Введение к работе
Актуальность темы. При многих патологических состояниях в тканях и биологических жидкостях накапливаются эндогенные токсические субстанции, являющиеся продуктами нормального или нарушенного обмена веществ. Развивается синдром эндогенной интоксикации. Для выбора оптимальной лечебной тактики необходимо установить не только сам факт интоксикации, который в острых и подострых случаях обычно очевиден, но и оценить его выраженность (А.И.Карлищенко, 2001).
Токсическими субстратами, ответственными за возникновение стадии аутоагрессии эндотоксикоза, могут быть продукты неполного распада белков крови и тканей, представленные в основном среднемолекулярными пептидами (СМП) с молекулярной массой от 500 до 5000 Дальтон (Да) (П КДьяченко, 1987; М.Я.Малахова, 1995; A.L.Babb, 1973, R.Vanholder, 2003; J.F.Winchester, 2004). В результате образуются пептиды с выраженной биохимической активностью вследствие их высокой агрегационной способности (З.А.Тупикова, 1983; A.Klein, 1978).
В этой связи имеет большое научное и практическое значение выделение и количественное определение различных фракций белков и пептидов крови. В настоящее время хорошо освоены методы разделения отдельных фракций высокомолекулярных белков с помощью гель-хроматографии (Р.Скоупс, 1985). Однако методические аспекты выделения среднемолекулярных пептидов остаются недостаточно разработанными. Остаются пока неясными вопросы о выборе объекта исследования -плазму или сыворотку крови лучше всего исследовать для оценки фракционного состава среднемолекулярных пептидов.
Учитывая разную способность денатурирующих агентов осаждать белки, необходимо также разработать метод, позволяющий провести наиболее полное осаждение белков без потери фракций
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ*) БИБЛИОТЕКА j
среднемолекулярных пептидов. Недостаточно данных о влиянии времени и температуры хранения образцов на результаты определения среднемолекулярных пептидов. В процессе хранения образцов вследствие протеолиза (К.Н.Веремеенко, 1988) может происходить накопление продуктов деградации белков, имеющих ту же молекулярную массу, что и среднемолекулярные пептиды.
В литературе нет данных о влиянии антикоагулянтов, времени и способах хранения образцов перед началом определения среднемолекулярных пептидов.
Представляло также большой интерес изучение возможности использования метода фракционирования среднемолекулярных пептидов в клинической практике, при заболеваниях, сопровождающихся эндотоксикозом, например, при сахарном диабете (СД). Научных исследований в данном направлении пока крайне недостаточно (В.И.Сидельникова, 1998), а полученные результаты часто противоречат друг другу.
Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явилась разработка новых методических приемов измерения концентрации среднемолекулярных пептидов и исследование особенности распределения фракций среднемолекулярных пептидов у больных сахарным диабетом.
Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. Определить оптимальные способы осаждения крупномолекулярных
белков крови для последующего определения фракционного состава
среднемолекулярных пептидов методом гель-фильтрации.
2. Сравнить плазму и сыворотку крови в отношении
информативности данных о содержании среднемолекулярных пептидов.
3. Изучить in vitro влияние различных антикоагулянтов на уровень
среднемолекулярных пептидов в плазме крови.
4. Исследовать содержание среднемолекулярных пептидов и их
фракционный состав в плазме у больных при неосложненном течении
сахарного диабета 1-го и 2-го типов, используя новые оптимальные
методические приемы измерения концентрации пептидов в крови.
5. Сопоставить результаты исследования среднемолекулярных
пептидов у больных сахарным диабетом с показателями уровня пептидов у
больных с осложнением сахарного диабета нефропатией.
Научная новизна. Установлено, что при использовании в качестве
осадителя белков растворов трихлоруксусной кислоты (ТХУ) значительная
часть пептидов оказывается осажденной и не выявляется в супернатанте.
Также отмечено, что трихлоруксусная кислота выходит из
хроматографической колонки с сефадексом G-25 вместе с пептидами, имеющими молекулярную массу около 1000 Да, существенно завышая значения их концентрации.
Показано, что использование для осаждения белков этилового спирта приводит к частичному осаждению наиболее значительной фракции среднемолекулярных пептидов, имеющих молекулярную массу более 1000 Да. При этом наблюдаются случаи недоосаждения альбумина и завышаются результаты определения концентрации среднемолекулярных пептидов.
Проведенными исследованиями установлено, что для получения очищенных фракций среднемолекулярных пептидов лучше всего удалять крупномолекулярные белки с помощью сульфата аммония. При этом в супернатанте преимущественно остаются пептиды и белки с молекулярной массой не более 15-20 кДа, что позволяет проводить дальнейшее фракционирование среднемолекулярных пептидов в колонках меньших объемов. В результате существенно ускоряется время анализа,
уменьшается расходование реактивов, что делает методику более доступной для применения в обычных биохимических лабораториях.
Впервые показано, что концентрация СМП в сыворотке меньше, чем в плазме. Степень снижения пептидов чаще всего пропорциональна тяжести эндотоксикоза. В результате у больных с эндогенной интоксикацией, сопровождающейся увеличением уровня среднемолекулярных пептидов в плазме, можно не обнаружить повышения концентрации пептидов в сыворотке, что приводит к ошибкам в определении степени тяжести эндотоксикоза и несвоевременному назначению дезинтоксикационной терапии.
Установлено, что применение различных антикоагулянтов (цитрат натрия, оксалат натрия, трилон Б, гепарин) in vitro не влияет на концентрацию СМП в плазме крови.
.Выяснено, что при хранении плазмы при низких температурах или замораживании происходит значительное снижение концентрации среднемолекулярных пептидов. Хранение проб при температуре +20С вызывает значительное увеличение концентрации СМП через 1 час после взятия крови.
Показано, что при сахарном диабете в стадии субкомпенсации, не
определяемой клинически, отмечается увеличение уровня
среднемолекулярных пептидов плазмы. Осложнение течения СД нефропатией приводит к значительному снижению уровня пептидов в плазме, что коррелирует с уменьшением потребности в инсулине.
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований позволили упростить метод гель-фильтрационного определения среднемолекулярных пептидов, что дает возможность применять его в обьиных биохимических лабораториях. Это позволит более точно оценить степень эндогенной интоксикации у конкретного больного и своевременно назначить адекватную терапию. Более
экономный расход реактивов удешевляет исследование и уменьшает затраты рабочего времени.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на Пироговской конференции молодых ученых и студентов (Москва, 2001, 2003 гг.), Всероссийской конференции «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Воронеж, 2000 г.), межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых (Воронеж, 2004 г.).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.
Положения, выносимые на защиту.
Суммарную концентрацию среднемолекулярньж пептидов и их фракционный состав можно определять в плазме крови больньж с помощью гель-фильтрации после осаждения крупномолекулярньж белков сульфатом аммония. При этом следует учитывать условия получения и хранения крови.
Сахарный диабет в стадии субкомпенсации сопровождается значительным увеличением уровня среднемолекулярньж пептидов плазмы по сравнению с показателями здоровых людей. Эти изменения достаточно хорошо коррелируют с тяжестью клинических проявлений интоксикации.
3. Сахарный диабет, осложненный диабетической нефропатией, отличается значительным снижением уровня пептидов в плазме крови. Данные явления объясняют причину меньшей потребности в инсулине.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 134 страницах, иллюстрирована 27 рисунками и 10 таблицами. Список литературы содержит 215 наименования, из которых 97 на русском языке и 118 на иностранных языках.
