Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 13
1.1 Место двунитевых разрывов в ряду различных повреждений ДНК 13
1.2 Основные механизмы репарации двунитевых разрывов 16
1.3 Флуоресцентные методы исследования репарации ДР 20
1.3.1 Фосфорилированный вариант гистона Н2АХ как маркер ДР 20
1.3.2 Фокусы белка Rad51 как маркеры гомологической рекомбинации 27
1.3.3 Подходы к количественному анализу фокусов белков репарации 28
1.4 Предшествующие модели индукции и репарации ДР ДНК 30
ГЛАВА II. Разработка алгоритма автоматического анализа флуоресцентных изображений с фокусами белков репарации ДНК 37
II. 1 Обзор составленного алгоритма 37
П.2 Разработка и валидация алгоритма детекции ядер клеток 39
П.З Разработка и валидация алгоритма детекции фокусов 46
П.4 Графический интерфейс для запуска расчётов и анализа результатов 52
ГЛАВА III. Получение экспериментальных данных по кинетике формирования и деградации фокусов белков у-Н2АХ и Rad51 54
ПІЛ Материалы и методы 54
Ш.2 Анализ флуоресценции гистона уН2АХ в клетках линии V79 56
Ш.З Анализ флуоресценции гистона уН2АХ в клетках ПФЧ 58
Ш.4 Анализ флуоресценции белка Rad51 62
ГЛАВА IV. Построение кинетической модели индукции и репарации ДР ДНК 67
IV.1 Общий вид кинетической модели 67
IV.2 Замена переменных, подбор коэффициентов и валидация модели... 74
IV.3 Результаты моделирования 86
Заключение 97
Выводы 99
Библиографический список
- Флуоресцентные методы исследования репарации ДР
- Подходы к количественному анализу фокусов белков репарации
- Разработка и валидация алгоритма детекции фокусов
- Анализ флуоресценции белка Rad51
Флуоресцентные методы исследования репарации ДР
ДНК является высокостабильной макромолекулой. Даже несмотря на то, что N-гликозидные связи с пуриновыми основаниями обладают относительно невысокой энергией, депуринизация одного отдельно взятого пуринового основания происходит не чаще, чем раз в 1000 лет. Дезаминирование цитозина с образованием урацила происходит и того реже - раз в 70000 лет [Shapiro et al., 1981]. Тем не менее, даже такие редкие события могут оказаться важными в контексте поддержания генетической стабильности. Если учесть, что средний размер генома млекопитающих составляет порядка нескольких миллиардов пар нуклеотидов, то получится что при воздействии естественного радиационного фона и внутренних повреждающих факторов в каждой клетке в течение только одного часа образуется порядка 300 депуринизированных сайтов и происходит дезаминирование четырех цитозинов. Кроме того, ДНК содержит сайты, подверженные гидролитическим и оксидативным повреждениям, в том числе атомы азота и углерода азотистых оснований и дезоксирибозы, фосфодиэфирные связи [Greer et al., 1962; Masuda et al., 2012]. В результате действия активных форм кислорода образуются первичные окисленные аддукты ДНК, обладающие высокой реакционной способностью. Такие соединения быстро деградируют с образованием большого числа вторичных повреждений ДНК. На данный момент известно более чем 100 видов таких повреждений [Dizdaroglu et al., 1992 ;Breen et al., 1995]. Более того, было показано, что в результате возникновения окислительных повреждений ДНК в каждой клетке человека в среднем происходит от двух до десяти тысяч разнообразных модификаций пуриновых оснований [Lindahl et al., 1993]. Кроме окислительных повреждений, ДНК подвержена и ряду других видов нежелательных модификаций. В частности, нуклео-фильные центры оснований, включая почти все атомы азота и кислорода, а также фосфатные группы, являются мишенями для алкилирования [Singer et al., 1982].
Воздействие ионизирующего излучения интересно тем, что помимо прямого действия, вызываемого происходящими в молекуле ДНК актами ионизации, существуют и косвенные механизмы действия, в первую очередь обусловленные образованием АФК за счёт радиолиза воды. Такой косвенный механизм повреждения ДНК при действии ионизирующей радиации во многом схож с описанными выше механизмами возникновения повреждений в естественных условиях, но при этом многократно усилен. Было подсчитано, что число повреждений ДНК, образующихся за счёт эндогенных факторов за одни сутки, приблизительно равно числу повреждений при воздействии у-излучения в дозе 10 Гр. Таким образом, мощность дозы такого излучения соответствовала бы 7 мГр/мин [Cosman et al., 1992]. Тем не менее, имеют место существенные отличия повреждений, возникающих при действии ИИ, от тех, которые обусловлены действием эндогенных АФК. Наиболее важным из таких отличий является высокая вероятность образования двунитевых разрывов ДНК. Окисление остатка дезоксирибозы в цепи ДНК приводит к образованию однонитевого разрыва. Если такой процесс одновременно происходит в остатках дезоксирибозы на антипараллельных цепях ДНК, стоящих друг напротив друга, происходит образование ДР.
Наиболее высокий выход двунитевых разрывов наблюдается при действии плотноионизирующего излучения, поскольку такие повреждения, обычно, локализованы кластерами вдоль трека частицы, и повреждение двух соседних нуклеотидов с образованием ДР имеет высокую вероятность. Более того, часто происходит образование кластерных повреждений, при которых несколько ДР лежат непосредственной близости друг от друга [Goodhead et al., 1994]. Повреждения, вызываемые действием так называемого редкоионизирующего излучения, включающего у-лучи и высокоэнергетическое рентгеновское излучение с энергией квантов более 10 кэВ, имеют принципиально другой характер. Такие повреждения более равномерно распределены по всему объему ядерной ДНК, при этом число образующихся двунитевых разрывов заметно меньше по сравнению с плотноионизирующим излучением. Воздействие у -излучения на клетки человека в дозе 1 Гр приводит к образованию 600 - 1000 однонитевых разрывов и всего 16-40 двунитевых [Ward et al., 1988; Vilenchik et al., 2000]. Тем не менее, именно редкоионизирующее излучение составляет основу естественного радиационного фона, что делает изучение этого вида ИИ крайне важной задачей. Кроме того, редкоионизирующее ИИ обладает высокой проникающей способностью, что обусловливает его использование для радиотерапии раковых опухолей глубокого залегания [Bencokova et al., 2008; Heppner et al., 2008; Го-ланов с соавт., 2007].
Возникающие ДР ДНК неоднородны по своей химической структуре, поскольку нарушения сахарофосфатного остова молекулы и сопутствующее образование реакционноспособных нерелаксированных или окиленных структур часто приводит к появлению дополнительных повреждений ДНК в области двунитевого разрыва. Такие ДР получили в литературе название «сложных». Репарация сложных ДР имеет более медленную кинетику по сравнению с репарацией простых, для которых специальный процессинг не требуется [Metzger et al., 1991; Michalik et al., 1994; Gultson et al., 2002]. Другой причиной различий в скорости репарации ДР может служить их положение в структуре хроматина. По некоторым данным репарация ДР, локализованных в гетерохроматине, имеет более медленную кинетику по сравнению с эухроматином [Goodarzi et al., 2009, 2010].
Подходы к количественному анализу фокусов белков репарации
Как правило, конечным результатом эксперимента, связанного с окрашиванием определённых белков репарации ДНК в ядрах повреждённых клеток флуоресцентно мечеными антителами, является набор изображений, организованный в поднаборы. Каждый поднабор соответствует одному полю обзора на микроскопическом препарате и содержит несколько изображений, соответствующих разным длинам волн возбуждающего лазера. Обычно, один из каналов используют для возбуждения флуорохрома, специфически связывающего ДНК, например, DAPI. Таким образом, на изображении, соответствующем этому каналу возбуждения, видны ядра клеток, находящихся в текущем поле обзора. Кроме того, каждый поднабор содержит одно или несколько изображений, соответствующих каналам возбуждения флуоресцентно меченых антител, специфически связывающих исследуемые белки. Каждое изображение по сути представляет собой прямоугольную матрицу, в каждую ячейку которой записана интенсивность соответствующей точки. Примеры описанных изображений приведены на Рис. 11.1.
Наиболее логичным подходом к автоматической обработке входных данных, имеющих такую структуру, является разделение этого процесса на несколько последовательных стадий. Их последовательность и содержание могут варьировать в зависимости от применяемых алгоритмов. Здесь приведена последовательность операций, использованная в данной работе. На первом этапе необходимо провести детекцию ядер клеток. Алгоритм детекции состоит из двух фаз: бинаризации и сегментации изображений. Под бинаризацией исходного изображения с ядрами клеток подразумевается разделение всех точек этого изображения на два множества - ядра и фон. На полученном бинарном изображении точки, принадлежащие нескольким соседним клеткам, могут образовывать связный кластер, поэтому следующим этапом алгоритма является сегментацияя бинарного изображения, в результате которой всё множество точек, не принадлежащих фону, оказывается разделено на подмножества, соответствующие отдельным ядрам клеток. Далее, точки, принадлежащие ядрам клеток, учатвуют в алгоритме детекции фокусов на изображениях с флуоресцентно мечеными белками репарации ДНК. Таким образом, для каждого из ядер, найденных на первом изображении, происходит независимый подсчёт числа, суммарной площади и интенсивности фокусов, а также некоторых других параметров, о которых будет сказано ниже.
В ходе настоящей работы было реализовано специальное программное приложение с графическим интерфейсом, позволяющее быстро настраивать и запускать обработку больших наборов изображений с помощью созданного алгоритма, а также визуально оценивать результат такой обработки. В последующих пунктах этой главы будут подробно рассмотрены перечисленные здесь этапы анализа флуоресцентных изображений, а также приведен обзор указанного приложения.
Задачи сегментации и бинаризации тесно связаны между собой, поскольку зачастую бинаризация может быть рассмотрена как частный случай сегментации изображения. Существует целый ряд подходов к бинаризации и сегментации изображений, среди которых можно выделить три основных подхода: это алгоритмы, основанные на поиске отсечки, пограничного значения интенсивности между объектами и фоном; алгоритмы, основанные на анализе перепадов интенсивности между соседними точками; и алгоритмы, основанные на анализе матрицы попарных расстояний между точками в каком-либо заранее выбранном пространстве [Pham et al., 2000].
В данной работе для поиска границ клеточных ядер и бинаризации изображений был использован алгоритм Кэнни [Canny, 1986]. Для того, чтобы сделать границы на изображении более контрастными, для каждого изображения применялся следующий предварительный фильтр:
По значению угла с положительным направлением оси Ох все точки сортируются по четырем направлениям: вертикальное, горизонтальное, диагональное и антидиагональное. В дальнейшем эта информация используется для проведения процедуры «утончения» границ, суть которой заключается в удалении ложных максимумов градиента вдоль направления, перпендикулярного основному направлению границы. В качестве аргумента алгоритм Кэнни принимает два значения так называемых «сильной» и «слабой» отсечек, причём значение сильной отсечки всегда больше значения слабой. В ходе процедуры применения двойной отсечки находят все точки, значения модуля градиента в которых превышают значения сильной отсечки и записывают их в финальное изображение. Затем находят аналогичные точки для слабой отсечки, но для записи в финальное изображение среди них рекурсивно выбирают только те, которые соседствуют с точками, записанными туда ранее, с учётом направления текущей границы. Таким образом, получается новое бинарное изображение, содержащее все обнаруженные на исходном изображении границы. В дальнейшем можно варьировать значения отсечек, чтобы увеличить или уменьшить чувствительность алгоритма.
Полученные границы объектов разбивают всё пространство изображения на отдельные замкнутые области. Точки области, имеющей наибольшую площадь, будут отнесены на новом бинарном изображении к фону, а точки всех прочих областей, включая обнаруженные границы, будут считаться принадлежащими ядрам. Последним этапом бинаризации является удаление малых объектов (случайного мусора, попавшего в поле зрения микроскопа, размер которого заметно меньше размера ядер). Последовательные этапы описанной процедуры бинаризации исходного изображения приведены на Рис. П.З.
Как было сказано выше, следующим этапом за бинаризацией изображения служит его сегментация, целью которой является разделение кластеров соприкасающихся ядер на отдельные ядра. Для выполнения этой задачи был использован алгоритм водораздела [Beucher et al., 1993]. В классическом виде для работы алгоритма водораздела необходимы пробные точки, или так называемые маркеры. Каждому будущему объекту должен соответствовать как минимум один маркер. Кроме того, алгоритм использует черно-белое изображение с полутонами. Алгоритм состоит из нескольких последовательно выполняемых операций. Вначале происходит нахождение маркеров и построение приоритетной очереди из пикселей в окрестности каждого маркера, при этом положение пикселя в очереди определяется его интенсивностью
Разработка и валидация алгоритма детекции фокусов
В результате была получена система из 17 уравнений, содержащая 17 свободных параметров. Подбор коэффициентов проводился последовательно с помощью модифицированного алгоритма Левенберга-Марквардта с использованием открытого кода из проекта SciPy [Marquardt, 1963; Gill et al., 1978; Mill-man et al., 2011]. Чтобы избежать появления решений, не несущих физического смысла, на возможные значения свободных параметров были наложены некоторые ограничения. Кроме того, был использован генератор теплового шума, чтобы лучше исследовать пространство значений параметров и избежать попадания в неглубокий локальный минимум. В качестве функции для минимизации была использована взвешенная сумма квадратов отклонений модельных значений от экспериментальных. Весовые коэффициенты имели большие значения для мало заселенных областей тренировочного набора и возрастали с уменьшением экспериментальной погрешности точек. Значения всех констант, полученные в результате минимизации приведены в Таблице IV.
Как уже было сказано выше, параметр Н является масштабирующим фактором, значение которого может быть истолковано не только как полная величина пула белка Ки70/80, но и как максимальная концентрация репарационных комплексов, которые могут возникнуть в клетке. Таким образом, величина этого параметра могла быть выбрана произвольно. В нашей модели мы решили использовать значение, близкое к тем, которые были использованы в кинетических моделях других авторов, в которых был применен сходный способ замены переменных.
Как уже было сказано выше, параметр Н является масштабирующим фактором, значение которого может быть истолковано не только как полная вели чина пула белка Ки70/80, но и как максимальная концентрация репарационных комплексов, которые могут возникнуть в клетке. Таким образом, величина этого параметра могла быть выбрана произвольно. В нашей модели мы решили использовать значение, близкое к тем, которые были использованы в кинетических моделях других авторов, в которых был применен сходный способ замены переменных.
Как уже было сказано выше, параметр Н является масштабирующим фактором, значение которого может быть истолковано не только как полная величина пула белка Ки70/80, но и как максимальная концентрация репарационных комплексов, которые могут возникнуть в клетке. Таким образом, величина этого параметра могла быть выбрана произвольно. В нашей модели мы решили использовать значение, близкое к тем, которые были использованы в кинетических моделях других авторов, в которых был применен сходный способ замены переменных. Коэффициенты а и а\ определяющие скорость образования новых разрывов, были выбраны на основе литературных данных по числу ДР в клетках, подвергнутых действию у-излучения [Masuda et al., 2012]. При этом было использовано фиксированное соотношение между долей простых и сложных ДР, равное 4:1 [Nikjoo et al., 2001].
Для подбора коэффициентов К\ и К2, определяющих скорости формирования комплексов ДР - Ки70/80 и ДР - ДНК-ПК соответственно, были использованы данные по скоростям этих процессов, полученные для клеток V79 с помощью метода гашения флуоресценции [Mari et al., 2006]. Характерные времена восстановления уровня флуоресценции этих комплексов до 95 % от исходного составляют 2 и 4 минуты соответственно (Рисунок IV.2). —1 ДР - KU70/SO ДР - KU70/SO - ДНК-ПКкс
Для подбора оставшиеся 12 параметров были использованы литературные данные по кинетике репарации двунитевых разрывов ДНК, полученные мето дом пульсгель электрофореза [Kysela et al., 1993; Lobrich et al., 1998; Beli et al., 2000], и данные по кинетике образования фокусов белков у-Н2АХ и Rad51 в местах репарации двунитевых разрывов ДНК в ответ на облучение с различными мощностями доз, полученные нашим коллективом (глава III) и другими авторами [Leatherbarrow et al., 2006; Bee et al., 2013]. Все использованные данные были получены на клетках фибробластов млекопитающих линий V79, CCD34 и первичных фибробластах человека при известных параметрах облучения: накопленной дозе, мощности облучения и источнике облучения. Часть этих данных была получена с использованием кобальтового источника у-излучения (Со ), а часть с использованием излучения рентгеновской трубки с энергией квантов 50 - 200 кэВ.
Известно, что ОБЭ рентгеновского излучения с такой энергией квантов, рассчитанное по выходу ДР ДНК по сравнению с у-лучами Со , варьирует в диапазоне 1,07 - 1,13 [Kraxenberger et al., 1998; Nikjoo et al., 2010; Kirkby et al., 2013]. Это означает, что различия в величине измеряемых показателей (доля нерепарированных ДР ДНК, число и интенсивность фокусов белков у-Н2АХ и Rad51), возникающие за счет использования различных видов редкоионизи-рующего излучения, сравнимы с погрешностью измерений этих показателей. Поэтому данные, полученные с применением указанных видов облучения, в процессе тренировки модели могли быть использованы совместно. Тем не менее, поскольку в работах разных авторов приведены данные по различным контрольным показателям (число и интенсивность фокусов, полученные с использованием различных протоколов флуоресцентного окрашивания белков), прямое сравнение абсолютных значений таких данных было невозможно. Чтобы сделать возможным сравнение таких данных, для каждого типа и источника данных был введен свой линейный масштабирующий коэффициент. Таким образом, для всех данных, кроме полученных в главе III, были использованы относительные значения измеренных показателей. Масштабирующие коэффициенты (всего их было 5) были найдены вместе со свободными параметрами сис темы методом Левенберга-Марквардта. В таблице IV.2 приведен список всех использованных литературных данных.
Всего для построения модели и подбора последних 12 свободных параметров были использованы 182 экспериментальных значения. Для статистической валидации модели 29 из них не были использованы в тренировочном наборе и были выделены в отдельный тестовый набор. Кроме того, был использован метод перекрёстной оценки устойчивости модели к небольшим модификациям тренировочной выборки путём исключения по тридцать точек. В качестве оценки устойчивости был использован аналог коэффициента детерминации q (формула IV.41).
Анализ флуоресценции белка Rad51
Более интересной выглядит зависимость пикового по времени уровня флуоресценции Rad51 от мощности дозы облучения. В то время как с увеличением дозы происходит монотонное увеличение интенсивности флуоресценции фокусов Rad51 (Рисунок IV.5), зависимость их числа от мощности дозы имеет максимум (Рисунок IV. 11). При различных значениях накопленной дозы (0,25 -5 Гр) максимум флуоресценции фокусов Rad51 соответствует значениям мощности дозы в диапазоне 1,5-20 мГр/мин. 1 4 40 400
Мощность дозы, Гр/мин Рисунок IV.11. Зависимость интенсивности флуоресценции фокусов Rad51 в облученных клетках от мощности дозы при разных дозах облучения.
Поскольку интенсивность флуоресценции белка Rad51 напрямую связана с активностью репарации по пути ГР, можно было ожидать существование определенного оптимума значений дозы облучения и мощности дозы, при котором доля гомологической рекомбинации была бы максимальна. Для демонстрации факта наличия такого оптимума была построена ещё одна тепловая диаграмма, демонстрирующая долю ДР, репарация которых протекает по пути ГР, в зависимости от величины накопленной дозы облучения клеток и мощности дозы (Рисунок IV. 12). Было показано, что соотношение доли репарации по путям ГР и НГСК может меняться в диапазоне 2 - 40 % в зависимости от дозы и энергии квантов используемого ИИ [Nikjoo et al., 2001]. Данные, полученные с помощью построенной в ходе данной работы модели, показывают, что мощность дозы так же является принципиально важным фактором, влияющим на вклад ГР в процесс репарации ДР. Максимум вклада ГР при использовании терапевтически релевантных доз наблюдается на границе малых и средних мощностей дозы (5 - 20) мГр/мин. При этом, так же как и для значения флуоресценции фокусов Rad51, существует тенденция к увеличению максимума вклада ГР по мощности дозы с увеличением накопленной дозы облучения.
Существуют представления о том, что ГР является более точным по сравнению с НГСК механизмом репарации ДР, в процессе которого образуется меньшее число как точечных мутаций, так и хромосомных аберраций [Takata et al., 1998; Sasaki et al., 2004]. С учетом этого, уменьшение доли ГР при увеличении мощности дозы и переходе от пролонгированого к острому режиму облучения может быть объяснено следующим образом: в случае острого облучения и быстрого накопления ДР в клетке, преобладает более быстрый, но менее точ ный путь репарации ДР - НГСК. Тем не менее, как было показано выше, даже в этом случае возможностей систем репарации может быть недостаточно для репарации всех образующихся ДР. В случае действия облучения с малой мощностью дозы (до 40 мГр/мин) клетки используют более длительный, но и более надежный путь репарации - ГР.
Полученные данные могут представлять большой практический интерес. В свете последних данных, показывающих связь между некоторыми отдаленными последствиями облучениями, такими как число мутаций, хромосомных аберраций и рядом эпигенетических эффектов, включая метилирование ДНК и деацетилирование гистонов, и соотношением вкладов путей НГСК и ГР в репарацию ДНК, можно говорить о принципиальных различиях последствий действия острого и пролонгированного режимов облучения [Bitomsky et al., 2009; Robert et al., 2011; Botragno et al., 2012; Strozyk et al., 2013]. Большие перспективы открывает возможность модулирования соотношения вкладов ГР и НГСК путем изменения мощности дозы. Более того, недавно была показана положительная корреляция между уменьшением вклада ГР в репарацию радиационно-индуцированных ДР и увеличением уровня автофагии в облученных клетках [Alessio et al., 2014]. В большинстве случаев автофагия является крайне нежелательным эффектом в случае радиотерапии опухолей. Активность этого процесса напрямую связана с вероятностью возникновения рецидивов после окончания терапии [Kuwahara et al., 2011]. Таким образом, можно предположить, что использование оптимальных режимов облучения с малой и средней мощностями дозы в радиотерапии, максимизирующих вклад репарации по пути ГР, может оказаться наиболее эффективным с точки зрения минимизации вероятности рецидива опухолей. Однако, следует иметь ввиду, что регуляция репарации ДР ДНК в линиях опухолевых клеток бывает нарушена [Henning et al., 2003], поэтому вопрос влияния мощности дозы облучения на соотношение вкладов путей репарации в этих клетках требует дополнительного исследования.
В ходе данной диссертационной работы проведено полноценное исследование особенностей индукции и репарации ДР ДНК в клетках фибробластов млекопитающих, включая клетки лёгкого китайского хомяка V79 и первичные фибробласты кожи человека, в результате действия редкоионизирующих видов излучения в зависимости от мощности дозы. Для проведения экспериментальных исследований был создан специальный программный пакет для автоматического анализа флуоресцентных изображений белков репарации ДР ДНК. Была показана эффективность использования такого пакета по сравнению с другими аналогами. В дальнейшем автор планирует расширять набор функций и возможную область применения данного пакета. В ходе экспериментальных исследований получены совершенно новые данные по кинетике образования фокусов белков репарации ДР уН2АХ и Rad51 при различной мощности дозы. Продемонстрировано, что мощность дозы облучения является важнейшим фактором, влияющим на кинетику репарации ДР. Полученные экспериментальные данные были использованы для составления кинетической модели, описывающей процессы индукции и репарации ДР ДНК. С помощью созданной кинетической модели был получен необычный результат, демонстрирующий наличие оптимальных режимов мощности дозы, обеспечивающих максимальный вклад в репарацию ДР механизма гомологической рекомбинации. Хотя этот результат сам по себе представляет интерес, тем не менее, для практического использования результатов моделирования, в частности для разработки оптимальных режимов радиотерапии опухолей, целесообразно провести дополнительную параметризацию модели для клеток таких опухолей. Кроме того, необходимо дальнейшее дополнение модели, позволяющее в явном виде учитывать возникновение отдаленных последствий облучения и инициацию клеточной гибели по механизмам апоптоза и автофагии.
