Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Клинико-патогенетические проблемы дисфункции ЩЖ . 13
1.2. Механизм биосинтеза ТГ 16
1.3. Транспорт и механизм обезвреживания ТГ 20
1.4. Физиологические эффекты ТГ 22
1.5. Состояние обмена веществ и клиника гипотиреоза 25
1.6. Состояние обмена веществ и клиника гипертиреоза 29
1.7. Понятие «оксидативного стресса», роль в развитии патологии ЩЖ 31
1.8. Иммунная система и патология ЩЖ . 37
1.9. Цитокины биохимическая и патобиохимическая характеристика. 40
1.10. Иммунно-антиоксидантный статус и дисфункция ЩЖ 45
1.11. Патобиохимические и патофизиологические подходы к немедикаментозной коррекции дисфункции щитовидной железы . 49
1.12. Метод ТЭС-терапии . 52
Глава 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Клинико-биохимическая характеристика пациентов . 58
2.2. Методы исследования иммуно-антиоксидантного статуса. 64
2.2.1. Методика определения антиоксидантной емкости плазмы крови с помощью амперометрического метода 65
2.2.2. Методика оценки интенсивности свободно-радикальных процессов в плазме с помощью индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции . 66
2.2.3. Методика определения активности каталазы 66
2.2.4. Методика определения активности супероксиддисмутазы . 67
2.2.5. Методика определения количества SH-групп в эритроцитах 68
2.2.6. Методика количественного определения продуктов окислительной модификации плазмы 68
2.2.7. Определение уровня ИЛ-8 в плазме крови 69
2.2.8. Определение уровня ИЛ-10 в плазме крови 70
2.2.9. Определение уровня ФНО-альфа в плазме крови . 70
2.2.10. Определение уровня ТТГ в плазме крови 71
2.3. Методика проведения ТЭС-терапии 71
2.4. Методы статистического анализа . 72
Глава 3. Состояние системы прооксиданты-антиоксиданты у больных с гормональной дисфункцией щитовидной железы . 74
Глава 4. Состояние некоторых цитокинов у больных с гормональной дисфункцией ЩЖ 84
Глава 5. Динамика показателей иммунно-антиоксидантного статуса при дисфункции ЩЖ на фоне ТЭС-терапии 90
Глава 6. Заключение . 114
Выводы 130
Практические рекомендации 132
Список литературы 133
- Транспорт и механизм обезвреживания ТГ
- Цитокины биохимическая и патобиохимическая характеристика
- Методы исследования иммуно-антиоксидантного статуса
- Методика количественного определения продуктов окислительной модификации плазмы
Транспорт и механизм обезвреживания ТГ
Поступившие в кровь Т3 и Т4 связываются с белками, осуществляющими транспортную функцию. Тироксинсвязывающий глобулин связывает и транспортирует 75% тироксина и 85% трийодтиронина, причем тироксин связывается более прочно. Кроме того, гормоны связываются и с тироксинсвязывающим преальбумином (он присоединяет 15% Т4 и менее 5% Т3). И, наконец, около 10% Т4 и Т3 связаны с альбумином [Г.М.Кроненберг, Ш.Мелмед, К.С.Полонски, 2010; J.G.Hollander Den, R.W.Wulkan, M.J.Mantel et al., 2005; P.Iglesias, J.J.Diez, 2009]. Таким образом, в свободном виде в крови циркулируют лишь 0,03% Т4 и 0,3% Т3. Именно свободная фракция гормонов обусловливает присущие им физиологические эффекты.
Другие типы йодтиронинов, присутствующие в плазме, являются метаболитами Т3 и Т4. Основные среди них: 3,3 5 - трийодтиронин (обратный Т3, или оТ3) и 3,3 -дийод-L-тиронин (3,3 -Т2). Присутствуют также продукты дезаминирования Т3 и Т4, близкие по структуре боковых цепей к уксусной кислоте. Практически все йодтиронины плохо растворяются в воде, вследствие чего обычно находятся в плазме в виде комплексов с белками [Г.М.Кроненберг, Ш.Мелмед, К.С.Полонски, 2010; A.C.Bianco, D.Salvatore, B.Gereben et al., 2005].
Инактивация ТГ осуществляется путем дейодирования их внутреннего кольца. Эту реакцию катализирует дейодиназа 3-го типа. Этот фермент не только инактивирует Т3, но и предупреждает активацию Т4, превращая его в общий Т3 (оТ3). Структурно все йодтирониндейодиназы человека очень близки: все они являются гомодимерами и встроены в клеточные мембраны. В активном центре у этих ферментов есть селеноцистеин - весьма редкая аминокислота. Селеноцистеин - нуклеофильное соединение, что делает его очень удобным при проведении окислительно-восстановительных реакций, например, дейодирования йодтиронинов или восстановления Н2О2 (которое катализирует другие содержащие селеноцистеин ферменты, в частности глутатионпероксидаза). Предполагают, что входящий в состав селеноцистеина селен является акцептором йода во время реакции дейодирования. При замене селеноцистеина в молекуле дейодиназы на обычный цистеин (содержащий вместо селена серу) активность фермента падает более чем в 100 раз [Г.М.Кроненберг, Ш.Мелмед, К.С.Полонски, 2010; A.C.Bianco, D.Salvatore, B.Gereben et al., 2005].
ТГ относятся к липофильным первичным мессенджерам, способным проникать в клетку через плазматическую мембрану и участвовать непосредственно в регуляции экспрессии генов. У поверхности клетки гормон отделяется от транспортного белка, диффундирует в клетку и связывается с рецепторным белком. Далее лиганд-рецепторный комплекс транслоцируется в ядро, где взаимодействует с ДНК или факторами транскрипции (или с тем и другим). Это может способствовать увеличению экспрессии различных белков и/или пролиферации клеток. Сам гормон может подвергаться рециклированию в результате его выведения за пределы клетки [S.R.Neves, P.T.Ram, R.G.Iyengar, 2002; A.Connor, J.E.Taylor, 2008]. Внутриклеточные рецепторы ТГ относятся к суперсемейству рецепторов клеточного ядра. Они представляют собой полипептиды, состоящие примерно из 800 аминокислот, и имеют три функциональных домена: карбоксильно-терминальный гормонсвязывающий домен; внутренний домен, связывающийся с ДНК; аминотерминальный домен, активирующий или тормозящий транскрипцию генов. Одни рецепторы в неактивном состоянии находятся в цитозоле, другие - в ядре. Предполагается, что, находясь в неактивном состоянии, домен, связывающийся с ДНК, соединен с ингибиторным белком. Связывание с гормоном вызывает отделение рецептора от ингибиторного протеина. В результате этого рецептор приобретает повышенное сродство к определенным последовательностям ДНК, которые начинают работать как энхансеры, т.е. стимулировать транскрипцию нескольких соседних генов. Продукты этих генов могут активировать другие гены, усиливая, таким образом, действие гормона [М.А.Пальцев, А.А.Иванов, С.Е.Северин, 2004; Ю.П.Сыч, 2005]. Клетками - мишенями для йодтиронинов являются гепатоциты печени, адипоциты жировой ткани, клетки мышечной ткани, в том числе миокарда. Считается, что нет рецепторов к йодтиронинам в клетках соединительной ткани, мозга. Механизм действия ТГ смешанный: 10% - мембранно-внутриклеточный, 90% - цитозольный [М.И.Балаболкин, Е.М.Клебанова, В.М.Креминская, 2008; С.Д.Арапова, И.Л.Асецкая, Ю.Б.Белоусов и др., 2008; D.L.Panciera, H.P.Lefebvre, 2009].
Влияние на энергетический обмен. ТГ обеспечивают энергетический обмен путем индуцирования биосинтеза более 100 окислительно-восстановительных ферментов митохондрий, активируя ферменты челночных переносов водорода из цитозоля в митохондрии, усиливая активность цепи переносов электронов. ТГ обладают калоригенным действием и способны повышать температуру тела. Одним из следствий работы этого механизма является увеличение выработки тепла организмом, что, в свою очередь, считается результатом возрастающего потребления кислорода и повышения скорости гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ). Образно говоря, действие гормонов ЩЖ можно сравнить с ветром, дующим на тлеющие угли [Т.А.Трошина, Г.Ф.Александрова, Ф.М.Абдулхабирова, 2010; P.Stoyanov, J.A.M.Navarro, E.M.Herrero et al., 2010]. Влияние на обмен белков. Действие ТГ на обмен белков зависит от концентрации гормонов. В малых концентрациях они оказывают анаболическое действие на обмен белков, повышают синтез белков и тормозят их распад, вызывая положительный азотистый баланс. Важной физиологической функцией ТГ является регулирование сульфгидрильных тканевых белков, которые нейтрализуют токсичные вещества. В больших же концентрациях оказывают сильное катаболическое действие на белковый обмен, вызывая усиленный распад белков и торможение их синтеза, и как следствие - отрицательный азотистый баланс. Гипотиреоз приводит к задержке азотистых продуктов в организме. В сердечной и скелетной мышцах накапливается креатинин и увеличивается содержание креатининфосфата [В.В.Фадеев, Г.А.Мельниченко, 2002; А.С.Аметов, 2009; P.Caturegli, H.Kimura, R.Rocchi et al., 2007]. Влияние на обмен липидов. Известно, что тироксин и трийодтиронин оказывают широкое и разнообразное влияние на обмен липидов, в частности, оказывают регулирующее влияние на липидный спектр крови, что является отражением липидного метаболизма организма [И.А.Григорова, 2008]. ТГ стимулируют синтез холестерина, но одновременно усиливают его катаболизм и выведение с желчью, что снижает холестеринемию. Также стимулируют липолиз и процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [М.И.Балаболкин, Е.М.Клебанова, В.М.Креминская, 2008; S.Zoncu, F.Pigliaru, C.Putzu, 2005; A.Ripoli, A.Pingitore, B.Favilli et al., 2005; J.J.Diez, P.Iglesias, 2011].
Влияние на обмен углеводов. ТГ являются контринсулярными. Стимулируют всасывание углеводов в кишечнике, усиливают глюконеогенез, гликогенолиз и гликолиз, таким образом, повышают уровень глюкозы в крови. Они повышают захват и утилизацию глюкозы клетками, увеличивая активность ключевых ферментов гликолиза. Под влиянием тироксина значительно ускоряется анаэробный путь гликолиза, активируются другие пути метаболизма глюкозы - гексозомонофосфатный шунт, обеспечивающий окисление глюкозы до СО2 [Г.М.Кроненберг, Ш.Мелмед, К.С.Полонски, 2010; E.Garca, V.Garca-Hierro, M.Pilar Alvarez et al., 2009].
Влияние на обмен витаминов. ТГ активно участвуют в обмене витаминов. Так установлено, что они способствуют синтезу витамина А из провитамина. Стимулируют всасывание в кишечнике витамина B12 [P.J.D.Owen, C.Raji, D.Vinereanu et al., 2006; C.F.Hodkinson, E.E.Simpson, J.H.Beattie et al., 2009].
Цитокины биохимическая и патобиохимическая характеристика
Цитокины представляют собой регуляторные пептиды, продуцируемые клетками организма. К системе цитокинов в настоящее время относят около 200 индивидуальных полипептидных веществ. Все они имеют ряд общих биохимических и функциональных характеристик, среди которых важнейшими считаются следующие: плейотропность и взаимозаменяемость биологического действия, отсутствие антигенной специфичности, проведение сигнала путем взаимодействия со специфическими клеточными рецепторами, формирование цитокиновой сети. В связи с этим цитокины могут быть выделены в новую самостоятельную систему регуляции функций организма, существующую наряду с нервной и гормональной регуляцией [А.С. Симбирцев, 2004; С.В.Гейн, В.А.Черешнев, 2009; G.S.Ladies, 2007; Y.H.Huang, M.M.Tsai, K.H.Lin, 2008]. К цитокинам относятся простые полипептиды, более сложные молекулы с внутренними дисульфидными связями и белки, состоящие из двух и более одинаковых либо разных субъединиц, с молекулярной массой от 5 до 50 кДа. Цитокины являются эндогенными медиаторами, которые могут синтезироваться практически всеми ядросодержащими клетками организма, причем гены некоторых цитокинов экспресируются во всех без исключения клетках организма [А.С. Симбирцев, 2004; Ю.В.Волкова, 2008; А.А.Ярилин, 2010; С.В.Гейн, Т.А.Баева, 2011]. Цитокины являются наиболее универсальной системой регуляции, так как способны проявлять биологическую активность как дистантно после секреции клеткой-продуцентом (местно и системно), так и при межклеточном контакте, будучи биологически активными в виде мембранной формы [С.А.Кетлинский, 2008]. Этим система цитокинов отличается от молекул адгезии, выполняющих более узкие функции только при непосредственном контакте клеток. В то же время система цитокинов отличается от гормонов, которые в основном синтезируются специализированными органами и оказывают действие после попадания в систему циркуляции [А.С.Симбирцев, 2004; Г.М.Кроненберг, Ш.Мелмед, К.С.Полонски, 2010; L.Mebis, Y.Debaveye, B.Ellger et al., 2009]. Местные защитные реакции в организме развиваются путем формирования типичной воспалительной реакции после взаимодействия патогенов как экзогенной, так и эндогенной природы с паттерн распознающими рецепторами (мембранными Toll-рецепторами) с последующим синтезом провоспалительных цитокинов. Синтезируясь в очаге повреждения или воспаления, цитокины воздействуют практически на все клетки, участвующие в развитии воспаления, включая гранулоциты, макрофаги, фибробласты, клетки эндотелия и эпителиев, а затем на Т- и В лимфоциты [С.А.Ляликов, Л.Л. Гаврилик, М.Собеска, 2002; И.А.Камаева, Н.Л.Шапорова, А.Р.Волкова, 2012]. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом, действуя в обоих направлениях. В случае несостоятельности местных защитных реакций цитокины попадают в циркуляцию, и их действие проявляется на системном уровне, что приводит к развитию острофазового ответа на уровне организма [О.В.Серебрякова, 2008; Д.А.Дрометр, 2008; М.М.Орлова, 2012]. Цитокины оказывают влияние практически на все органы и системы, участвующие в регуляции гомеостаза. Действие цитокинов на ЦНС приводит к изменению всего комплекса поведенческих реакций, меняется синтез большинства гормонов, острофазовых белков в печени, экспрессия генов ростовых и дифференцировочных факторов, изменяется ионный состав плазмы. Однако ни одно из происходящих изменений не носит случайного характера: все они либо нужны для непосредственной активации защитных реакций, либо выгодны в плане переключения энергетических потоков для одной лишь задачи - борьбы с внедрившимся патогеном [О.В.Серебрякова, 2008; М.М.Орлова, 2012]. Функционирование цитокинов и их рецепторов напрямую зависит от состояния метаболических процессов в организме и, прежде всего, от активности АОС и уровня АФК в организме, т.к. все цитокины - белки, имеющие уникальное доменное строение, в том числе и связанное с наличием серосодержащих аминокислот, которые в первую очередь подвергаются оксидативной модификации. Цитокины оказывают аутокринные, паракринные и эндокринные эффекты посредством специфических тканевых рецепторов, через которые реализуется их регуляторный потенциал. В условиях ОС и повышенной активности процессов СРО в первую очередь затрагиваются фосфолипидные и липопротеидные структуры клеточных мембран, что нарушает целостность клеточных мембран и сказывается на их рецепторном аппарате [В.П.Скулачев, 2000; Р.С.Тишенина, Т.А.Филоненко, А.В.Древаль, 2000; Н.А.Петунина, 2002; Р.Марри, Д.Греннер, П.Мейес, 2004; О.Н.Октябрьский, Г.В.Смирнова, 2007]. В таких условиях даже эффекты противовоспалительных цитокинов оказываются несостоятельными из-за нарушений рецепции, и, как следствие, нормальный уровень как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов изменяется в той или иной мере даже без инициатора воспаления. При нарушении баланса в системах АОС/ПОЛ, про-/противовоспалительные цитокины развивается синдром дезадаптации, что характерно и для заболеваний ЩЖ [Н.Д.Гончарова, 2008; И.А.Камаева, Н.Л.Шапорова, А.Р.Волкова, 2012; B.Malcay, O.Malcay, C.Yenisey et al., 2009]. К числу важнейших представителей общего семейства цитокинов, являющихся медиаторами межклеточных коммуникаций, уровень которых может значительно изменяться при патологических состояниях, относятся интерлейкины (ИЛ). ИЛ-1 образуется в макрофагах, клетках эндотелия; принимает участие в образовании иммунного ответа, осуществляет связь между тремя регуляторными системами организма: нервной, иммунной, эндокринной. ИЛ-2 образуется Т-хелперами. ИЛ-3 образуется Т-хелперами и в стволовых клетках, помогает созреванию белых клеток крови. ИЛ-4 образуется Т-хелперами, помогает образованию иммуноглобулинов, понижает активность клеток макрофагов. ИЛ-5 образуется Т-хелперами, увеличивает подвижность эозинофилов. ИЛ-6 образуется макрофагами, опухолевыми клетками; активирует образование иммуноглобулинов. ИЛ-7 образуется Т-хелперами и в стволовых клетках. ИЛ-8 - низкомолекулярный цитокин воспаления. Принадлежит к семейству хемокинов. Продуцируется под воздействием бактериальных эндотоксинов и цитокинов, главным образом фактора некроза опухоли (ФНО) и ИЛ-1. Он известен как NAP -1 (активирующий нейтрофилы пептид-1), NAF (фактор активации нейтрофилов), GCF (хемотактильный фактор гранулоцитов) и NCF (хемотактильный фактор нейтрофилов). Активирует нейтрофилы, в меньшей мере другие гранулярные лейкоциты, вызывает их хемотаксис в очаг воспаления. Точно такой же эффект оказывается ИЛ-8 на моноциты. Повышенный уровень ИЛ-8 ассоциируется с хроническими и острыми воспалительными состояниями и коррелирует с тканевой инфильтрацией нейтрофилов при ревматоидном артрите, с язвенным колитом. ИЛ-8, появляясь после ИЛ-1 и ФНО-альфа в местах воспаления, играет важную роль при аутоиммунных заболеваниях. Активируя нейтрофилы, ИЛ-8 увеличивает уровень АФК. ИЛ-9 активирует Т-хелперы, наличие потенциально опасно развитием бронхиальной астмы. ИЛ-10 - этот лимфокин с молекулярной массой 17-21 кДа, продуцируемый Т клетками (Th2), может рассматриваться как антагонист ряда цитокинов. Так, ИЛ-10 подавляет продукцию интерферона (IFN g) Th1-клетками. Кроме того, он тормозит пролиферативный ответ Т-клеток на антигены и митогены, а также подавляет секрецию активированными моноцитами ИЛ-1b, ФНО и ИЛ-6. В то же время ИЛ-10 стимулирует секрецию Ig В-клетками. ИЛ -10 может стимулировать синтез IgE. В своем ингибирующем действии на клеточный иммунитет ИЛ-10 синергичен с ИЛ-4. При различных опухолях отмечено повышение уровня ИЛ-10, при этом считается, что повышение уровня продукции ИЛ-10 является плохим прогностическим признаком и сочетается с выраженной прогрессией опухолевого роста. ИЛ-11 образуется в макрофагах, клетках эндотелия, наличие чревато развитием воспалений и образованием жировых клеток. ИЛ-12 образуется нейтрофилами, Т-хелперами, макрофагами, активирует Т киллеры и Т-хелперы, но уменьшает их синтез. Фактор некроза опухолей (ФНО, TNF). В группу факторов некроза опухолей включают ФНО-альфа и лимфотоксин. ФНО-альфа является продуктом моноцитов/макрофагов, эндотелиальных, тучных и миелоидных клеток, ЛАК-клеток, клеток нейроглии, в особых случаях - активированных Т лимфоцитов. Существует три основных направления действия ФНО: цитотоксическое, направленное на клетки опухоли либо клетки, пораженные вирусами; иммуномодулирующее и противовоспалительное, вызываемое активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток; влияние на метаболизм, способный привести к гипергликемии, резорбции кости и увеличению мышечного гликогенолиза, т.е. кахексии, наблюдаемой при некоторых паразитарных инфекциях. В результате высвобождения ФНО повышается проницаемость капилляров, повреждается эндотелий сосудов, возникает внутрисосудистый тромбоз. Концентрация циркулирующего ФНО-альфа обычно очень низка ( 5пг/мл), однако она резко возрастает (максимум за 90 минут) после введения липополисахаридов и возвращается к норме в течение 4-х часов. Высокие уровни ФНО-альфа ( 300пг/мл) обнаруживают во время септического шока. Сохранение высоких уровней указывает на возможность возникновения нежелательных последствий. Оппортунистические инфекции у ВИЧ-инфицированных лиц приводят к дополнительной продукции ФНО-альфа и ИЛ-1, и это тоже вызывает увеличение количества клеток, содержащих вирус иммунодефицита [Е.Б.Жибурт, Н.Б.Серебряная, И.В.Каткова, 2012]. Учитывая активирующую роль ФНО-альфа на нейтрофилы, данный цитокин может способствовать дополнительной генерации АФК и развитию ОС. Данное положение подтверждает тесную связь в иммунной и антиоксидантной системах.
Методы исследования иммуно-антиоксидантного статуса
Объектом исследования являлась венозная кровь, стабилизированная гепарином. Определение необходимых параметров в эритроцитах и плазме осуществляли в первые сутки нахождения больных в стационаре и на 10-12 й день после проведенного лечения (группа тиреотоксикоза). Для исследования цитокинов и уровня ТТГ с использованием метода иммуноферментного анализа (ИФА) отдельно отбиралась плазма в специальные эпиндорфы после центрифугирования, которая замораживалась и хранилась в необходимых холодовых условиях. В группе 2 (гипотиреоз) определение необходимых параметров в эритроцитах и плазме осуществляли в первые сутки обращения больных в поликлинику и через 1 месяц после назначенного необходимого медикаментозного лечения. В группе 3 (гипотиреоз) определение необходимых параметров в эритроцитах и плазме осуществляли в первые сутки обращения больных в поликлинику и через 1 месяц после назначенного комплексного лечения (с 15-го дня на фоне заместительной терапии в течение 15 дней проводилось 10 сеансов ТЭС-терапии).
Состояние системы АОЗ крови наблюдаемых пациентов оценивали по активности антиоксидантных ферментов в эритроцитарной взвеси: каталазы (КАТ), супероксиддисмутазы (СОД), по основному неферментному эндогенному компоненту АОС организма - по уровню восстановленных тиоловых групп эритроцитов, а также по общей антиокислительной емкости плазмы крови - суммарному количеству восстановительных эквивалентов (АОА).
Состояние прооксидантной системы оценивали по исходному количеству продуктов окислительной модификации биомолекул в плазме крови. Интенсивность процессов перекисного окисления биомолекул и общий пул продуктов СРО, также оценивали с помощью биофизического хемилюминесцентного (ХЛ) анализа. Так как многие исследуемые показатели крови зависят от количества эритроцитов, этот показатель в работе также учитывался при анализе данных. Метод оценки общей АОА плазмы крови основан на ее способности при окислении на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале изменять силу электрического тока, регистрируемую при помощи аппарата Яуза-ААА-01. Полученный сигнал необходимо сравнивать с сигналом стандарта, измеренного в тех же условиях. Использовалась стандартная методика [А.Я.Яшин и соавт., 2003] в модификации [А.А.Басов и соавт., 2007]. Добавляли к 1 мл плазмы крови 0,1 мл 28% раствора ТХУК. Полученные образцы центрифугировали 20 мин. при 3000 оборотов в минуту. Вносили в пробирку 5 мл элюента и 50 мкл подготовленной плазмы (1:100). Подготавливали прибор Яуза-ААА-01 к работе с установкой следующих параметров: потенциал +1,3 В; элюент 2,2 мМ раствор Н3РО4; скорость подачи элюента 1,2 см3/мин. Оценивали АОА на Яуза-ААА-01 путем 5 последовательных измерений сигналов и определения среднего арифметического значения из 5 измерений при среднем квадратичном отклонении не более 5%. Затем рассчитывали относительную площадь электрического тока окисления субстрата. Результаты выражали в нАс.Интенсивность процессов СРО плазмы крови оценивали по показателям индуцированной быстрой вспышки хемилюминесценции (БВХЛ) и площади затухания вспышки хемилюминесценции (ПВХЛ) с помощью люминотестера LT-01, на основе методики НИИБ г. Ростов-на-Дону.
Ход определения: в кювету внести 2,9 мл 50 мкМ раствора люминола в 0,1 М трис-HCl буфере (рН = 6,8), затем добавить 100 мкл исследуемой плазмы крови. Термостатировать кювету с реакционной системой 500 секунд на водяной бане (ot = 37 oC). После этого кювета помещается в люминотестер (LT-01) и реакции радикального окисления люминола запускаются впрыскиванием с помощью шприца-дозатора через инжектор 0,5 мл 3% Н202. Интенсивность БВХЛ регистрируется в у.е. ХЛ. Параллельно с помощью специальной программы [И.И.Павлюченко, С.Р.Федосов, А.А.Басов, 2006] регистрируется затухание БВХЛ и затем рассчитывается ПВХЛ за 25 секунд при частоте регистрации сигнала 50 Гц. Определение активности КАТ основано на определении скорости утилизации перекиси водорода в реакционной смеси, в которую вносится биологический материал, содержащий фермент. Об интенсивности утилизации перекиси водорода судят по скорости снижения экстинкции при длине волны 260 нм, на которой перекись водорода имеет максимум светопоглощения. Активность КАТ в гемолизате и экссудате определяли по методу [М.А.Королюк, Л.И.Иванова, И.Г.Майорова, 1988] в собственной модификации [И.И.Павлюченко и соавт., 2006]. При выполнении методики параллельно ставится контрольная (без биоматериала) и опытная (в присутствии исследуемого образца) пробы, в которых после инкубации в течение стандартного времени и остановки реакции добавлением 28% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУК) спектрофотометрически при длине волны 260 нм определяется оптическая плотность раствора, соответствующая содержанию перекиси водорода. Разность в оптической плотности контрольной и опытной проб используется для расчета активности каталазы. За единицу активности КАТ, которая выражается в единицах активности, принимается количество перекиси водорода, разложившейся под действием фермента в изучаемом образце за 1 мин при оптимальных условиях (рН = 7.4 и температуре 37 С). Расчет активности КАТ производят по разнице экстинкций в опыте и контроле и выражают в условных единицах активности (у.е.а.). Активность СОД определяли по методу [В.А.Костюк, А.И.Потапович, Ж.В.Ковалева, 1990] в модификации [И.И.Павлюченко и соавт., 2006]. В основе метода лежит способность СОД ингибировать реакцию аутоокисления кверцетина за счет блокирования образования супероксидного анион-радикала, который является одним из промежуточных продуктов реакции. Выполнение методики заключается в определении разницы экстинкций растворов опытной и контрольной проб (спектрофотометрически при длине волны 406 нм) с внесенным биологическим субстратом и без него после активации реакции аутоокисления кверцетина внесением тетраметилэтилендиамина. Степень ингибирования аутоокисления кверцетина за 15 минут определяется по разнице в оптической плотности в контрольной и опытной пробах. Активность СОД выражали в процентах ингибирования %ing.
Количество тиоловых групп гемолизата определяли с помощью реактива Эллмана [В.Н.Орехович, 1977]. Определение общих сульфгидрильных групп белков основано на способности SH-групп реагировать с 5,5 -дитиобис (2-нитробензойной) кислотой с образованием при рН=8,0 тионитрофенильного аниона. Количество образовавшегося тионитрофенильного аниона прямо пропорционально количеству свободных SH-групп белков [В.Н.Орехович, 1977]. Коэффициент молярной экстинкции тионитрофенильного аниона при 412 нм равен 11400 [J.F.Robyt et al, 1971].
Методика количественного определения продуктов окислительной модификации плазмы
Для определения базального количества продуктов окислительной модификации в плазме в работе использовалась методика В.Н.Ушкаловой [В.Н.Ушкалова и др., 1993], основанная на количественной оценке продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), в плазме обследуемого пациента при термостатировании ее на кипящей бане в течение 15 минут, выражаемых как тиобарбитуровое число (ТБЧ). 1) ТБЧпл. о = 1плазмыо (450 + 532) ОЕ, где ТБЧпл. о - ТБЧ плазмы опытной пробы. I плазмы - оптическая плотность опыта, измеренная при длине волны 450 и 532 нм (где длина волны 450 нм соответствует максимуму оптической плотности промежуточных продуктов перекисного окисления - диеновые конъюгаты и др., а длина волны 532 нм - максимуму оптической плотности конечных продуктов перекисного окисления - малоновый диальдегид и др.); 2) ТБЧпл. к = Iплазмык (450 + 532) ОЕ, где ТБЧпл. к - ТБЧ плазмы контрольной пробы. I плазмы - оптическая плотность контроля, измеренная при длине волны 450 и 532 нм; 3) ТБЧпл. = (ТБЧпл. о + ТБЧпл. к) / 2. Результаты выражались в виде ТБЧ пл. в ОЕ. Концентрация ИЛ-8 определялась в плазме крови методом ИФА наборами “Вектор Бест” (Россия). Метод определения основан на твердофазном “сэндвич” - варианте иммуноферментного анализа.
Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к ИЛ-8, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгат-поликлональных антител к ИЛ-8 с биотином и калибровочные образцы, содержащие ИЛ-8. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах ИЛ-8 связывался с иммобилизированными антителами. Связавшийся ИЛ-8 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к ИЛ-8 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена 70 тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце ИЛ-8.
Концентрация ИЛ-10 определялась в плазме крови методом ИФА наборами “Вектор Бест” (Россия). Метод определения основан на твердофазном “сэндвич” - варианте иммуноферментного анализа. Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к ИЛ-10, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, конъюгат-поликлональных антител к ИЛ-10 с биотином и калибровочные образцы, содержащие ИЛ-10. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющийся в образцах ИЛ-10 связывался с иммобилизированными антителами. Связавшийся ИЛ-10 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к ИЛ-10 человека с биотином). На третьей стадии связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена -тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна количеству содержащегося в образце ИЛ-10.
Концентрация ФНО-альфа также определялась в плазме крови методом ИФА наборами “Вектор Бест” (Россия). На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали в лунках с иммобилизированными антителами. Имеющийся в образцах ФНО-альфа связывался с иммобилизованными антителами. Связавшийся ФНО-альфа взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №1 (антитела к ФНО-альфа человека с биотином). Связавшийся конъюгат №1 взаимодействовал при инкубации с конъюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). Количество связавшегося конъюгата №2 определяли цветной реакцией с использованием пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена -тетраметилбензидина. Интенсивность желтого окрашивания пропорциональна концентрации содержащегося в образце ФНО-альфа.
2.2.10. Определение уровня ТТГ в плазме крови.
Метод определения основан на одностадийном твердофазном иммуноферментном анализе с применением двух типов моноклональных антител к антигену ТТГ. В лунках планшета при добавлении исследуемого образца и конъюгата во время инкубации происходит связывание сывороточного антигена ТТГ с моноклональными антителами к антигену ТТГ, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок и моноклональными антителами к ТТГ, конъюгированными с пероксидазой. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окрашивания пропорциональна концентрации ТТГ в анализируемых образцах. После измерения величины оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация ТТГ в анализируемых образцах.
Кроме традиционной терапии в составе комплексного лечения 30 пациентам дополнительно проводили ТЭС-терапию импульсным электростимулятором “ТРАНСАИР-03” (ООО “Центр транскраниальной электростимуляции”, г. Санкт-Петербург) в анальгетическом режиме. Особенностью электрического воздействия, проводимого с помощью аппаратов “ТРАНСАИР-03”, является стимуляция специальными прямоугольными импульсами тока фиксированной частоты и длительности. Строго фиксировано наложение электродов на голове - отрицательный электрод располагается всегда в области лба, положительный - на коже за ушами. Под электроды применяли прокладки из 16 слоев белой фланели, смоченные водопроводной водой. Сеансы проводили в режиме биполярного импульсного тока ежедневно в течение 10 дней, силу тока подбирали индивидуально (от 1 до 2 мА, в среднем 1,6 мА). Постоянными оставались частота (77 Гц) и длительность прямоугольных импульсов (3,5-4 мс). Длительность первого сеанса во всех случаях составляла 15 минут, всех последующих - 40 минут. Достаточной считалась величина тока, при которой под электродами пациент отмечал появление ощущения легкого покалывания, слабой вибрации. В процессе процедуры следили, чтобы эти ощущения не проходили, но не были чрезмерно интенсивными. Появление чувства жжения под лобным электродом требует уменьшения силы суммарного тока до исчезновения этого ощущения. Противопоказаниями к проведению ТЭС-терапии являются судорожные состояния, эпилепсия, заболевания и травмы ЦНС и их последствия, гипертонический криз, тиреотоксикоз, мерцательная аритмия, наличие имплантированного кардиостимулятрора. Применялась ТЭС-терапия пациентам с гипотиреозом в комплексном лечении с традиционной терапией.
