ККМ и мощности дозы в период максимального радиационного воздействия.
Научная новизна исследования. Впервые у жителей прибрежных сел р. Теча, подвергшихся хроническому комбинированному облучению, в том числе у лиц, перенесших ХЛБ и имеющих лейкопению в отдаленный период радиационного воздействия, исследована пролиферативная активность ЛПК и частота клеток с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белков ki-67 и Chk2.
Проведен анализ влияния дозы и мощности дозы облучения ККМ на пролиферативную активность и частоту лимфоцитов с БКЦ, а также частоту CD3-CD4+ лим-
фоцитов у хронически облученных людей в отдаленный период после начала радиационного воздействия.
Впервые изучена зависимость между содержанием лейкоцитов, лимфоцитов в периферической крови и пролиферативной активностью, а также блоком клеточного цикла ЛПК у облученных людей в отдаленные сроки после радиационного воздействия.
Практическая значимость работы. Оценка пролиферативной активности и частоты клеток с БКЦ, позволит обосновать и разработать критерии формирования групп риска в отношении отдаленных гемопоэтических эффектов.
Разработанная методика оценки доли (%) ЛПК с блоком клеточного цикла, методом проточной цитометрии на основе анализа экспрессии белка Chk2, совместно с исследованием пролиферативной активности ЛПК (белок Ki-67) рекомендуется для прогнозирования ответа системы гемопоэза на стимулирующее воздействие при лечении цитопенического синдрома, с применением регенеративной терапии.
Положения, выносимые на защиту
В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия (дозы облучения ККМ составили 0,06-4,46 Гр; среднее значение - 1,11±0,06 Гр) у лиц пожилого и старческого возраста в периферической крови отмечено увеличение уровня CD3-CD4+ лимфоцитов на фоне повышения пролиферативной активности лимфоцитов и клеток с блоком клеточного цикла. Частота лимфоцитов с блоком клеточного цикла в периферической крови и пролиферативная активность лимфоцитов зависят от мощности дозы облучения ККМ в период максимального облучения. Частота клеток с блоком клеточного цикла после инкубации и у-облучения зависит от дозы облучения ККМ.
У лиц, перенесших хроническую лучевую болезнь, не выявлено изменений пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови, уровня клеток с блоком клеточного цикла, а также изменения частоты CD3-CD4+ лимфоцитов.
3. Наибольшее увеличение пролиферативной активности лимфоцитов и час
тоты лимфоцитов с блоком клеточного цикла выявлено у людей имеющих признаки
лейкопении в отдаленные сроки хронического радиационного воздействия.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на 12th International Congress of the International Radiation Protection Association (Buenos Aires, Argentina. 2008), 10th International Conferences on Health Effects of Incorporated Radionuclides. (Santa Fe, NM., 2009), на 54 th Annual Meeting of the Health Physics Society (Minneapolis, USA, 2009), на 5 международной научно-практической конферен-
ции, посвященной 10-летию создания Северского биофизического центра ФМБА России (Томск, 2010), на 1 международной научно-практической конференции «По-стгеноные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010), на IV международной конференции «Хроническое радиационное воздействие: эффекты малых доз» (г. Челябинск, 2010).
Публикации. По материалам работы опубликовано 14 печатных работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, приложения. Работа изложена на 154 станицах, иллюстрирована 10 рисунками, и 32 таблицами. Библиографический указатель содержит 210 источников литературы.
