Введение к работе
Актуальность темы. Исследование механизмов криорезистент-:ти и криоповреждений, поиск оптимальных условий криозащиты различных уровнях структурной организации биологических =ектов является актуальной задачей современной криобиологии, отцей теоретическое и прикладное значение (В.И.Грищенко, 35).
Анализ многочисленных экспериментальных исследований здетельствует о том, что криоповреждение биологических мем-ш сводится в основном к нарушению взаимодействия между глав-ш структурообразующими элементами мембран - белками и ли-;ами (А.М.Белоус, В.А.Бондаренко, 1982). В то время как тер-щдуцированным структурным перестройкам липидного компонен-мембран посвящено множество работ, влияние низких темпера-) и криопротекторов на изменение структурно-функционального :тояния мембранных, в особенности, интегральных белков, ма-изучено. Сложность структурной организации природных мемб-і и, как следствие этого, неоднозначность интерпретации по-іаешх результатов, позволяющие лишь косвенно оценить роль гегральных белков в реакции биомембран на действие замора-зания-отогрева и криопротекторов, диктует необходимость про-;ения исследований на модельных системах. В качестве такой :темы нами были выбраны протеолипосомы, образованные фосфо-іидами и интегральным микросомальным белком цитохромом Р-450 ! (КФ І.І4.І4.І).
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изуче-і влияния замораживания-отогрева и низкомолекулярных крио-)текторов на структурно-функциональное состояние изолированно и встроенного в искусственные мембраны цитохрома Р-450, гакже на структурное состояние искусственных фосфолипидных ібран," содержащих цитохром Р-450.
В задачи работы входило:
изучение влияния замораживания-отогрева на структурно-шциональное состояние изолированного цитохрома Р-450;
изучение влияния замораживания-отогрева, а также глицери-(ГЛ), I,2-пропандиола (ПД) и диметилсульфоксида (ДИСО) на
эуктурно-функциональное состояние цитохрома Р-450 в составе
искусственных мембран из яичного фосфатидилхолина (ФХ) и ег смеси с фосфатидилсерином (ФХ+$С);
- изучение влияния замораживания-отогрева, солей и криоп текторов на структуру липидных бислоев, модифицированных ци хромом Р-450.
Научная новизна. Впервые установлено, что замораживали отогрев цитохрома Р-450 в растворе, содержащем глицерин,и в ставе ФХ-липосом приводит к конформационным перестройкам бе ка, выражающимся в повышении полярности окружения его гемов1 группы и снижении . структурной жесткости белковой глобулы. ] этом наблюдается также снижение каталитической активности фі мента. Показано, что действие замораживания-отогрева на стр; турно-функциональное состояние мембраносвязанного цитохрома Р-450 зависит от состава среды инкубации и липидного окруже] белка. Наибольшую ферментативную активность цитохром Р-450 проявляет после замораживания-отогрева в условиях высокой и< ной силы в липосомах, содержащих ФС. Обнаружено, что присутствие в бислое цитохрома Р-450 приводит к модификации взаим< действия искусственных мембран с низкомолекулярными криопро^ торами, которая выражается в увеличении площади поверхности объема неполярной области мембран. Наблюдаемые эффекты усугч ляются при замораживании-отогреве протеолипосом в средах, ее держащих исследованные криопротекторы.
Практическая ценность работы. Полученные зксперименталі ные данные найдут применение в разработке общей теории крио; щиты биологических объектов, в создании эффективных методов криопротекции биологических мембран и цитохрома Р-450, а таї в обосновании научных подходов к выбору основных компонент криозащитных сред.
Апробация работы. Основные положения и материалы диссеї тационной работы докладывались на конференциях молодых учень Института проблем криобиологии и криомедицины АН Украины (Хе ков, 1989,1991), УІ Всесоюзной конференции "Органические л минофоры и их применение в народном хозяйстве" (Харьков, I9S УП Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Хар ков, 1991), ІУ Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992), П Междунаро,п ной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков,
Э92).
Публикации.По материалам диссертации опубликовано II ра-
)Т.
Структура и объем диссертации. Выполненные исследования зляются частью плановых научных работ Института проблем крио-юлогии и криомедицины АН Украины по теме: "Исследование влия-ія температуры на структурное состояние изолированных и мемб-шосвязанных белков, в том числе в составе цитозоля и цито-селета, на физико-химические процессы в среде инкубирования на метаболизм в клетках с целью изучения криорезистентности [еточных структур" (шифр 2.2.6.9).
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, опи-іния материалов и методов исследования, трех глав собствен-IX экспериментальных исследований, заключения, еыводов и шска цитируемой литературы, включающего 3/5 источников, юсертация изложена на /00 страницах машинописного текста, держит 2с рисунков и 1? таблиц.
