Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Этиология хронического панкреатита 11
1.2. Патогенез хронического панкреатита 15
1.3. Метаболизм и патологические эффекты этанола 18
1.4. Роль про- и антиоксидантов в развитии патологического процесса 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Постановка эксперимента 37
2.2. Приготовление биологического материала 40
2.3. Методы исследования 41
2.3.1. Определение уровня 2,3-дифосфоглицерата 41
2.3.2. Определение содержания молочной кислоты 41
2.3.3. Определение содержания пировиноградной кислоты 41
2.3.4. Определение активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, глутатионредукта-зы) 42
2.3.5. Определение концентрации восстановленного глутатиона 43
2.3.6. Определение концентрации малонового диальдегида 43
2.3.7. Определение активности маркёров цитолиза (а-амилазы и МВ-фракции креатинкиназы) 43
2.3.8. Определение активности миелопероксидазы 43
2.3.9. Определение продукции оксида азота лейкоцитами крови 44
2.3.10. Определение содержания гемоглобина и белка 45
2.3.11. Статистическая обработка результатов 45
Глава 3. Метаболические изменения в миокарде при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите и полупринудительной алкоголизации 46
3.1. Антиоксидантная защита 47
3.1.1. Супероксиддисмутаза и каталаза 47
3.1.2. Восстановленный глутатион и ферменты его обмена 50
3.2. Содержание лактата и пировиноградной кислоты 52
Глава 4. Метаболические изменения в печени при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите и полупринудительной алкоголизации 56
4.1. Антиоксидантная защита 56
4.1.1. Супероксиддисмутаза и каталаза 56
4.1.2. Восстановленный глутатион и ферменты его обмена 59
4.2. Содержание лактата и пировиноградной кислоты 62
Глава 5. Метаболические изменения в крови при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите и полупринудительной алкоголизации 67
5.1. Эритроциты 67
5.1.1. Метаболическая регуляция газотранспортной функции эритроцитов
5.1.2. Содержание лактата и пировиноградной кислоты 69
5.1 .3. Антиоксидантная защита 7Г
5.1.3.1. Супероксиддисмутаза и каталаза 71
5.1.3.2. Восстановленный глутатион и ферменты его обмена 74
5.2. Плазма крови 79
5.2.1. а-амилаза 79
5.2.2. Креатинкиназа 80
5.2.3. Миелопероксидаза 81
5.2.4. Малоновый диальдегид 84
5.3. Выработка оксида азота лейкоцитами: :: 86
Обсуждение результатов собственных исследований 90
Выводы 100
Практические рекомендации 101
Литература
- Метаболизм и патологические эффекты этанола
- Супероксиддисмутаза и каталаза
- Супероксиддисмутаза и каталаза
- Метаболическая регуляция газотранспортной функции эритроцитов
Введение к работе
Актуальность. Проблема злоупотребления алкоголем широко распространена во всем мире [H.L.Krober, 1998; T.M.Goldfinger, 2003; J.Cochrane et al., 2003; W.Hao et al., 2004; М.И.Давыдов и соавт., 2007; R.Caetano et al., 2009; K.Kypri et al., 2009]. Отрицательные последствия алкоголизации общества напрямую связаны с качеством алкогольных напитков и количеством потребляемого этанола в расчёте на одного жителя в год при условном переводе в 100%-ный спирт. По данным Росстата, в России этот показатель в 2006 г. составил 9,5 л.
Печень, поджелудочная железа (ПЖ), желудочно-кишечный тракт наиболее подвержены патологическому действию алкоголя. ПЖ более чувствительна к алкоголю и поэтому так называемое относительно безопасное для печени количество алкоголя для ПЖ меньше в 2 - 3 раза. При употреблении алкоголя его содержание в клетках ПЖ достигает 60% от концентрации его в крови. Между количеством потребленного в год алкоголя и заболеваемостью острым панкреатитом прослежена статистически значимая прямая корреляционная связь [В.М.Махов, 2006]. В развитых странах среди первичных форм хронического панкреатита (ХП) преобладает панкреатит алкогольной этиологии (от 70 до 80% всех случаев) [H.Cichoz-Lach et al., 2008].
Актуальность проблемы ХП обусловлена не только ростом заболеваемости и высокой летальностью при нем, но и трудностями диагностики, нечётким представлением о механизмах возникновения и развития данной патологии. В связи с этим возможности профилактики и консервативного лечения ХП остаются достаточно скромными. Роль биохимических поломок в развитии данного заболевания раскрыта недостаточно. В работах, посвященных поражению висцеральных органов при воспалении ПЖ [Г.П.Гидирим, 1980; В.И.Ковальчук, 1982; В.М.Лащевкер, 1990; С.А.Шалимов с соавт., 1990; И.П.Верещагин, 1996;
T.Arita et al, 1999; PJ.Mortele et al, 2000; L.Aparisi et al., 2008],
недостаточно внимания уделено молекулярным аспектам
патогенетической взаимосвязи между панкреатитом и патологией других внутренних органов. Не до конца ясна причина характерных изменений в интенсивности перекисного окисления липидов в периоды обострения воспалительного процесса в ПЖ и место этих процессов в структуре факторов, повреждающих панкреоциты [А.А.Гольдберг, 1987; О.Б.Любицкий с соавт., 1998]. Недостаточно внимания уделялось изучению функционирования антиоксидантной системы (АОС) организма в условиях развития ХП. Исследования данной системы могут оказаться полезными для понимания значения окислительного стресса в патогенезе изучаемого заболевания и его осложнений.
Цель работы - изучить характер изменений биохимических параметров, отражающих функциональное состояние и степень вовлеченности в патологический процесс органов жизнеобеспечения (печени, миокарда), а также клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов) при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите (ЭХАП).
Задачи исследования
Предложить новую, эффективную модель экспериментального хронического алкогольного панкреатита на крысах под контролем оценки выраженности деструктивных процессов в поджелудочной железе на основании показателей активности ферментов-маркёров цитолиза и морфологических находок.
Оценить наличие и степень тканевой гипоксии при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите по уровню 2,3-дифосфоглицериновой кислоты (2,3-ДФГ) и содержанию лактата в эритроцитах, печени и миокарде.
Охарактеризовать изменения в системе антиоксидантной защиты эритроцитов, печени и миокарда крыс при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите.
Оценить метаболическую активность лейкоцитов по активности миелопероксидазы (МПО) и продукции N0' при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите.
Новизна результатов исследования
Впервые разработана и апробирована модель экспериментального хронического алкогольного панкреатита на крысах (Патент №2394280) совместным применением растворов тритона Х-100 и этанола.
Получены новые данные о характере перестройки антиоксидантной системы и гликолитических процессов, имеющие свои особенности в эритроцитах, печени и миокарде при экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите.
Установлены новые критерии контроля хронизации воспалительного процесса в ткани поджелудочной железы (повышенная NO'-синтазная и миелопероксидазная активность лейкоцитов).
Впервые получены данные, указывающие на неоднозначность метаболического ответа клеток крови, печени и миокарда при алкоголизации и экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите.
Теоретическая значимость исследования Полученные факты способствуют расширению представлений о биохимических аспектах патогенеза первичной формы ХП, что может служить базой для дальнейших исследований в гастроэнтерологии.
Практическая значимость исследования Полученные результаты исследования могут быть отобраны в качестве информативных биохимических параметров прогнозирования
развития морфологических изменений в ткани ПЖ. Созданная новая модель ЭХАП позволит расширить масштаб исследований разных форм панкреатитов и уточнить роль алкоголя в патогенезе панкреатита. Основные положения, выносимые на защиту
Экспериментальный хронический алкогольный панкреатит характеризуется развитием тканевой гипоксии, синдрома цитолиза, активацией кислородзависимых механизмов фагоцитоза, снижением активности а-амилазы.
При экспериментальном хроническом алкогольном панкреатите регистрируется дисбаланс активности ферментов первой линии антиоксидантной защиты в эритроцитах и печени, и активация всех рассмотренных ферментов антиоксидантной системы в миокарде.
Повышенная NO'-синтазная активность лейкоцитов может рассматриваться как информативный показатель, предшествующий развитию морфологической картины хронического панкреатита.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 16 научных работ, включая 1 патент РФ на изобретение и 2 публикации в изданиях, определённых Высшей аттестационной комиссией.
Основные положения работы представлены и обсуждены на 63-й итоговой научной конференции молодых ученых с международным участием (Ростов-на-Дону, 2009); IX межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2010); V научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Завадские чтения» (Ростов-на-Дону, 2010); V научной сессии Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2010). Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры общей и клинической биохимии №1, кафедры общей и клинической биохимии №2, кафедры патологической
физиологии и биохимического отдела центральной научно-исследовательской лаборатории Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО РостГМУ Росздрава, г. Ростов-на-Дону, 2010).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), общей характеристики материала и методов биохимического исследования (глава 2), изложения полученных результатов (главы 3, 4, 5), обсуждения полученных результатов, выводов.
Метаболизм и патологические эффекты этанола
Этиловый спирт — прозрачная, бесцветная, летучая, легко воспламеняющаяся жидкость, обладающая характерным спиртовым запахом и жгучая на вкус. Наиболее частый и естественный путь поступления алкоголя в организм - через желудочнокишечный тракт. Этиловый спирт очень хорошо растворяется в воде, особенно в жирах. В связи с этим он легко всасывается слизистыми оболочками нижнего отдела желудка (20%) и тонкой кишки (80% ) [И.В.Маркова, М.В.Неженцева, 1997; П.Д.Шабанов, 2002, 2003] и по системе воротной вены поступает в печень, где метаболизируется до 90% этанола [О.М.Островский, М.Н.Садовник, 1984; Е.А.Лужников, 1994; В.П.Нужный, 2002; А.Ю.Магалиф, 2003], и некоторое количество окисляется в других органах.
Основной и более специфический путь распада алкоголя в печени начинается в присутствии кофермента НАД с участием фермента алкогольдегидрогеназы (АДГ) с последующим окислением образовавшегося уксусного альдегида (ацетальдегида) при участии фермента ацетальдегидрогеназы (АцДГ) в уксусную кислоту. Оба фермента работают только в присутствии НАД, то есть они НАД-зависимые [Э.А.Бабаян, 1987]. Окисление алкоголя в печени не зависит от его концентрации в организме, то есть здесь всегда окисляется относительно постоянное его количество: у здорового человека массой тела 70 кг окисляется приблизительно 7 г алкоголя в час [Ю.А.Захаров, 1999; В.П.Нужный, 2002; Е.В.Волчкова с соавт., 2002; П.Д.Шабанов, 2003].
В исследованиях на крысах было показано, что АДГ в основном представлена в печени, на втором месте по активности находится слизистая желудка. Ее активность составляет 3% от активности печеночной ЛДГ [H.A.Krebs et al, 1969].
Различные молекулярные формы фермента подразделяются на несколько классов (I, II, III, IV) в зависимости от состава, электрофоретических и кинетических свойств. Показано, что I класс изоферментов АДГ имеет наибольшее значение в метаболизме этанола. Изоформы АДГ широко представлены в различных тканях организма человека. Иммунно-химическим методом было показано, что АДГ определяется у человека, в почках, эндокринных железах, мозге и печени [R.Buhler et al., 1984], желудочно-кишечном тракте [D.M.Pestalozzi et al., 1982]. Экспрессия различных генов АДГ также отличается тканевой специфичностью, причем экспрессия генов АДГ I класса обнаружена в ткани печени, почек, гастроинтестинальном тракте и легких [S.Harada et al., 1978; H.W.Goedde et al., 1979]. АДГ также была обнаружена в мозге [N.H.Raskin, L.Sokoloff, 1968, 1972]. При хроническом введении этанола окисление его ускоряется благодаря увеличению активности АДГ вместе с реокислением НАДН в митохондриях. Однако, как было показано, этот процесс уже не зависит от челночной системы малат-аспартат, а происходит за счет увеличенной продукции аденозиндифосфата, который увеличивает митохондриальное НАДН-реокисление [R.Thurman, H.Brentzel, 1977; Ю.В.Буров, Н.Н.Ведерникова, 1985]. Учитывая малую активность АДГ мозга, а она составляет лишь 0,025% активности фермента в печени [Ю.В.Буров, Н.Н.Ведерникова, 1985; П.Д.Шабанов, 2002], можно утверждать, что мозг в метаболизме этанола участия не принимает. Однако, принимая во внимание данные о возрастании активности АДГ мозга по мере алкоголизации, можно предположить, что это вещество определяет чувствительность центральной нервной системы (ЦНС) к этанолу и, в частности, толерантность [Ю.В.Буров, Н.Н.Ведерникова, 1985].
Это подтверждается экспериментальными работами, в которых показано, что у крыс, потребляющих 10% раствор этанола в качестве естественного источника жидкости, активность АДГ мозга через 2 недели увеличивается вдвое и продолжает увеличиваться по мере дальнейшей алкоголизации [Ю.В.Буров, Н.Н.Ведерникова, 1985]. В тоже время, активность АДГ печени, а также АцДГ печени и мозга не изменялась на протяжении тех же сроков алкоголизации [N.Raskin, 1973]. В этих же экспериментах показано, что с увеличением активности мозговой АДГ снижаются токсические эффекты алкоголя, то есть наблюдается развитие толерантности к некоторым из них.
Помимо основного пути окисления алкоголя с участием вышеуказанных НАД-зависимых ферментов, АДГ, обеспечивающей превращение 75%-90% поступившего в организм алкоголя [C.Lieber, 1994; В.П.Нужный, 2002; Ю.Е.Морозов, 2003], существуют также другие пути окисления этанола - микросомальная этанолокисляющая система (МЭОС) и каталаза, локализующаяся в пероксисомах. Микросомальный и каталазные пути окисления являются минорными и включаются в метаболизм алкоголя как адаптивные [Ю.Е.Морозов, 2003].
Главным элементом МЭОС является НАДФН - зависимая система цитохрома Р450 [C.S.Lieber, 1997]. Используя микросомальную фракцию Р-450, изолированную из печени крыс, получавших этанол, была продемонстрирована ее индукция в результате хронического употребления алкоголя [K.Ohnishi, C.S.Lieber, 1977]. Км МЭОС для этанола достаточно высока, по сравнению с АДГ печени (8-10 ммоль/л в сравнении с 0,2-2 ммоль/л для АДГ), которая важна для метаболизма низких концентраций этанола. Однако, при высоких концентрациях этанола в крови, что наблюдается при хроническом алкоголизме, значение МЭОС в метаболизме этанола значительно возрастает. Значимость МЭОС in vivo подтверждается использованием ингибиторов АДГ, действие которых обусловливает рост концентрации этанола, и соответственно, повышение уровня метаболизма этанола МЭОС. Более того, в исследованиях на животных показано сохранение высокого уровня метаболизма этанола при повышенной активности МЭОС у мышей с генетическим дефектом АДГ [Y.Shigeta et al., 1984]. Высокая активность МЭОС может быть ответственна за повышенный метаболизм этанола, что ведет в свою очередь к интенсивному накоплению ацетальдегида и связанных с этим ряд токсических эффектов этанола на клеточном и субклеточном уровнях [C.S.Lieber, 1997].
Индуцированная этанолом форма цитохрома Р-450, выделенная из микросом печени человека в активной каталитической форме и названная CYP2E1 или 2Е1, катализирует окисление этанола на более высоком уровне по сравнению с другими изоформами Р-450 [J.M.Lasker et al., 1987; E.Plee-Gautier, 2001]. Более того, CYP2E1 катализирует окисление более чем 75 известных ксенобиотиков, включая этанол, лекарственные препараты и ряд потенциальных канцерогенов. Полагают, что ген CYP2E1 является одним из возможных кандидатных генов, предрасполагающих к развитию алкогольного поражения печени [L.G.Carr et al., 1995; D.Lucas et al., 1996]. Молекулярный механизм, лежащий в основе индукции CYP2E1 остается спорным и не до конца изученным. Эксперименты на животных выявили транскрипционную активацию гена 2Е1 или стабилизацию 2Е1 мРНК, что может являться возможным механизмом увеличения продукции фермента в ответ на действие этанола [B.J.Song et al., 1986; T.D.Porter et al., 1989]. Повышение уровня как 2E1 белка в печени, так и мРНК, было также обнаружено у активно пьющих пациентов, что подтверждает этанол-опосредованный механизм стабилизации мРНК и/или транскрипционной активации гена 2Е1 у человека [T.Takahashi et al., 1993].
Супероксиддисмутаза и каталаза
В кардиомиоцитах человека митохондрии являются главными эндогенными продуцентами 0 2 и Н2О2. В физиологических условиях в митохондриях 0 2 и Н2С 2 метаболизируются СОД и ГПО, в результате их концентрация находится на низком стационарном уровне [B.D.Freeman, 1984; B.P.Yu, 1994].
В отличие от микросом с высоким содержанием каталазы, в митохондриях количество этого ферментативного антиоксиданта невелико, а в митохондриях из мышечных клеток она вообще не выявляется [J.F. Turrens, 2003]. Но, несмотря на это, каталаза является эффективным природным антиоксидантом и в миокарде крыс определяется в достаточном количестве, чтобы судить о динамических изменениях этого фермента.
Результаты исследования активности СОД и каталазы у экспериментальных животных с неповрежденной тритоном Х-100 ПЖ (группа сравнения) на 2-м и 3-м месяце ППА представлены в таблице №1. Как видно из таблицы, активность СОД повышалась достоверно на 10% (р 0,05) и 22% (р 0,05) соответственно по сравнению с контрольной группой
(1-я группа). Активность каталазы изменяется иначе (рис. 5). Так, после предварительного угнетения на 2-м месяце на 61% (р 0,05), повысилась на 3-м месяце на 45% (р 0,05). Обращает внимание, что в миокардиоцитах крыс с поврежденной тритоном Х-100 ПЖ (3-я группа) уровень активности СОД и каталазы изменяется синхронно - достоверно повышался, превысив значения контрольной группы на 2-м месяце соответственно на 17% (р 0,05) и 10% (р 0,05) и на 3-м месяце на 21%(р 0,05) и 48%(р 0,05). Активность СОД и каталазы животных 3-й группы (крысы с поврежденной тритоном Х-100 ПЖ) на 2-м месяце эксперимента достоверно превысила, а на 3-м месяце не - отличалась от значений группы сравнения соответствующихсроков(р 0,05) -- ч-(рис. 4 и 5).
Данные изменения могут говорить о более значительной реакции первой линии АОЗ миокарда при повреждении ПЖ тритоном Х-100, что предполагает вовлечение этого органа в патологический процесс, выраженное в большей степени при моделировании ЭХАП, чем при ППА.
Для удаления гидроперекисей липидов и Н202 в митохондриях служат ГПО, в том числе и ГПО гидроперекисей фосфолипидов [K.Nomura et al., 2000]. По-видимому, в защите митохондрий от Н202 и гидроперекисей липидов ведущая роль принадлежит SH-содержащим соединениям (глутатиону), ведь образующийся в митохондриальной цепи переноса электронов 0 2 при взаимодействии с СОД и NO эффективно переводится в Н202 и ONOOH, с удалением которых возникают определенные проблемы, так как в митохондриях практически нет каталазы.
Как следует из таблицы №2, содержание ВГ в миокарде крыс 2-й-группы на 2-м и 3-м месяце ППА повысилось соответственно на 10% (р 0,05) и 94% (р 0,05) относительно контрольной группы.
Активность ГР повысилась в рассматриваемые сроки на 21% (р 0,05) и 82% (р 0,05) относительно интактных животных. Повышению активности ГПО на 3-м месяце на 50% (р 0,05) относительно контроля предшествовало понижение на 2-м месяце на 15% (р 0,05). Динамика содержания ВГ животных с поврежденной тритоном Х-100 ПЖ (3-я группа) имела схожую картину с таковой в группе сравнения, достоверно превысив значения 2-й группы только на 2-м месяце на 34% (р 0,05) (рис. 6). Активность ГР повышалась на 2-м и 3-м месяце на 30% (р 0,05) и 83% (р 0,05) относительно контрольных цифр, достоверно превышая на 2-м месяце значения группы сравнения (р 0,05) (рис. 7). Активность ГПО изменилась только на 3-м месяце, повысившись на 65% (р 0,05), превысив значения группы сравнения (р 0,05) (рис. 8).
В таблице №3 представлена динамика уровня лактата и ПВК в миокарде крыс. При рассмотрении содержания лактата в миокарде у животных 2-й группы на 2-м месяце ШЛА достоверного изменения содержания лактата не наблюдалось. На 3-м месяце отмечается резкое повышение на 332% (р 0,05). Уровень ПВК достоверно был снижен во всех группах в рассматриваемых сроках в среднем на 33% (р 0,05) относительно контроля (рис. 10). У животных 3-й группы на 2-м месяце эксперимента наблюдалось повышение содержания лактата на 55% (р 0,05), а на 3-м месяце содержание лактата достигло значений группы сравнения того же срока (рис. 9).
Наблюдаемое повышение уровня лактата на фоне снижения содержания ПВК свидетельствует о переходе сердечной мышцы на анаэробный гликолиз, что можно расценивать как кратковременную защитную реакцию, необходимую для поддержания энергетики клетки. Данные изменения говорят в пользу развившейся тканевой гипоксии, более выраженной при формировании ЭХАП, что обуславливает более тяжелое его течение. Вызванные патологическим влиянием этанола гипоксия, нарушение содержания внутриклеточного Са+, гиперкатехоламинемия усиливают продукцию прооксидантов [А.Н.Леденёв, Э.К.Рууге, 1985; M.L.Weisfeldt et -аЦ 1988; М.В.Биленко, 1989; L.Xiao et al.,- 2002], что требует соответствующей активации АОС. Рассмотренная в эксперименте динамика лактата и активности АОС (рис. 18) позволяет предположить больший вклад окислительного стресса в поражении миокарда при формировании ЭХАП, чем при ППА.
Супероксиддисмутаза и каталаза
СОД содержится в печени в максимальном количестве по сравнению с другими органами [S.L.Marklund, 1984]. Каталаза в клетках локализована преимущественно (80 %) в пероксисомах, (в гепатоцитах на каталазу приходится 40% белка пероксисом), в цитозоле выявляется около 20 % от общего содержания фермента.
Активность СОД в печени крыс группы сравнения повышалась на 2-м и 3-м месяце ППА соответственно на 112% (р 0,05) и 182% (р 0,05) относительно контрольных значений. Активность каталазы последовательно снижается через 2 и 3 месяца соответственно на 53% (р 0,05) и 86% (р 0,05). Уровень активности СОД у крыс с поврежденной тритоном Х-100 ПЖ (3-я группа) оказавшись повышенным на 2-м и 3-м месяце на 142% (р 0,05) и 191% (р 0,05) относительно контрольных значений, достоверно превысил значения группы сравнения тех же сроков (р 0,05) (рис. 11). Активность каталазы имеет иную, по сравнению со 2-й группой динамику: повысившись через 2 месяца на 7% (р 0,05), снизилась на 3-м месяце на 86% (р 0,05) (рис. 12).
Учитывая большую эффективность каталазы, чем ГПО в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями Н2О2 [J.W.Eaton, 1991; M.D.Scott et al., 1991], можно утверждать, что выраженное угнетение активности каталазы печени при чрезмерной активации СОД говорит о развившейся декомпенсации в АОС этого органа.
Открытие глутатиона не случайно было связано с печенью — в этом органе находится самый большой запас глутатиона организма млекопитающих. Основная часть печёночного глутатиона приходится на восстановленную форму. ВГ печени участвует во всевозможных процессах обезвреживания ксенобиотиков, занимая ведущее место в детоксикационной функции этого органа.
Как следует из таблицы №5, уровень ВГ в печени крыс группы сравнения на 2-м месяце ППА снизился на 20% (р 0,05) и резко повысился к 3-му месяцу на 125% (р 0,05) относительно значений контрольной группы. Активность ГР и 11Ю повышалась на 2-м месяце соответственно на 15% (р 0,05) и 24% (р 0,05) и на 3-м месяце на 33% (р 0,05) и 41% (р 0,05). Повышению на 107% (р 0,05) на 3-м месяце уровня ВГ в печени крыс с поврежденной тритоном Х-100 ПЖ относительно контрольных значений предшествовало его снижение на 17% (р 0,05) на 2-м месяце (рис. 13). Активность ГР и ГПО повышалась соответственно на 2-м месяце на 28% (р 0,05) и 26% (р 0,05) и на 3-м месяце на 63% (р 0,05) и 50% (р 0,05) (рис. 14 и 15). Различия между значениями рассматриваемых показателей 2-й и 3-й групп достоверны (р 0,05), за исключением активности ГПО и уровня ВГ на 2-м месяце эксперимента.
На фоне различных патологических процессов направленность метаболизма глюкозы в органах, нуждающихся в потреблении больших количеств кислорода, может частично переходить на анаэробный путь. Если в органе с аэробной ориентацией обмена накапливается лактат, это говорит о том, что орган испытывает гипоксию. В отношении печени оценка данных по лактату является сложной задачей, тем более при патологиях с генерализованным нарушением гемодинамики и микроциркуляции, при которых тканевая гипоксия может возникать в различных органах. Дело в том, что при сохранении кровообращения избыток лактата удаляется из тканей, страдающих гипоксией и метаболизируется печенью или миокардом. В здоровой печени примерно 1/5 поступающего лактата используется на собственные нужды (подвергается окислению до конечных продуктов), а 4/5 — ресинтезируются в глюкозу в ходе интенсивно идущего в печени процесса глюконеогенеза.
Как следует из таблицы №6, содержание молочной кислоты в печени крыс на фоне ППА возрастает на 138% (р 0,05) и 682% (р 0,05) на 2-м и 3-м месяцах соответственно относительно интактных животных. Содержание ПВК на 2-м месяце снизилось на 75% (р 0,05), а на 3-м месяце составило 54% (р 0,05) от контроля. Уровень лактата у крыс с поврежденной тритоном Х-100 ПЖ на 2-м месяце поднялся на 246% (р 0,05) относительно контрольных цифр, оказавшись выше значений группы сравнения того же срока (р 0,05) (рис. 16). На 3-м месяце содержание лактата достигло цифр 3 63 й группы. Уровень содержания ПВК достоверно не отличался от такового в группе сравнения на всех рассматриваемых сроках (рис. 17).
Метаболическая регуляция газотранспортной функции эритроцитов
Особенностью гликолиза в эритроцитах является наличие шунта, приводящего к образованию 2,3-ДФГ — аллостерического регулятора сродства НЬ к кислороду.
В таблице №7 представлены данные анализа 2,3-ДФГ. У животных 2-й группы наблюдается повышение уровеня 2,3-ДФГ только на 3-м месяце эксперимента соответственно на 28% (р 0,05). В тоже время у крыс 3-й группы уровень 2,3-ДФГ значительно повышается на 2-м месяце на 292% (р 0,05) по отношению к контрольным цифрам и на 3-м месяце остается достоверно повышенным на 44% (р 0,05) (рис. 22). Полученные данные показывают, что в ответ на развившуюся гипоксию возникает компенсаторная реакция со стороны клеток красной крови в виде повышения синтеза 2,3-ДФГ, играющего адаптационную роль, уменьшая сродство НЬ к кислороду, что облегчает переход кислорода в клетки тканей. Таким образом, полученный материал свидетельствует о манифестации только наметившихся гипоксических сдвигов через 2 месяца эксперимента у крыс 2-й группы, в то время как у животных с формирующимся ЭХАП того же срока наблюдается развитие выраженной компенсаторно-приспособительной реакции за счет включения модуляционного механизма являющегося отражением более тяжелой генерализованной гипоксии. На 3-м месяце у животных 3-й группы данные компенсаторные реакции остаются более выраженными, чем у крыс, ППА того же срока. Это указывает на существенно более выраженное развитие гипоксии у животных с ЭХАП.
Уровень содержания лактата в эритроцитах животных 2-й группы на 2-м и 3-м месяце повышался на 26% (р 0,05) и 369% (р 0,05) соответственно относительно контрольных значений. Содержание ПВК в эритроцитах крыс снижалось на 2-м и 3-м месяце эксперимента на 40% (р 0,05) и 53% (р 0,05) соответственно (рис. 21). В 3-й группе отмечалось более выраженное повышение лактата в рассматриваемых сроках на 46% (р 0,05) и 390% (р 0,05) (рис. 20). Уровень ПВК снижался на 2-м и 3-м месяце на 50% (р 0,05) и 55% (р 0,05) соответственно.
Рассматривая уровень содержания молочной кислоты в эритроцитах, можно предположить активацию анаэробного гликолиза в этих клетках. Реакцию эритроцитов на ППА и повреждение ткани ПЖ тритоном Х-100 в виде усиленного образования лактата можно расценивать как отражение генерализованной гипоксии в организме, более выраженной при моделировании ЭХАП. 2 окисляет фосфолипиды мембран [Б.П.Шаронов, Н.Ю.Говорова, 1988; MBoes et al., 1989], что может приводить к разрушению эритроцитов [A.Verma et al., 1993, S.J.Weiss, 1980]. Существует также мнение [R.Munday, C.C.Winterboume, 1989], что удаление 0 2 необходимо для защиты от окисления внутриклеточного глутатиона, который в восстановленном состоянии выступает эффективной ловушкой радикалов. Вместе с тем СОД, удаляя 0"2, не даёт ему взаимодействовать с N0 , тем самым предотвращая образование пероксинитрита (гораздо более опасного прооксиданта, чем Н2О2). Поэтому повышенная активность СОД эритроцитов в условиях окислительного стресса при адекватной активности каталазы и глутатионовой системы утилизирующих перекиси в биологическом смысле выгодна.
Несмотря на высокую активность каталазы в эритроцитах, считается, что в физиологических условиях роль этого антиоксидантного фермента в разложении Н202 невелика из-за низкого сродства к данному субстрату. При умеренном накоплении H2O2 активность каталазы начинает возрастать, но чрезвычайно большие количества Н202 угнетают активность каталазы, образуя с ней неактивные комплексы. Интересно отметить, что по отношению к СОД неорганические перекиси, в том числе и Н202, являются необратимыми ингибиторами, так как восстанавливают медь в активном центре фермента [Б.С.Маринов и соавт., 1987; Е.Е.Дубинина, Д.А.Шугалей, 1993; Д.В.Черданцев, Ю.С.Винник, 2002].
Эритроциты содержат богатые запасы глутатиона, причём 95% приходится на восстановленную форму. В норме практически весь глутатион ассоциирован с форменными элементами крови, а в плазме отсутствует (его концентрация в эритроцитах в 100 раз выше, чем в плазме). Из клеток эритроидного ряда самый высокий уровень ВГ отмечается в ретикулоцитах [М.В.Кения с соавт., 1993; Д.В.Черданцев, Ю.С:Винник, 2002]. ВГ активно участвует в защите эритроцитов от ксенобиотиков, в особенности от гемолитиков и метгемоглобинообразователей, а также служит буфером от избытка окислителей. Кроме того, показано, что ВГ может обратимо образовывать дисульфидные связи с белком эритроцитарной мембраны — спектрином, защищая красные кровяные тельца от разрушения [Л.А.Тиунов, В.А.Иванова, 1988]. Существуют данные о том, что система глутатиона способствует снижению сродства НЬ к кислороду, облегчая передачу кислорода тканям [Д.В.Черданцев, Ю.С.Винник, 2002].
АОС «ГПО - ВГ - ГР» играет ключевую роль в защите эритроцитов млекопитающих: входящее в состав НЬ железо преимущественно 0-1 представлено закисной формой (Fe ), однако под действием Н202 оно легко окисляется до Fe , в результате чего образуется не способный переносить кислород метгемоглобин. Разложение Н202 ГПО предотвращает образование метгемоглобина и реакционных ОН-радикалов, что способствует сохранению функциональной активности эритроцитов. Недостаток синтеза глутатиона в результате инактивации у-глутамилцистеинсинтетазы или снижение активностей ГПО и ГР приводят к развитию гемолитической анемии [E.Beutleretal., 1990].
