Введение к работе
Актуальность исследования. Многие биологически активные соединения имеют пептидную природу. Регуляция биологических процессов с помощью олигопептидов и пептидов является одной из самых сложных и многофункциональных систем в живых организмах.
Работами отечественных и зарубежных ученых [Slemmon, Flood, 1994; Карелин с соавт. 1997, 1998, 2000, 2005, 2008] установлено, что образование пептидных молекул различной молекулярной массы тканеспецифично и представляет собой результат протеолитической деградации функционально важных белков: гемоглобина, актина, ряда внутриклеточных ферментов. Это привело к формированию положения о существовании тканеспецифических пептидных пулов, играющих существенную роль в процессах регуляции как на уровне клеток, так и на уровне всего многоклеточного организма.
По мнению исследователей [Карелин, Иванов, 2005] основной функцией тканеспецифического пептидного комплекса служит контроль трансформации, пролиферации и элиминации клеток соответствующей ткани. Исключительная важность регуляторов пептидной природы предполагает наличие сложного механизма деградации функциональных белков в клетках, в свою очередь, тонко регулируемого.
Карелиным с соавторами (1998, 2005, 2008) получены и изучены пептидные соединения, образующиеся в культурах эритроцитов человека, предшественниками которых является гемоглобин и некоторые другие белки клеток. Точная локализация, состав, а также механизмы действия комплекса протеолитических ферментов в эритроцитах в настоящее время не изучены. По одной из гипотез, пептиды образуются внутри эритроцитов, а затем выводятся из клеток, по другой, из эритроцитов экскретируются длинные фрагменты, из которых затем в плазме с помощью плазменных протеаз образуются короткие пептиды. Существует также точка зрения, по которой образование коротких пептидов из длинных предшественников связано с действием на них мембраноассоциированного ферментативного комплекса при их прохождении через мембрану [Clark, 1983, Галактионов, 1984, Карелин и др., 1998]. Установлено также, что этот процесс зависит от наличия в среде энергоресурсов (глюкозы) [Карелин и др. 1998]. Открытая эндокринная функция эритроцитов
требует выяснения механизмов образования биологически активных пептидов этими клетками, так как, во-первых, молекулы поступают непосредственно в кровь и оказывают генерализованное действие, а во-вторых, данные клетки не имеют внутриклеточных мембранных структур для локализации активных протеаз. Соответственно, в этих клетках комплекс ферментов, расщепляющих белки, должен иметь механизмы активации и ингибирования. Возможно, этот процесс генерации пептидов в эритроцитах подвергается сложной регуляции с помощью сигнальных молекул, действующих как извне, так и образующихся внутри клеток. Однако сведений о действии сигнальных молекул на образование пептидов в эритроцитах человека нет. Наиболее значительно на эритроцитах человека представлена Р-адренорецепция. Известно, что эритроциты эффективно связывают лиганд Р-адренорецепторов - адреналин [Голенда, 1994], что сопровождается увеличением содержания цАМФ в данных клетках. Эффективность реализации регуляторных механизмов через клеточную рецепцию зависит от функционального состояния клеток, что в свою очередь определяется их возрастом и уровнем образования АТФ.
Цель работы. Целью настоящего исследования стало изучение образование пептидных соединений различными возрастными фракциями эритроцитов человека в условиях действия адреналина, цАМФ и АТФ.
Задачи исследования:
Осуществить разделение гетерогенной популяции эритроцитов человека на молодые и старые клетки без использования чужеродных компонентов для создания градиента плотности.
Провести верификацию состава фракций эритроцитов по биохимическим и реологическим показателям.
Изучить процесс образования пептидных соединений популяцией молодых и старых клеток в условиях активации и блокирования Р-адренорецепции.
Выявить различия в генерации пептидов фракциями молодых и старых клеток под действием экзогенных цАМФ, АТФ и ингибиторов фосфодиэстераз цАМФ.
Провести сравнение пептидных соединений, полученных при действии на эритроциты цАМФ, АТФ, адреналина и полученных при расщеплении гемоглобина под действием пепсина.
Научная новизна. Впервые предложен способ верификации функциональной полноценности фракций эритроцитов по степени эластичности мембраны, определенной методом оптического пинцета. Впервые исследовано образование пептидных соединений различными возрастными фракциями эритроцитов человека в условиях активации и блокирования Р-адренорецепции. Установлено, что в присутствии адреналина происходит увеличение генерации и выхода пептидов из эритроцитов в плазму. Обнаружено, что в молодых клетках этот эффект выше. Выявлено также увеличение скорости образования пептидных соединений эритроцитами человека в условиях действия цАМФ, АТФ и при ингибировании фосфодиэстеразы цАМФ. Установлено, что среди пептидных соединений, образуемых эритроцитами, присутствуют фрагменты гемоглобина молекулярной массой 0,7-3,0 кДа (группа коротких пептидов) и 3-20 кДа (группа длинных пептидов). Обнаружено появление группы коротких пептидов только при действии адреналина на клетки.
Практическая значимость. Предложенный метод «оптического пинцета» может быть использован для экспресс-диагностики способности эритроцита к изменению формы, от которого зависит функциональная полноценность клетки. Обнаруженное изменение количества и спектра пептидных соединений при действии адреналина, а также увеличение количества пептидов внутри эритроцитов при действии АТФ, цАМФ и ингибиторов фосфодиэстераз цАМФ на клетки указывает на наличие сигнального пути активации продукции пептидных соединений эритроцитами человека. Дальнейшее изучение механизмов образования пептидных соединений позволит оценить высвобождение пептидов с определенной биологической активностью из эритроцитов в кровь в различных физиологических и патологических состояниях (стрессовые воздействия, гиперадреналинемия различной этиологии).
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на Самарских областных научных конференциях студентов (2006-2009 гг.), на I Всероссийской конференции «Студенческая наука и медицина XXI века: традиции, инновации и приоритеты» (Самара, 2007), V международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в системе образования» (Тамбов, 2007), международной конференции молодых ученых «Ломоносов», секция «Биология» (Москва, 2008, 2009, 2010),
международной конференции, посвященной 90-летию Ереванского государственного университета и 75-летию факультета биологии, секция «Биохимия» (Ереван, 2009), IV международной конференции молодых ученых «Biodiversity. Ecology. Adaptation. Evolution» (Одесса, 2009), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).
В 2008 г. в ходе работы выполнены совместные исследования с сотрудниками Самарского филиала Физического института им. П.Н. Лебедева РАН бюджетной темы № 01200805602 при частичной финансовой поддержке РФФИ (проект № 07-02-01280-а).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 1 монография, 6 работ опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследований, главы данных собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы и приложений, содержащих абсолютные величины полученных данных. Работа изложена на 133-х страницах машинописного текста, иллюстрирована 45-ю рисунками, содержит 18 таблиц и 9 приложений. В работе использовано 186 источников, из них 142 отечественных и 44 зарубежных.
