Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Этиопатогенез и возрастные особенности сахарного диабета 2 типа (обзор литературы) 13
1.1. Эпидемиология сахарного диабета 2 типа 13
1.2. Критерии диагностики и состояния компенсаторных механизмов при сахарном диабете 2 типа 16
1.3. Патогенез и возрастные особенности течения СД 2 типа . 19
1.4. Роль гипергликемии в развитии окислительного стресса и старении организма 28
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Характеристика объекта исследования 38
2.2. Получение биологического материала 41
2.3. Лабораторно-биохимические методы исследования 42
2.4. Статистическая обработка результатов 50
Глава 3. Результаты исследования 52
3.1. Состояние углеводно-энергетического обмена у
пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена 52
3.1.1. Содержание глюкозы 53
3.1.2. Содержание С-пептида 55
3.1.3. Активность гексокиназы 58
3.1.4. Содержание 2,3-дифосфоглицерата 60
3.1.5. Активность фосфогексокиназы 62
3.1.6. Содержание пировиноградной и молочной кислот 64
3.1.7. Коэффициент лактат/пируват 67
3.1.8. Активность гликогенфосфорилазы 70
3.1.9. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 72
3.2. Состояние газотранспортной системы крови у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена 77
3.2.1 Уровень гемоглобина 77
3.2.2. Содержание эритроцитов 79
3.2.3. Уровень гликозилированного гемоглобина 80
3.3. Антиоксидантная ферментативная система крови у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена 85
3.3.1. Активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы 85
3.3.2. Активность каталазы 88
3.3.3. Состояние глутатионзависимого ферментного комплекса 91
3.4. Оценка стабильности мембран эритроцитов, уровня вторичных продуктов ПОЛ у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена 103
3.4.1. Содержание внеэритроцитарного гемоглобина 103
3.4.2. Содержание малонового диальдегида . 105
3.4.3. Оценка степени деструкции компонентов мембран эритроцитов (ФРПМ) . 108
3.5. Статистический анализ связей между изучаемыми параметрами у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена 112
Обсуждение полученных результатов 123
Выводы 146
Список сокращений и условных обозначений 148
Список литературы
- Критерии диагностики и состояния компенсаторных механизмов при сахарном диабете 2 типа
- Лабораторно-биохимические методы исследования
- Содержание 2,3-дифосфоглицерата
- Оценка стабильности мембран эритроцитов, уровня вторичных продуктов ПОЛ у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема сахарного диабета 2 типа (СД 2 типа) привлекает к себе внимание врачей разных специальностей, так как его распространнность в мире увеличивается и приобретает характер пандемии, которая уже охватила практически все государства, в том числе и Россию (Дедов И.И. и др., 2011; Diabetes atlas, 2009).
В патогенезе СД 2 типа участвуют несколько компонентов: генетические, средовые и конечно, возраст. С возрастом увеличивается патологическая поражнность организма, число заболеваний растет, определенная часть их переходит в хронические формы (Шабалин В.Н., Васильчиков В.М., 2005). Сахарный диабет 2 типа в пожилом возрасте - проблема современной медицины, так как ставит перед врачами задачу коррекции не только углеводного обмена, но и всех систем организма (Nathan D.M. et al., 2009). Основным патогенетическим механизмом развития СД 2 типа является возрастное снижение толерантности к глюкозе, причм наибольшие изменения претерпевает постпрандиальная гликемия, в то время как гликемия натощак изменяется незначительно. Вопрос о том, что может лежать в основе нарушений толерантности, остатся открытым.
Большое число публикаций посвящено диагностике, лечению и
профилактике СД 2 типа, в том числе и у людей пожилого возраста, но на
сегодняшний день это заболевание остатся неизлечимым, поскольку
патогенетические механизмы, лежащие в основе этой болезни, остаются до конца не выясненными (ADA. Standarts of Medical Care in Diebetes, 2010; Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2006; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2009).
Несмотря на очевидные успехи последних десятилетий в области изучения патогенеза СД 2 типа, комплексных данных о состоянии углеводно-энергетического обмена, газотранспортной, антиоксидантной систем крови, а также данных о состоянии мембран эритроцитов в зависимости от возраста больных и степени компенсации углеводного обмена в доступной литературе нет. Клетки крови объединяют работу многих физиологических систем организма и несут информацию о метаболическом потенциале организма и уровне его адаптивных возможностей. В этой связи актуальным и перспективным для решения как теоретических, так и практических задач является анализ
особенностей метаболических изменений в компонентах крови больных разных возрастных групп с акцентом на определение роли возраста и степени компенсации углеводного обмена при СД 2 типа. Этой важной социальной и медико-биологической проблеме посвящено данное диссертационное исследование.
Цель работы. В зависимости от возраста пациенток и стадии компенсации углеводного обмена определить характер метаболических изменений в эритроцитах и плазме крови, оценить их информативность и разработать способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи исследования:
-
Проанализировать характер изменений показателей углеводного обмена в эритроцитах в зависимости от возраста пациенток и стадии компенсации углеводного обмена.
-
Определить состояние основных параметров газотранспортной системы эритроцитов у пациенток разных возрастных групп при суб- и декомпенсированном течении СД 2 типа для оценки степени выраженности гипоксии.
-
Определить активность ферментативных антиоксидантов в крови, стабильность мембран эритроцитов, содержание вторичных продуктов перекисного окисления липидов у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста и степени компенсации заболевания.
-
Провести статистический анализ связей между параметрами углеводно-энергетического обмена, газотранспортной, антиоксидантной систем крови, стабильности мембран эритроцитов и вторичных продуктов перекисного окисления липидов для определения их роли в формировании компенсаторно-адаптивных механизмов в условиях различной толерантности к гипергликемии у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста.
Научная новизна результатов. Впервые показано, что развитие гипоксии на фоне СД 2 типа сопровождается активацией модуляционных и количественных показателей адаптации и зависят от возраста пациенток, а уровни общего
гемоглобина (HbА) и гликозилированного гемоглобина (HbA1C) зависят от стадии углеводного обмена.
Впервые установлено, что изменения углеводно-энергетического обмена в эритроцитах при СД 2 типа имеют возрастные особенности. Установлено, что у пожилых пациенток при суб- и декомпенсации происходит снижение скорости включения глюкозы в гликолитические процессы, в то время как у пациенток более молодого возраста выявляется иная закономерность: в стадии субкомпенсации происходит активация начальных этапов пентозо-фосфатного пути (ПФП), а в стадии декомпенсации - выраженная активация гликогенолиза.
В модельном эксперименте на изолированных фракциях эритроцитов пациенток с СД 2 типа с добавлением в среду гликогена установлено, что активность фосфорилазы прогрессивно возрастает с увеличением возраста пациенток и степени тяжести заболевания. Эти данные указывают на приспособительный характер клеточных реакций, направленных на поддержание структурно-функциональной целостности эритроцитов.
Впервые получены сведения об активации ферментов антиоксидантоной защиты (АОЗ) в эритроцитах на фоне роста содержания внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и малонового диальдегида (МДА) в плазме крови, зависящие от возраста и отражающие включение внутриклеточных механизмов защиты от накопления токсических продуктов в «окружающей среде» по мере роста гипергликемии.
Впервые на основании анализа содержания восстановленного глутатиона (GSH) и МДА в крови рассчитан фактор риска пероксидации мембран эритроцитов (ФРПМ), указывающий на то, что у пациенток разных возрастных групп в стадии декомпенсации наиболее выражено усиление дезинтеграционных процессов, снижающих устойчивость эритроцитов к внутренним повреждающим факторам.
Впервые методом корреляционного анализа определены метаболические блоки, свидетельствующие о функциональной взаимосвязи между углеводно-энергетическим обменом, газотранспортной, антиоксидантной систем крови и структурным состоянием мембран эритроцитов. На этом основании определена роль эритроцитов в формировании общего адаптационного синдрома в условиях
различной толерантности к гипергликемии у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста.
Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом
плане полученные результаты, основывающиеся на характере изменений
параметров углеводно-энергетического обмена, газотранспортной и
антиоксидантной систем крови и структурного состояния мембран эритроцитов, вносят вклад в понимание роли метаболических изменений в эритроцитах, приводящих к изменению их биологических свойств, степень выраженности которых отражает приспособительные возможности организма в условиях гипергликемии в разных возрастных группах при СД 2 типа.
Научный интерес представляют данные, свидетельствующие об
особенностях молекулярных перестроек у пациенток более молодого возраста,
направленных на активацию ПФП или включение альтернативных путей
поддержания пула углеводов, например, за счт усиления гликогенолиза, а также
усиление образования фруктозо-6-фосфата в фосфогексокиназной реакции (ФГИ-
реакции), возникающее в ответ на снижение активности гексокиназы, для
поддержания гликолиза и предотвращения осмотического лизиса. Результаты
работы вносят вклад в понимание патогенетической роли метаболических сдвигов
в эритроцитах в условиях формирования тканевой гипоксии на фоне
гипергликемии, зависящих от степени тяжести патологического процесса и
возраста пациенток. Выявленное нарастание гипоксии с возрастом и снижение
компенсаторных возможностей организма указывают на необходимость
применения антигипоксантов и антиоксидантов в комплексной терапии СД 2 типа.
На основании изменений активности ферментов Cu,Zn-
супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД), глутатионпероксидазы (ГПО),
фосфогексокиназы (ФГИ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (гл-6-ФДГ) на разных стадиях развития СД 2 типа разработан способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа (заявка на изобретение № 2012153040/15(084445), приоритет от 07.12.2012). Материалы исследования используются в учебном процессе на кафедре общей и клинической биохимии №1 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Изменения активности ключевых ферментов углеводного обмена в эритроцитах имеют возрастные отличия и отражают степень тяжести заболевания. У пациенток более молодого возраста в стадии субкомпенсации углеводного обмена в эритроцитах выявлена активация начальных этапов пентозо-фосфатного пути. У пожилых пациенток при стадии декомпенсации происходит тотальное снижение скорости включения глюкозы в окислительные процессы на фоне выраженной активации гликогенолиза и гипергликемии.
-
Течение СД 2 типа характеризуется развитием хронической гипоксии у пациенток разных возрастных групп, что подтверждается активацией в эритроцитах модуляционных и количественных показателей адаптации, достигающих максимальной выраженности у пожилых пациенток в стадии декомпенсации углеводного обмена.
-
С увеличением возраста пациенток регистрируется усиление ферментативной антиокислительной защиты эритроцитов, что подтверждается корреляционными связями между ростом активности ферментов первой и второй линии защиты у пациенток пожилого возраста. В стадии декомпенсации СД 2 типа в разных возрастных группах регистрируется усиление процессов деструкции мембран эритроцитов.
-
Рассчитанные нами коэффициенты эффективности ферментной антиоксидантной защиты эритроцитов (К1 = Cu,Zn-СОД/ГПО) и интенсивности гликолиза (К2=ФГИ/гл-6-ФДГ) отображают уровень компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа.
Апробация работы. Основные результаты исследования доложены на VI,
VII, IX межвузовских конференциях с международным участием «Обмен веществ
при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2007, 2008, 2010),
международной научной конференции «Социально-политические проблемы в условиях глобализации» кафедры политической социологии ЮФУ (Ростов-на-Дону, 2009), V Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2011), VII научно-практической конференции молодых учных с международным участием (Ростов-на-Дону, 2012), на I Международной открытой научно-практической конференции «Предупреждение преждевременного старения
женщины как инновационная система здоровьесбережения в условиях информационного общества» (Киев, 2013), X Международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: инновации в современном мире» (Москва, 2013). Автор лично принимала участие в сборе материала, лабораторном исследовании, статистическом анализе, в обработке материала и написании глав диссертации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 7 – в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Подана заявка на изобретение «Способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при СД 2 типа» (заявка № 2012153040/15(084445), приоритет от 07.12.2012). Общий объем публикаций составил 2,36 п.л., личный вклад - 88 %.
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 224 источников, из них 147 – отечественных и 77 зарубежных. Диссертационная работа иллюстрирована 17 рисунками и содержит 19 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика объекта исследования. В исследовании приняли участие 86 пациенток с СД 2 типа, первично госпитализированных в эндокринологическое отделение Ростовского государственного медицинского университета (зав. отд., д.м.н., профессор С.В. Воробьв). Критериями включения пациенток в исследования явились: женский пол, возраст от 40 до 74 лет, наличие документированного СД 2 типа в стадии субкомпенсации или декомпенсации углеводного обмена, наличие информированного согласия на участие в исследовании. Критериями исключения явились: сахарный диабет 1 типа, сопутствующие онкологические и гематологические заболевания, терминальная почечная и печеночная недостаточность, соматические и неврологические заболевания. Все пациентки были разделены на две возрастные группы, каждая из которых была разделена на две подгруппы в зависимости от стадии компенсации углеводного обмена.
Первая подгруппа - пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (п=22, средний возраст 51,09 + 0,95 лет); вторая подгруппа - пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации (п=22, средний возраст 48,7 + 1,17 лет); третья подгруппа -пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (п=21, средний возраст 67,14 + 1,13 лет); четвёртая подгруппа - пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации (п=21, средний возраст 67,6 + 0,48 лет). Для каждой возрастной группы формировалась своя контрольная группа из женщин без признаков СД 2 типа и других сопутствующих заболеваний: 1 группа - 25 женщин в возрасте 52,82±0,36, 2 группа - 25 женщин в возрасте 67,72±0,75 года.
Лабораторно-биохимические методы исследования. Исследовались эритроциты и плазма венозной крови. Кровь у пациенток брали утром натощак путм венепункции локтевой вены. Плазму получали из венозной крови, стабилизированной гепарином (в соотношении 1:10) с последующим центрифугированием (320g, 15 минут). Эритроциты отделяли от лейкоцитов и тромбоцитов в 3% желатиновом растворе с последующим центрифугированием (320g, 15 минут). После отделения плазмы и верхнего слоя клеток эритроциты отмывали охлажднным физиологическим раствором (2-3 раза). Для получения плотного осадка при определении субстратов отмытые эритроциты центрифугировали при 640g в течение 30 минут. Для определения активности Cu,Zn-СОД использовали гемолизат, полученный разведением цельных эритроцитов в соотношении 1:14, для определения активности фосфорилазы - в соотношении 1:20, для определения активности глутатионзависимых ферментов - в соотношении 1:40, для определения активности каталазы - в соотношении 1:200.
Уровень HbАlС определяли на биохимическом экспресс-анализаторе DCA
2000+ (Bayer Corp., USA). Уровень НЬА определяли на гематологическом
анализаторе РСЕ-210 (Erma Inc., Japan). В цельных эритроцитах определяли
активность гексокиназы (по Лугановой И.С., 1964), содержание 2,3-
дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) по неферментативному методу, предложенному
Dyсe B.F., Bessman S.P. (1973) в модификации Лугановой И.С., Блинова М.Н.
(1975), активность фосфогексоизомеразы (ФГИ) (Езерский Р.Ф., 1960 в
модификации Микашинович З.И., 1989), содержание пировиноградной кислоты
(ПВК) по методу Freedman и Haugen (1943) в модификации П.А. Бабаскина (А.С.
СССР №877436, 1981) и молочной кислоты (лактат) - по реакции с
параоксидифенилом (Меньшиков В.В., 1987), активность фосфорилазы (КФ
2.4.1.1.) определяли по методу Hers, описанному Поповой И.А. и др. (1992),
активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49) (гл-6-ФДГ) определяли
по методу Корнберга Л. в модификации Захарьина Ю.Л. (1967). В гемолизате
эритроцитов определяли активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД) по
методу Misra H.P. и Fridovich J. (1972), описанному Саркисяном О.Г. (2000),
каталазы (КАТ) по методу Королюка М.А. и соавт. (1988), глутатионпероксидазы
(КФ1.11.1.9) (ГПО) по методу Моина В.М. (1986), глутатионредуктазы (ГР) по
методу Юсуповой Л.Б. (1989), а также содержание восстановленного глутатиона
(GSH) проводили колориметрическим методом по Ellman G.L. (1959). В плазме
крови определяли содержание внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ)
спектрофотометрическим методом по Каракашову А.В, Вичеву В.П. (1973) и содержание малонового диальдегида (МДА) по Стальной И.Д. (1974). Количество эритроцитов в крови определяли путм подсчта в камере Горяева по методу, описанному в руководстве под редакцией Базарова М.А. (Базаров М.А., 1988).
Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью
программы STATISTICA 7.0 (Stat. Soft. Inc., США) с определением среднего
значения и стандартной ошибки средней величины. Достоверность различий между
опытными и контрольными группами оценивали по t-критерию Стьюдента.
Отклонения между рядами считали достоверными при p<0,05-0,001.
Корреляционный анализ проводили с использованием линейного коэффициента корреляции (коэффициента корреляции Пирсона, r).
Критерии диагностики и состояния компенсаторных механизмов при сахарном диабете 2 типа
Сахарный диабет (СД) является одним из наиболее распространнных заболеваний среди населения. СД – это хроническое, потенциально инвалидизирующее заболевание, разработка эффективного лечения которого требует усилий как теоретических так и практических. По определению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (1999), сахарный диабет – это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся
гипергликемией, которая является результатом дефектов секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов (WHO/NCD/NCS/1999; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2006). Согласно классификации ВОЗ (1999) сахарный диабет типа 2 (СД 2 типа) сопровождается преимущественной инсулинорезистентностью и относительной инсулиновой недостаточностью или преимущественным дефектом секреции инсулина с инсулинорезистентностью или без не.
В последние десятилетия распространнность СД приобрела характер пандемии, которая охватила практически все государства, в том числе и Россию (Маколина Н.П. и др.2008; Сунцов Ю.И., 2008, 2012). Согласно оценкам ВОЗ, Китай, Индия и Российская Федерация могут затратить в следующие 10 лет (2006–2015 гг.) до 550 млрд. долларов национального дохода на лечение больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и сахарным диабетом (Каменева Е.А. и др., 2008). В 2007г. количество больных СД во всем мире составило 246 млн. человек, что составляет 6% населения в возрасте от 20 до 79 лет, а по данным Международной ассоциации диабета (IDF), в 2011 г. численность больных СД уже достигла 366 млн. (Сунцов Ю.И. и др., 2011; Недосугова Л.В., 2013). К 2025г. ожидается, что количество заболевших достигнет 380 миллионов (Крутько В.Н., Смирнова Т.М., 2002). В ближайшие два десятилетия число зарегистрированных больных в России достигнет 5,81 млн. человек. Диабетом типа 2 страдают 85-90% больных диабетом в России (Голованова Е.Д. и др., 2005). Рост распространнности СД обусловлен высокой частотой встречаемости СД типа 2 среди взрослого населения.
Довольно актуальным для России в настоящее время является показатель роста темпа преждевременного старения населения (Лазебник Л.Б., 2005). Темп старения, в свою очередь, характеризует индивидуальную программу скорости изменения физиологических и патологических детерминант организма (Анисимов В.Н., 2005). Существует зависимость распространнности СД 2 типа от возраста больного. Например, в возрасте 45-54 года СД типа 2 встречается с частотой 8,2%, а в возрасте 65-74 года – 17,9% (Дедов И.И., 2008). Сахарный диабет типа 2 называют «болезнью зрелого и пожилого возраста» или «ассоциированной с возрастом» болезнью (Дедов И.И. и др., 2002). Средняя продолжительность жизни женщин, больных СД типа 2 составляет 73,4 года, мужчин – 67,6 лет (Дедов И.И., Шестакова М.В., 2006).
Помимо высокой распространнности, СД является одной из частых причин инвалидизации и летальности, что обусловлено его сосудистыми осложнениями, к которым относятся микроангиопатия (ретинопатия и нефропатия) и макроангиопатия (инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей) и невропатия. СД является одним из основных факторов риска ишемического инсульта (Гусев Е.И. и др., 2002). Несмотря на сложность патогенеза поздних осложнений СД, основную роль в их инициации и прогрессировании играет хроническая гипергликемия или отсутствие компенсации основного заболевания (Балаболкин М.И. и др., 2005).
Сахарный диабет создает большую угрозу для здоровья населения семей, государств и всего мира, и серьзно осложняет достижение согласованных на международном уровне целей развития, включая цели, сформулированные в «Декларации тысячелетия» (Резолюция № A/RES/61/225 «Всемирный день борьбы с диабетом» 61-й сессии Генеральной Ассамблеи ООН от 20 декабря 2006г. [Электронный ресурс]. Женева, 2006-2007. URL: http://www.un.org/ru/ga/61/docs/61res_nocte.shtml). Актуальность проблемы диабетических ангиопатий наглядно подтверждается тем, что среди больных СД в возрасте до 20 лет смертность в 7 раз превышает таковую среди населения в целом, а после достижения 20-летного возраста среднегодовой риск смертности в 20 раз выше по сравнению с общей популяцией (Молитвословова Н.А., Никононова Т.В., 2009; Дедов И.И. и др. 2008). Также в качестве факторов, лимитирующих качество и продолжительность жизни больных СД, на первый план ставят поздние сосудистые осложнения. Диабетический кетоацидоз также является серьзным проявлением декомпенсации СД типа 2 (IDF Diabetes atlas. Forth edition, 2009. [Электронный ресурс]. URL: http://www.idf.org/diabetesatlas).
Приведнные данные наглядно показывают медицинскую, социальную и экономическую важность данной проблемы. Уменьшить текущие расходы на оказание медицинской помощи таким пациентам, значительно снизить заболеваемость и частоту поздних осложнений СД 2 типа, а также повысить длительность и качество жизни больных возможно лишь при рациональной и согласованной организации всех звеньев диабетологической службы.
Современный уровень научных исследований позволяет приступить к обоснованной разработке методов ранней диагностики заболевания и широкому проведению профилактических мероприятий. Решению этих вопросов была посвящена Федеральная целевая программа «Сахарный диабет» (2002), в которой предусмотрено проведение организационных, диагностических, лечебных и профилактических мероприятий, направленных на снижение частоты распространенности сахарного диабета, уменьшение инвалидизации и летальности среди таких пациентов (Дедов И.И. и др., 2002).
Лабораторно-биохимические методы исследования
Уровень HbА1С определяли на биохимическом экспресс анализаторе DCA 2000+ (Bayer Corp., USA). Уровень HbA определяли на гематологическом анализаторе PCE-210 (Erma Inc., Japan). Результат выражали в у.е.
Количество эритроцитов в крови определяли путм подсчта в камере Горяева по методу, описанному в руководстве под редакцией Базарова М.А. (Базаров М.А., 1988), результат выражали в ед1012 /л.
Активность гексокиназы (КФ 2.7.1.1.) определяли спектрофотометрическим методом, описанном Лугановой И.С. и др. (1964). К 0,2 мл цельных эритроцитов исследуемой крови (опыт) последовательно добавляли 1,0 мл буферного раствора трис-НСl с рН=7,5;0,2 мл окисленного НАДФ+; 0,2 мл 1 М раствора MgSO4; 0,2 мл раствора D-глюкозы (2,4 мг на 1 мл дистиллированной воды); 0,4 мл натриевой соли аденозинтрифосфата. Объм проб доводили до 3,0 мл дистиллированной водой. Инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, затем реакцию останавливали добавлением 1,0 мл раствора 1,2N NaOH. Центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/минуту. Полученный центрифугат спектрофотометрировали против контрольной пробы на СФ-46 (ЛОМО, Ленинград) при длине волны 340 нм. Контрольная проба отличалась тем, что реакцию останавливали сразу добавлением раствора NaOH. Результаты выражали в мкмоль на грамм Hb.
Активность фосфогексоизомеразы (ФГИ) (КФ 5.3.1.9.) определяли по методу, описанному Езерским Р.Ф. (1960), в модификации Микашинович З.И. (1989). Метод основан на колориметричском измерении фруктозофосфата, образовавшегося при инкубировании глюкозофосфата с цельными эритроцитами и последующим окрашиванием фруктозофосфата в реакции Селиванова. По количеству фруктозофосфата судили об активности ФГИ.
Для определения активности фосфогексоизомеразы в опытную пробу вносили 1,0 мл буферно-субстратной смеси, содержащей глюкозо-6-фосфат и веронал-ацетатный буфер рН=7,4. К нему добавляли 0,2 мл цельной крови и помещали в термостат инкубировать на 30 минут при температуре 37С. По истечении указанного времени останавливали реакцию добавлением 1,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. В контрольную пробу раствор ТХУ добавляли сразу вместе с гомогенатом. Центрифугировали 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Затем к 1,0 мл полученного центрифугата приливали 1,0 мл 1% спиртового раствора резорцина и 3,0 мл 10 N НСl, помещали в полукипящую водяную баню на 10 минут. Количество полученного фруктозофосфата определяли фотометрически на ФЭК КФК 2-МП при длине волны 540 нм против контрольной пробы. Результат выражали в мкмоль/мг Нв за час инкубации.
Содержание молочной кислоты (лактат) определяли в безбелковом экстракте эритроцитов, полученном добавлением 5% ТХУ по методу, описанному Меньшиковым В.В. (1987). Принцип метода: лактат при кипячении с концентрированной серной и ортофосфорной кислотами в присутствии ионов меди разлагается до ацетальдегида, который при взаимодействии с параоксидифенилом образует продукт фенольной конденсации, окрашивающий раствор в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству ацетальдегида, а, следовательно, и количеству молочной кислоты.
Ход определения: для определения содержания лактата в центрифужную пробирку вносили 0,2 мл осадка эритроцитов и 1,0 мл 5% раствора ТХУ, центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g. Затем к 0,2 мл центрифугата добавляли 0,1 мл сульфата меди (в ортофосфорной кислоте) и 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Пробы кипятили на водяной бане в течение 3 минут при температуре 1000C. Далее в пробы вносили пипеткой по 2 капли 1,5% раствора параоксидифенила и инкубировали в термостате 10 минут при температуре 37С, затем снова кипятили в течение 90 секунд. Затем охлаждали до комнатной температуры и фотометрировали на ФЭК КФК 2-МП при длине волны =590 нм против дистиллированной воды в кювете с длиной оптического пути 0,5 см. Количество молочной кислоты выражали в ммоль/л. Содержание пировиноградной кислоты (ПВК) проводили по методу Freedman и Haugen (1943) в модификации П.А. Бабаскина (А.С. СССР №877436, 1981). Принцип метода заключается в том, что ПВК при взаимодействии с 2,4-динитрофенилгидразоном (ДНФГ) образует гидразон, который в содовом экстракте (щелочная среда) дат окраску, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации ПВК.
ПВК осаждали в виде 2,4-динитрофенилгидразона красно-коричневого цвета. Осадок гидразона очищали от примесей экстракцией 12% NaOH. В надосадочной жидкости определяли ПВК колориметрическим методом на ФЭК КФК 2-МП при длине волны =440 нм в кювете с длиной оптического пути 0,5 см. Ход определения: в центрифужную пробирку помещали 0,1 мл эритроцитов, 0,9 мл дистиллированной воды и 1,0 мл 10% раствора ТХУ. Для осаждения белков ставили на холод (+40С) на 2 мин. После осаждения белков пробы центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут, затем отбирали 2,0 мл надосадочной жидкости и добавляли 0,4 мл 0,1% раствора динитрофенилгидразина. Пробы инкубировали 20 мин. в темноте, после чего реакцию останавливали добавлением 1,0 мл 12% раствора NaOH. Оставляли при комнатной температуре для развития окраски на 5 мин., а затем проводили измерение против контрольной пробы. В контрольную пробу вместо эритроцитов вносили равное количество дистиллированной воды. Количество пировиноградной кислоты выражали в мкмоль/мл.
Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (гл-6-ФДГ) (КФ 1.1.1.49) определяли по методу Корнберга Л. в модификации Захарьина Ю.Л. (1967) спектрофотометрически по степени восстановления НАДФ в ферментативной реакции с глюкозо-6-фосфатом в присутствии ионов магния.
В опытную и контрольную пробирки последовательно добавляли растворы трис-буфера по 1,0 мл; 1 М МgSO4 по 0,2 мл; 0,02 М НАДФ по 0,2 мл; лизат эритроцитов по 0,4 мл; 1,2 М NaOH 1,0 (только в контроль); 0,4 мл глюкозо-6-фосфата (только в опытную пробирку) и воды (1,0 мл в опытную пробирку и 1,4 мл в контрольную). Смесь инкубировали в термостате при t=37 в течение 15 минут. Затем добавляли в опытную пробирку 1,0 мл 1,2 М NaOH и центрифугировали при 3000g в течение 10 минут. Далее регистрировали оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Ленинград) против контроля при длине волны = 340 нм. Активность фермента выражали в мкмоль/г Hb в час.
Активность фосфорилазы (КФ 2.4.1.1.) определяли по методу Hers, описанному Поповой И.А. и др. (1992), основанному на определении неорганического фосфора. Инкубационная смесь содержала 2% гликогена 0,1 М глюкозо-6-фосфата, 3мМ 5-МИФ, 0,2 М NaF, pH 6,1. Инкубировали 10 мин. при 370С. Реакцию останавливали 10% ТХУ, затем приливали 3,7 мл холодной H2O, центрифугировали 10 мин при 3000g. В надосадочной жидкости определяли pH. Активность ферментов выражали в мкмоль/мг Hb. Содержание 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) определяли по неферментативному методу, предложенному B.F. Dyсe, S.P. Bessman (1973) в модификации Лугановой И.С., Блинова М.Н. (1975), основанным на колориметрическом измерении содержания фосфатов в хлорнокислом экстракте после удаления кислоторастворимых нуклеотидов абсорбцией на активированном угле «Норит».
Ход определения. Для опытной пробы отбирали 1,0 мл плотного осадка эритроцитов, смешивали на холоду (t=+4С) с 2,0 мл дистиллированной воды и 6,0 мл 1N раствора HClO4. Через 20 минут центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут, затем отбирали 3,0 мл надосадочной жидкости и добавляли 100 мг активированного угля. Оставляли на 20 минут при комнатной температуре. По истечении указанного времени добавляли 0,1 мл 95% этанола снова центрифугировали в том же режиме. В полученной надосадочной жидкости определяли концентрацию общего и неорганического фосфора.
Содержание 2,3-дифосфоглицерата
Наличие восстановленного НАДФ+ и его использование в работе антиоксидантной системы клетки является необходимым условием поддержания структурно-функциональной целостности эритроцитов. С этих позиций представляется целесообразным проанализировать состояние ферментов АОЗ в исследуемых группах пациенток.
Изменение газотранспортной функции крови у пациенток с сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа), описанные в главе 4, свидетельствует о наличии гипоксии, более выраженной у пациенток старшей возрастной группы. Согласно литературным данным, гипоксические проявления неизбежно приводят к запуску процессов свободнорадикального окисления и развитию выраженного окислительного стресса в организме человека (Зенков Н.К., 2001, Baynes J.W. et al, 1999).
В связи с этим, в данном фрагменте работы была поставлена задача выявить состояние про- и антиоксидантного баланса, установить наличие и степень выраженности окислительного стресса в крови пациенток с СД 2 типа с учтом возрастных особенностей и степени компенсации углеводного обмена (суб- и декомпенсация).
Активность Cu,Zn- супероксиддисмутазы (Си,гп-СОД) В таблице 3.13. представлены данные активности Cu,Zn-СОД в эритроцитах крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы активность Cu,Zn-СОД составила 573,98 + 5,85 усл.ед./г НЬ, у женщин второй контрольной группы - 577,38 + 5,5 усл.ед./г НЬ Таблица 3.13. p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2
У пациенток обеих возрастных групп в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена отмечается рост активности Cu,Zn-СОД в крови. Активность Cu,Zn-СОД в крови у пациенток второго периода зрелости, больных СД 2 типа в стадии субкомпенсации (1 подгруппа) и декомпенсации (2 подгруппа) увеличивается соответственно на 80,98% и 79,44% (p 0,05) по сравнению с показателями контрольной группы.
Что касается пожилых пациенток, то у них в стадии субкомпенсации (3 подгруппа) наблюдается увеличение активности Cu,Zn-СОД на 82,10% (p 0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе. В то же время, при декомпенсации заболевания (4 подгруппа) у пожилых пациенток активность Cu,Zn-СОД повышается незначительно по сравнению со значениями контрольной группы - всего на 19,22% (p 0,05).
При сравнении активности Cu,Zn-СОД в крови у пациенток с СД 2 типа в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена выявлены следующие закономерности. У пациенток первой возрастной группы как в стадии субкомпенсации, так и декомпенсации заболевания (1 и 2 подгруппы) активность данного фермента колеблется примерно в одинаковых пределах. В то же время, у пациенток второй возрастной группы при декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) активность Cu,Zn-СОД значительно ниже (на 34,53%, p 0,05) чем в стадии субкомпенсации (3 подгруппа) (табл. 3.13.).
Из литературных данных известно, что Cu,Zn-СОД восстанавливает супероксиданионрадикал в реакции дисмутации О2- до Н2О2 и, удаляя О2, исключает его взаимодействие с NO, тем самым предотвращая образование пероксинитрита – гораздо более опасного прооксиданта и окислителя, чем перекись водорода (Munday R. et al., 1989).
Значительное снижение активности Cu,Zn-СОД в крови у пациенток пожилого возраста в стадии декомпенсации углеводного обмена, по сравнению со стадией субкомпенсации, служит косвенным свидетельством избыточной продукции О2- и пероксида водорода, которая способствует образованию в реакциях Фентона и Хабера-Вейса самой агрессивной активной формы кислорода – гидроксильного радикала (OH) – за счет наличия в эритроцитах ионов железа Fe2+: Н2О2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OH.
Данная реакция катализируется ионами металлов с переменной валентностью, преимущественно Fe2+ и Cu2+, которые высвобождаются из белковых структур и становятся доступными только в условиях ацидоза (Федорова Т.Н., 2004).
Анализируя полученные факты можно придти к заключению, что степень изменения активности Cu,Zn-СОД отражает нарастание изменений параметров гомеостаза по мере углубления патологического процесса.
Так, несмотря на наличие общей адаптивной реакции активации Cu,Zn СОД, способность к устранению активных форм кислорода при некомпенсированном диабете у пожилых пациенток снижается. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что у пациенток пожилого возраста при декомпенсированном СД 2 типа активность фермента Cu,Zn-СОД активируется в меньшей степени относительно остальных подгрупп пациенток и свидетельствуют о снижении способности эритроцитов к устранению свободных радикалов, что может указывать на превалирование прооксидантных реакций. В этой связи представляет интерес характер изменений активности КАТ в исследуемых группах.
Активность каталазы Согласно современным представлениям, каталаза (КАТ) препятствует накоплению H202, которая оказывает неоднозначное действие на клеточные компоненты (Меньщикова Е.Б. и др., 2006). В таблице 3.14. представлены данные активности КАТ в крови женщин контрольных групп и пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. Активность КАТ у женщин первой контрольной группы составила 2,45+0,05 мкат/г Hb, у второй группы 2,44+ 0,05 мкат/г Hb.
Оценка стабильности мембран эритроцитов, уровня вторичных продуктов ПОЛ у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена
Из литературных источников известно, что в эритроцитах больных сахарным диабетом снижается содержание 2,3-ДФГ по сравнению со здоровыми людьми (Tuyoshi, Fujita et all. 1998). Полученные же в нашей работе данные, свидетельствующие о повышении содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах у пациенток обеих возрастных групп в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена, особенно у пожилых пациенток в стадии декомпенсации основного заболевания, свидетельствуют о том, что направленность изменений содержания 2,3-ДФГ в зрелых эритроцитах зависит от потребности организма в кислороде, носит адаптивный характер и является отражением количественного и модуляционного типа адаптации к гипоксии вызванной гипергликемией, что соответствует существующим представлениям о роли 2,3-ДФГ.
Известно, что при дефиците кислорода синтез 2,3-ДФГ усиливается, что приводит к увеличению выхода кислорода из эритроцитов в ткани и улучшению снабжения клеток кислородом (Титова Н.М. и др., 2008), но выход АТФ (из расчта на моль глюкозы) при этом снижается (Гаврилов О.К. и соавт., 1985; Моисеева О.И., 1986; Рябов Г.А., 1988; Rapoport J. еt al., 1977).
Высокая скорость протекания биохимических реакций и использование эритроцитом гликолиза для энергетического обмена, не исключают возможности относительно быстрого изменения содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах при гипоксии. Увеличение содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах человека и животных при гипоксии является одним из адаптивных механизмов, который улучшает доставку кислорода к тканям (Duhm J., Gerlach E., 1971; . Torrance J.D. at al., 1970/71).
Так как перед нами стояла задача определения превалирующей роли гликолиза или ПФП, а также роли субстратов для поддержания энергетического потенциала эритроцитов у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста и стадии компенсации заболевания, то нами была изучена активность ФГИ, определяющая (катализирующая) дальнейшую «судьбу» глюкозо-6-фосфата, а именно его превращение во фруктозо-6-фосфат.
Нами обнаружено, что максимальное снижение активности этого фермента, по сравнению с контролем, достигает у пожилых пациенток в стадии декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа). У пациенток более молодого возраста отмечен фазный характер изменения активности этого фермента в зависимости от стадий компенсации углеводного обмена, по сравнению с контролем, в частности, при стадии субкомпенсации заболевания было отмечено снижение активности, а при декомпенсации – повышение активности.
У пациенток второго периода зрелости при субкоменсации заболевания (1 подгруппа), также как и у пожилых пациенток при суб- и декомпенсации (3 и 4 подгруппы) происходит снижение скорости начальных этапов гликолиза. У пациенток второго периода зрелости при стадии декомпенсации вероятно, срабатывают компенсаторные механизмы, направленные на активацию галактозного пути утилизации углеводов с последующим образованием гл-6-фосфата из гл-1-фосфата, который в свою очередь может включаться в гликоген эритроцитов (Гаврилов О.К. и др., 1985).
Можно полагать, что такая переориентация метаболизма углеводов обусловлена накоплением старой популяции клеток эритроидного ростка, что подтверждает наше предположение о нарушении процесса утилизации старых эритроцитов у пожилых женщин.
Кроме того, необходимо отметить, что у пожилых пациенток с СД 2 типа независимо от степени компенсации нарушений углеводного обмена отмечается выраженный рост содержания 2,3-ДФГ, который ингибирует активность фосфоглюкомутазы и нарушает работу галактозного пути утилизации углеводов. В этой связи можно полагать, что выраженный рост аллостерического модулятора сродства эритроцитов к кислороду - 2,3-ДФГ служит не только критерием выраженности гипоксии, но и является биохимическим маркером превалирования старой популяции клеток красной крови.
Наши предположения нахолят сво подтверждение наличием отрицательных корреляционных связей между ростом содержания 2,3-ДФГ и снижением активности ФГИ у пациенток второго периода зрелости в стадии субкомпенсации (1 подгруппа) (r = -0,61, p 0,05) и у пожилых пациенток в стадии декомпенсации (4 подгруппа) (r = -0,5, p 0,05).
Что касается особенностей функционирования ПФП, по которому утилизируется около 10% глюкозы, то нами был установлен рост активности регуляторного фермента ПФП гл-6-ФДГ, по сравнению с контролем, только у женщин второго периода зрелости с субкомпенсацией гипергликемии. Надо полагать, данные изменения при начальном проявлении заболевания являются компенсаторно-приспособительной реакцией клеток крови, направленной на усиление процессов утилизации галактозы в условиях дефицита гексокиназы. По-видимому, в данной возрастной группе в качестве поставщика глюкозо-6-фосфата для работы ПФП большее значение приобретает галактозный путь утилизации глюкозы.
Следует учесть и тот факт, что нормальное функционирование ПФП имеет особое значение для эритроцитов. Так, образующийся НАДФН+, необходим для поддержания нормальной функциональной активности и целостности эритроцитов, а также он участвует в биосинтезе жирных кислот и холестерина. Промежуточные продукты гексозомонофосфатного шунта, такие как пентозы и триозы, используются для синтеза нуклеиновых кислот и 2,3-ДФГ.
Кроме того, гексозомонофосфатный шунт может служить дополнительным путем образования энергии за счет включения глицеральдегидфосфата в цепь гликолитических превращений. Не менее значимым является то, что образующийся рибозо-5-фосфат в эритроцитах служит составной частью таких макроэргических соединений как АТФ, АДФ и АМФ синтез которых отсутствует.
В этой связи, можно утверждать, что гл-6-ФДГ и промежуточные продукты ПФП выполняют роль «аварийного» пути, обеспечивающего нормальное функционирование гликолиза при начальной стадии заболевания у пациенток второго периода зрелости в обход гексокиназной и фосфогексоизомеразной реакций.
